Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Anastasis (Grieks voor "oplopend tot leven") verwijst naar het herstel van stervende cellen. Voordat deze cellen terug te krijgen, hebben ze gepasseerd belangrijke checkpoints van apoptose, waaronder mitochondriale fragmentatie, release van mitochondriale cytochroom c in het cytosol, de activering van caspases, chromatinecondensatie, DNA-schade, kernfragmentatie, plasmamembraan blebbing, celinkrimping, blootstelling celoppervlak fosfatidylserine en vorming van apoptotische lichamen. Anastasis kan optreden wanneer apoptotische stimuli voor het overlijden worden verwijderd, waardoor stervende cellen apoptose en mogelijk andere dood mechanismen te keren. Daarom lijkt Anastasis om fysiologische genezingsprocessen dat ook zou kunnen ondersteunen beschadigde cellen op ongepaste wijze te betrekken. De functies en mechanismen van Anastasis zijn nog onduidelijk, gehinderd gedeeltelijk door de beperkte hulpmiddelen voor het opsporen van gebeurtenissen uit het verleden na het herstel van de ogenschijnlijk gezonde cellen. Strategieën om Anasta detecterensis zal onderzoeken van de fysiologische mechanismen, de gevaren van ondoden cellen bij de ziekte van pathologie, en mogelijke therapieën mogelijk te Anastasis moduleren. We beschrijven hier effectieve strategieën met levende cel microscopie en zoogdieren caspase biosensor voor het identificeren en volgen anastasis in zoogdiercellen.
Inleiding
Apoptose (Grieks voor "vallen tot de dood") wordt over het algemeen aangenomen dat het een one-way proces eindigt in cel zelfmoord 1-7 zijn. Genetische verstoring van pro-dood-genen resulteert in de overleving van extra cellen die anders zouden sterven in gehele dieren, waaronder cellen die reeds de apoptose pathway 8,9 hebben geopend. Ook genetische manipulaties laat gezonde cellen van zoogdieren die op kunstmatige wijze weer te geven "eet me" signalen of die hechting verliezen hun extracellulaire matrix tot de dood door hele cellen fagocytose of entosis respectievelijk 10,11 ontsnappen. Echter, wij en anderen hebben aangetoond dat z....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Cellen voor live cell imaging
- Om het opsporen van morfologische veranderingen te vergemakkelijken, kies hechtende cellen zoals HeLa (humaan cervixcarcinoom) cellen die plat op het substraat wijziging van het plasmamembraan en intracellulaire organellen beter visualiseren.
Opmerking: Omkering van apoptose waargenomen in verschillende zoogdiercellen 12,13, primaire muizenlever elementen, muis macrofagen, primaire cardiomyocyten van de rat, en ook lijnen zoals humane embryonale nier HEK-293T-cellen, Afrikaanse groene aap renale epitheelcellen COS cel -7-cellen, muis hartspier HL-1-cellen, NIH 3T3 fibroblasten, fret
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de omkering van apoptose bestuderen, worden weefselcultuurcellen eerst blootgesteld aan een dood stimulans voor apoptose in gang. Wanneer de cellen vertonen kenmerken van apoptose, wordt vers kweekmedium vervolgens op wegspoelen van de stimulus en incubeer de stervende cellen te herstellen (figuur 1A) mogelijk. Hier, de hamvraag wordt aangepakt, is hoe ver de individuele stervende gekweekte cellen kan evolueren in de richting van apoptose ondergaan Anastasis nog steeds. Deze vraag kan definitief word.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Anastasis verwijst naar het verschijnsel waarbij cellen die celdood route geactiveerd vervolgens omgekeerde stervensproces en overleven. Hier hebben we aangetoond dat live cell imaging kan worden gebruikt om te bevestigen dat het dezelfde individuele cellen in feite apoptotische celdood proces om te keren in een laat stadium, en dan verder overleven en reproduceren. De protocollen worden enkele geoptimaliseerde celtypespecifieke behandelingsomstandigheden apoptose induceren en maken een groot deel van de cellen aan de o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann en Rev. Dr. James Voelz voor het suggereren van het woord "Anastasis" om omkering van apoptose te beschrijven; Douglas R. Groen voor HeLa-cellen die op stabiele wijze cytochroom c-GFP; Charles M. Rudin en Eric E. Gardner voor H446 cellen; Heather Lam voor hulp in cartoon tekening op de video; Yee Hui Yeo voor waardevolle bespreking van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), de Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright beurs 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fellowship (HLT), NIH verleent NS037402 (JMH) en NS083373 (JMH), en Universitaire Com....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | ||
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
Referenties
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
