Protocol
Procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen N ° 071140-000821-12 en 08052010 van de Ere-Commissie voor Dierproeven en de richtlijn Raad van de School of Medicine, Universidad de la República goedgekeurd - Uruguay.
1 sublinguale toediening van het therapeutische middel
- Bereid de oplossing die het therapeutische middel te testen. Stel concentratie een maximum volume van 10 pi per muis beheren.
OPMERKING: Voor gezuiverd flagelline van Salmonella enterica serovar Typhimurium de optimale dosis om bescherming in muizen die besmet zijn met het eerste dodelijke dosis van S. induceren pneumoniae serotype 1 E1586, 100% sterfte veroorzaakt is 10 ug / muis. Flagelline oplossing moet bij 65 ° C gedurende 5 minuten verhit om afgifte van de monomeren te verzekeren. Voor meer informatie over flagelline zuivering zie referentie 26.- Vary effectieve concentratie van verschillende immunomodulerende middelen volgens de molecuulgrootte, zuiverheid, gevoeligheid voor proteolyse en het gebruik van mucoadhesieve middelen. Pas optimale concentratie voor elke verbinding te testen om de effecten te maximaliseren. Als eerdere studies door intranasale route zijn uitgevoerd voor een bepaalde verbinding, in een startdosering 5 tot 10 keer hoger zijn werkzaamheid testen door sublinguale route.
- Verdoven de muizen door het injecteren van een cocktail bevattende 110 mg / kg ketamine met 5,5 mg / kg Xylacine en laat de dieren rusten gedurende 7 tot 10 minuten.
- Bevestig de juiste verdoving door zachtjes te drukken op de voetzool van een van de achterpoten; indien goed verdoven het dier beweegt niet in reactie op de stimulus.
- Een dun laagje vet zalf over de ogen van elke muis tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
OPMERKING: inademing anesthetica zoals isofluorane kan ook worden gebruikt in plaats Ketamine / Xylacine als een systeem rustenped met inductie kamer en neus kegels beschikbaar. Gebruik de inductie kamer om de dieren te verdoven en beheren de immunostimulant door sublinguale route. Onmiddellijk verbinding het dier een neuskegel ten minste 15 minuten om het onder narcose houden inslikken voorkomen en laat absorptie van de therapeutische verbinding. - Pipet de oplossing die de immunostimulant of het voertuig oplossing; met behulp van de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand nemen de muis en houd hem in verticale positie.
- Met behulp van de dominante hand plaats een paar gesloten tang onder de tong en houd deze op zijn plaats met behulp van het midden-en ringvinger, opent de tang iets naar de tong te tillen.
- Neem de pipet en dien de oplossing op de bodem van de mond en dorsale zijde van de tong.
- Verwijder de forceps en laat de muis rusten gedurende 3 tot 5 minuten alvorens deze weer in de kooi. Om ervoor te zorgen dat normothermie wordt gehandhaafd in de verdoofde mice Sluit de kooien om een kooi verwarmingssysteem. Indien dergelijk systeem niet beschikbaar, plaats muizen van dezelfde behandelingsgroep terug in het overeenkomstige kooi een naast elkaar over het beddengoed en deze gedeeltelijk bedekken met schone tissue papiervellen wanneer hiermee de lichaamstemperatuur.
- Verzamel weefselmonsters op elk tijdstip na de toediening van de immunomodulerende middel van veranderingen in de celpopulaties geïnduceerd door de behandeling analyseren.
OPMERKING: In dit specifieke protocol toediening van flagelline werd uitgevoerd 2 uur voor uitdaging. Bepaal optimale tijd tussen behandeling en uitdaging voor elke afzonderlijke therapeutische middel en pathogeen te testen.
2 Voorbereiding van de bacteriële suspensie en Intranasale Challenge met Streptococcus pneumoniae
OPMERKING: S. pneumoniae is een natuurlijke menselijke pathogeen dat levensbedreigende ziekten zoals invasieve pneumonie, sepsis kunnen veroorzakenen meningitis. Transmission optreden bij inademing of contact met slijmvliezen. Daarom, alle monsters die in contact kunnen zijn geweest met S. pneumoniae moet met een hiertoe Biosecurity Level II-faciliteit met een klasse II bioveiligheid kast worden behandeld. Controleer de Standard Operating Procedures van uw instelling met betrekking tot de behandeling van type II pathogenen voor beschermende kleding, afvalverwerking en aanvullende beveiligingsmaatregelen die van toepassing kunnen zijn. Besmette dieren moeten worden gehouden in individueel geventileerde kooien in isolatoren voorzien van HEPA-filters. Anti-pneumokokken vaccins en antibiotica behandeling zijn beschikbaar. Voor meer informatie zie de referenties 27 en 1.
- Ontdooi een hoeveelheid van een werkvoorraad suspensie van Streptococcus pneumoniae van bekende bacteriële CFU aantal bereid zoals beschreven in 15.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2500 xg en RT.
- Verwijder het supernatant en was de bacteriële pellet door schorsing van het in 1 ml van sterile zoutoplossing. Gebruik filter tips bij het opstellen van bacteriële suspensie, verdunningen of voor dierlijke uitdaging.
- Centrifugeer opnieuw zoals beschreven in stap 2.2.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid steriele zoutoplossing aan een suspensie van 4x10 5 CFU / 50 pl te verkrijgen. Deze dosis komt overeen met de minimum bacteriële dosis S. pneumoniae serotype 1 E1586 die 100% mortaliteit veroorzaakt BALB / c muizen volgens eerdere studies 15.
OPMERKING: Bij de vaststelling van een model van pneumokokkenpneumonie bij muizen, de minimale bacteriële dosis die 100% van de sterfte moet worden bepaald voor elke specifieke combinatie van bacteriële stam, serotype en muis stam. - Homogeniseren van de bacteriële suspensie door vortexen of en neer te pipetteren 5 keer.
- Plaats 50 gl bacteriesuspensie met een steriele filter tip en wekt de totale hoeveelheid in de neusgaten van een verdoofde muis. Houd de muis Upright gedurende 2 minuten en laat het rusten in dorsale positie voor 2 minuten. Solliciteer dierenarts zalf op de ogen en de terugkeer van de dieren naar de kooi; zorg ervoor om normothermie handhaven, terwijl onder narcose.
Opmerking: In dit onderzoek bacteriële uitdaging werd uitgevoerd in een volume van 50 ul levering van ten minste 90% van het totale CFU waarborgen in de longen zoals eerder bepaald 15,28. Om nood van het dier kleinere volumes (bijvoorbeeld 20 pi) worden gebruikt minimaliseren. Echter, moet efficiënte levering van bacteriën in de longen worden gecontroleerd; Dit kan door het oogsten van de longen 5 min na prikkeling en tellen CFU in homogenaten longen door uitplating seriële verdunningen op bloed-agarplaten. - Bevestig de CFU nummers in de bacteriële suspensie gebruikt voor infectie door plating seriële 10-voudige verdunningen op bloed agar platen. Incubeer O / N bij 37 ° C met 5% CO2 en tel het aantal mucoïde kolonies die een groene halogeen kenmerk van alpha hemolytische bacteriën.
3 Tissue Collection en Monstervoorbereiding voor flowcytometrie (FACS) Analyse
3.1) weefselverzameltoestel
- Euthanaseren het dier door cervicale dislocatie of met een CO 2 kamer; Open de borstholte helemaal tot aan de nek en een insnijding langs de voorpoten op de ventrale zijde van de hals en submandibulaire gebied bloot.
- Met de fijne punt gebogen pincet voorzichtig omhoog te trekken van de speekselklieren en de aangrenzende weke delen aan de dorsale zijde van de mond vloer bloot. Met behulp van gebogen dunne tip pincet, neem de onderkaak en accessoire mandibulaire lymfknopen door zachtjes te trekken en leg ze in een buisje met volledige RPMI (cRPMI, voor 500 ml- 10% Foetaal Bovine Serum, 5 ml van een oplossing die 10.000 E / ml penicilline en 10 mg / ml streptomycine-oplossing en 5 ml L-glutamine 200 mM) of nucleïnezuur conserverende oplossing volgens de stroomafwaartse procedure zallater worden uitgevoerd.
- Openen van de borstholte een insnijding in het membraan; met behulp van een paar van de rat-getande tang klem de xyphoid kraakbeen van het borstbeen en knip de ribben aan beide dorsale zijden vanaf de valse ribben helemaal naar boven tot aan het punt waar de ware ribben aan de manubrium van het borstbeen.
- Door het vasthouden van de xyphoid kraakbeen van het borstbeen met de tang, trek zachtjes aan de organen van de borstholte bloot.
- Verwijder de ribben volledig door het snijden van de eerste ribben en het sleutelbeen. De thymus verschijnt als een witte structuur twee lobben in de anteroventral gedeelte van de thorax nabij de basis van het hart.
- Neem een van de lobben door klemmen met een pincet en gebruik een schaar de ligamenten tussen de inferieure gezicht en het pericardium verwijderen. Overgaan tot de tweede kwab verwijderen.
- Identificeer de buikholte en open deze door te snijden langs de middenas van de muscular muur naar de organen bloot. Met een pincet knippen de achterste holle ader en thoracale aorta; Verwijder het teveel aan bloed met een absorberende tissue.
- Analyseren van de bewoner en infiltreren cel populaties van de longblaasjes voeren bronchoalveolaire lavage (BAL). Snijd de spieren in het ventrale deel van de nek naar de luchtpijp en de slokdarm brengen; om ze te scheiden maken incisies bij laterale en dorsale zijden van de structuren.
- Til de luchtpijp met de tang en een kleine incisie met een scalpel een dunne-tip pipet wordt gevuld met 1 ml PBS voeren zonder Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA. Bijbrengen en zuig het totale volume ten minste drie keer; aspireren en breng de celsuspensie in een steriele 1,5 ml tube en plaats het op het ijs.
- De celpopulaties aanwezig in longparenchym analyseren eerst de longen perfuseren door het injecteren van 5 ml van PBS zonder Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA in het rechterventrikelvan het hart.
OPMERKING: Dit zal het grootste deel van de rode bloedcellen en het immuunsysteem cellen aanwezig in de bloedvaten van de longen 'te elimineren. Als perfusie correct werd uitgevoerd, zal longen kleurverschuiving van roze naar wit. - Isoleer het hart van de longen door klemming van de basis van de linkerventrikel en subtiel de bloedvaten met een schaar gesneden om deze volledig te verwijderen. Neem geperfundeerde longen en plaats ze in cRPMI of nucleïnezuur stoffen zijn toegevoegd, afhankelijk van de stroomafwaartse analyse uit te voeren.
- Voor de analyse van de celpopulaties in de sublinguale mucosa, isoleren de kop van het dier en verwijder de speekselklieren en aangrenzende zachte weefsels als deze niet is gebeurd in stap 3.2.1.
- Maak een insnijding aan beide zijden van de mond tot aan de onderkaak gewricht en scheiden de onderste kaak tezamen met de tong en de bodem van de mond, gebruikt kunnen repareren aan de dissectie bord. Trek de tong; met behulp van een scalpel een incisie te maken waar de base van de tong aan de vloer van de mond tot aan de derde molaren de sublinguale mucosa bloot.
- Volledig verwijderen van de tong; neem een 0,5 mm biopsie punch en leg deze naast de onderste snijtanden. Snijd uit het tandvlees inbrengen van de sublinguale weefsel en druk zachtjes tot de vloer van de mond is volledig uitgesneden.
- Herhaal nog een tijd plaatsen van de biopsie punch dichtbij de derde molaren verwijdering van de sublinguale weefsel voltooien. Plaats op een schone buis met cRPMI of nucleïnezuur conserveermiddel.
3.2) Voorbereiding van het monster voor FACS analyse.
- Breng weefsel longen geïsoleerd uit elke muis in een 24-well plaat en gehakt met een schone schaar verkrijgen tot kleine stukjes weefsel van ongeveer 2 mm. Voeg 1 ml per putje van digestie medium bevattende 30 mg collagenase type II, 50 ug DNAse-I in 1 ml RPMI zonder FBS. Pipet op en neer vijf keer en incubeer bij37 ° C en 5% CO2 gedurende 40 minuten.
- Voor de analyse van celpopulaties in de sublinguale weefsel wordt vervangen digestiemedium 3.2.1 met een met 2 eenheden van Dispase, 30 mg collagenase type II, 50 ug DNAse-I in 1 ml RPMI. Incubeer de verzamelde ve muis in 500 ul digestiemedium voor 20 min weefsel bij 37 ° C in een orbitale schudder bij 50 rpm.
- Na incubatie pipet op en neer tot 10 keer of 30 seconden tot het meeste weefsel is verstoord. Filter de celsuspensie hoewel een 40 urn steriele cel zeef en was met 5 ml PBS aangevuld met 5 mM EDTA.
OPMERKING: Volledige ontsluiting van de extracellulaire matrix en vezelig weefsel zal niet worden gehaald. Echter, langere incubatietijd keer in aanwezigheid van collagenase en / of dispase of agressieve fijnwrijving afgeraden, omdat het zal leiden tot een verhoogde celdood en vernietiging van extracellulaire eiwitten die het totale resultaat van de FACS analyse. - Centrifugeer bij 400 xg, 5 min, 4 ° C.
- Voor de analyse van de celpopulaties in BAL, centrifugeer de cellen bij 400 xg, 5 min bij 4 ° C en doorgaan met stap 3.2.4.
- Voor de analyse van celpopulaties in de lymfeklieren, plaats een 70 um cel zeef op een steriele petrischaal gebracht en de lymfeklieren met 1 ml van cRPMI in de zeef. Neem een duik van een 2 ml steriele spuit en gebruik het als een stamper naar de lymfeklieren tegen gaas de zeef's verpletteren. Spoel de cel zeef met 1 ml verse cRPMI en breng de cellen van de petrischaal in een steriele buis.
- Een representatief monster van elk monster en vlekken met trypaanblauw aan aantal levensvatbare cellen te bepalen.
- Resuspendeer de cellen in FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% Bovine Serum Albumin- om een suspensie van 2x10 7 cellen / ml en voeg 50 ul aan een cytometer buis.
- Bereid een 2X antilichaam mix bevat de ca.opriate combinaties van antilichamen tegen oppervlaktemerkers en fluorochromen volgens de beschikbare FACS instrument. Voeg 50 ul van 2X antilichaam mengsel in elke buis met de celsuspensie.
OPMERKING: Titreer elk fluorochroom gemerkte antilichaam de optimale hoeveelheid moeten worden vastgesteld voor een gedetailleerd protocol zie referentie 29. - Incubeer 30 min op ijs in het donker.
- Was eenmaal met 3 ml van FACS-EDTA en spin down de cellen door centrifugeren bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C, resuspendeer de cellen in 200 ul van dezelfde buffer en geanalyseerd op een flow cytometer.
OPMERKING: Bij de behandeling van een groot aantal monsters kan de kleuring protocol voor FACS-analyse beschreven in U-bodem 96-well platen in plaats van cytometer buizen worden uitgevoerd. Indien gebruikt stappen platen wassen 96 putjes worden uitgevoerd door het toevoegen tot 200 ui FACS-EDTA en herhalen 4 keer stoppen met draaien de cellen bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C tussen elk washing stap. - Op dit punt, bevestig de monsters voor analyse in de flowcytometer later (tot 72 uur na bevestiging).
- Om de cellen te repareren na labeling met de FACS-antilichamen was de cellen in PBS zonder Ca2 + / Mg2 +, 1 mM EDTA zonder FBS. Suspendeer de cellen in 50 ul van dezelfde buffer en voeg 50 ul van een vers bereide 4% paraformaldehyde oplossing hypertoon (2X) PBS zonder Ca2 + / Mg2 +.
- Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur en was 3 maal in FACS-EDTA.
- Resuspendeer de cellen in 200 ui FACS-EDTA en bewaar bij 4 ° C en beschermd tegen licht gedurende maximaal 72 uur.
OPMERKING: FSC-SSC kan worden beïnvloed door fixatie. Indien de vaststelling van de monsters de compatibiliteit van fluorescent gelabelde antilichamen met de fabrikant sinds tandem kleurstoffen kunnen worden afgebroken in aanwezigheid van fixatief agenten. Als monsters afkomstig van besmette dieren fixatie wordt sterk aanbevolen om ervoor te zorgen dat er geen levensvatbare ziekteverwekkers aanwezig zal zijn bij het analyzingen de monsters in de FACS machine sinds microaerosols tijdens acquisitie van het monster kan worden gegenereerd.
4 Totaal RNA-extractie, cDNA Synthesis en Real Time PCR.
4.1) RNA-extractie en cDNA synthese.
- Homogeniseer het weefsel in het nucleïnezuur conserverende oplossing van keuze door mechanische verbreking (bijvoorbeeld met behulp van een rotor-stator homogenisator, snelle schudden weefsel-ruptor en kralen, etc.). Centrifugeer bij 12.600 xg gedurende 15 min en 4 ° C om het weefsel vuil te verwijderen. Breng de supernatant een schone buis.
- Extraheer het RNA met de methode van keuze volgende instructies van de fabrikant.
OPMERKING: RNA is zeer gevoelig voor degradatie, indien niet gaat meteen na isolatie worden gebruikt, maken aliquots en opslaan in RNAse vrij buizen bij -80 ° C. Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien. De buizen moeten met handschoenen te allen tijde worden behandeld. Na ontdooien van de monsters eenltijd bewaar ze op ijs. - Meet de absorptie van nucleïnezuren bij 260 nm en bereken de concentratie in ug / ul.
- Bereid DNAse-I meng door toevoeging van (voor 1 monster): 7.6 gl ultrazuiver water, 1 ui 10X DNAse I-buffer, 0,4 pl DNAse-I (amplificatie graad) stock 1 U / pl, en voeg 8,4 pl de DNAse-I mixen om elk monster met 1 ug totaal RNA.
- Gebruik RNA bij een concentratie van 1 ug / ul en voer de retrotranscription reactie (RT-PCR) door toevoeging van 1 pi van het totale RNA als matrijs. Als de monsters te verdunde en de concentratie lager dan verwacht, voeg grotere hoeveelheden totaal RNA in plaats van water. Niet meer dan 20% van de uiteindelijke reactie volume bij het toevoegen van het RNA speciaal als de RNA-extractie protocol van keuze betrokken fenolchloroform mengsel sinds fenol sporen kunnen invloed hebben op de opbrengst van de RT-PCR.
- Incubeer 15 min bij kamertemperatuur gevolgd door 10 min bij 4 ° C of ice. (Overschrijd de incubatietijd !!)
- Voeg 1 pl 25 mM EDTA (moleculaire biologie rang) aan elke buis en incubeer bij 65 ° C gedurende 10 min inactivatie van het DNAse-I.
- Bereid retrotranscription (RT) mix als volgt (1 reactie): 1 pl willekeurige hexameerprimers voorraad 0,2 mg / ml, 1 ui dNTP voorraad 10 mM, 4 ui 5X M-MLV-RT buffer, 2 ui 0,1 M DTT, 1 ui RNAse OUT voorraad 40 U / ul, en 1 pi M-MLV retrotranscriptase voorraad 200 U / ul.
- Voeg 10 ul van RT-PCR mixen om de 10 ul DNAse I-reactiebuis.
- Voer de PCR-reactie in een thermische cycler volgens het volgende programma:
1X cyclus: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C - Verdun het cDNA 1: 5 door toevoeging van 80 ul van ultrazuiver water. Bewaren bij -20 ° C.
4.2) Real time PCR (qPCR).
- Bereid qPCR reactiemengsel als volgt (1 reactie): 5 pi Master Mix met Taq DNA Polymerase, SYBR Green kleurstof, PCR buffer, dNTP mix en MgCl2 (zie 4.2.2 hieronder); 0,9 pi van een 10 pM voorraadoplossing van de voorwaartse primer, 0,9 pl van een 10 uM voorraadoplossing van de reverse primer, 1,2 pl ultrazuiver water, en 2 ui cDNA template eerder verdund zoals aangegeven in stap 4.1.10.
OPMERKING: reagens concentratie en fietsen protocollen die worden gebruikt in deze sectie werden geoptimaliseerd om specifiek met de reagentia en instrumenten in "Tabel van materialen en reagentia" beschreven worden uitgevoerd, andere merken kunnen worden gebruikt, maar de reactie volumes, kan reagens concentratie en fietsen protocol afwijken. Controleer uw instructies van de fabrikant voor het uitvoeren van RT-qPCR. - Het opzetten van de qPCR instrument als volgt:
1X cyclus: 15 min, 95 ° C
40X cycli: 15 sec, 95 ° C gevolgd door 1 min, 60 ° C (op dit punt acquire fluorescentie).
OPMERKING: Voor de relatieve kwantificatie van mRNA volgens de Ct-methode 30 een reference gen worden geselecteerd voor normalisatie van de Ct waarden. Referentie gen keuzemogelijkheid onder specifieke testcondities getest als expressie kan variëren, ACTB, GAPDH en 18S zijn enkele van de genen gewoonlijk geselecteerd gevonden. - Stel de drempelwaarde en de gegevens te analyseren.
Representative Results
Sublinguale immunotherapie succes kan worden gebruikt immuunrespons longen moduleren. We toonden aan dat een enkele dosis van flagelline, de TLR5 en NLRC4 agonist kunnen aanzienlijke opwaartse regulatie van het mRNA dat codeert voor het induceren chemokines CXCL1, CCL20 en het cytokine IL-6 vergeleken met zoutoplossing behandelde controles. Voudige inductie van mRNA niveaus piek van 8 uur na SLIT en terug naar basale niveaus na 20 uur (figuur 1). Wanneer SLIT werd toegepast 2 uur vóór intranasale infectie met S. Pneumoniae, niveaus van CXCL1 en IL6 mRNA bleef aanzienlijk opgereguleerd zelfs 24 uur na SLIT vergelijking met niet behandelde dieren (figuur 2).
Analyse van de celpopulaties in BAL en longweefsel door FACS gebleken dat dieren behandeld met FliC door sublinguale route aantal neutrofielen was toegenomen in de luchtwegen, maar niet in de longen weefsel (Figuur 3).
figuur 4, SLIT met flagelline bevorderde verhoogde overleving en bescherming tegen acute pneumokokkenpneumonie.
Figuur 1 Kinetiek van transcriptionele profiel de longen na sublinguale immunotherapie met flagelline. Acht tot 10 weken oude BALB / c muizen (n = 4) werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld door sublinguale route onder verdoving. De longen werden op verschillende tijdstippen verzameld en in nucleïnezuur conserveermiddel. Totaal RNA extractie werd uitgevoerd en cDNA werd gesynthetiseerd. mRNA niveaus werden geëvalueerd door real time PCR gebruikt in Tabl vermelde specifieke primerse 1 Relatieve kwantificatie werd uitgevoerd volgens ACt methode met ACTB mRNA niveaus voor normalisatie. Resultaten worden weergegeven als voudige toename vergeleken met zoutoplossing behandelde groep mediaan ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) berekend volgens Mann-Whitney test. De resultaten zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten.
Transcriptionele profiel Figuur 2 longen tijdens pneumococcen pneumonie na sublinguale immunotherapie met flagelline (n n = 4 voor controlegroep en = 7 voor behandelde groep). Acht tot 10 weken oude BALB / c muizen werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld met sublinguale route onder narcose. 2 uur later werden de muizen uitgedaagd door intranasale route met de minimale dodelijke dosis (MLD), waardoor 100% mortaliteit van een klinisch isolaat van S. pneumoniae serotype 1 E1585, overeenkomend met 4x10 5 CFU / 50 pl. De longen werden 24 uur na prikkeling verzameld en opgeslagen in nucleïnezuur stoffen tot RNA-extractie en cDNA-synthese werden uitgevoerd. Real time PCR werd uitgevoerd (zie primer lijst in tabel 1) en relatieve kwantificatie werd uitgevoerd volgens ACt met gebruik ACTB mRNA niveaus voor normalisatie. Resultaten worden weergegeven als voudige toename vergeleken met zoutoplossing behandelde groep mediaan ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) berekend volgens Mann-Whitney test.
Figuur 3 Analyse van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) werving in het weefsel en de luchtwegen de longen 'na SLIT. Acht tot10 weken oude BALB / c muizen (n = 4) werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld door sublinguale route onder verdoving. 2 uur later werden de muizen uitgedaagd door intranasale route met de MLD van S. pneumoniae serotype 1 E1585. 24 uur na provocatie, BAL werd uitgevoerd en de longen werden verwerkt voor FACS-analyse. PMN werden geïdentificeerd als Ly6G hoog / CD11b hoog / CD11c negatieve cellen en van de FCS-SSC profiel. Resultaten worden uitgedrukt als percentage van PMN ten opzichte van de totale celaantallen in BAL of longen. Balken geven mediaan ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) berekend volgens eenrichtingsverkeer Mann-Whitney test.
Figuur 4 SLIT met flagelline muizen beschermt tegen acute pneumokokkenpneumonie. S. pneumoniae serotype 1 E1585. Overleving werd beoordeeld op een dagelijkse basis. Kaplan-Meier curves werden met elkaar vergeleken op basis Log-rank (Mantel-Cox) test. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) .Results zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten.
| Naam | Sequentie 5'-3 ' | PCR-product lengte (bp) |
| mB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| mB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| mIL-6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| mIL-6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
Tabel 1 Primer lijst gebruikt voor real-time PCR analyse. Specifieke primer sequenties gebruikt voor qPCR analyse. Forward en reverse primers voor muis ACTB, Cccl20, CXCL1, IL6, TNFA en CXCL1 worden gepresenteerd als 5'-3'-sequenties en de verwachte duur product staat in basenparen (bp).
Discussion
Sublinguale toediening van therapeutische middelen is bewezen als een nuttig middel om de immuunreactie in de luchtwegen moduleren. Het belangrijkste voordeel van SLIT voor de behandeling van luchtwegaandoeningen is dat het niet een rechtstreekse afgifte van verbindingen in de longen of neus, die veiliger dan behandelingen gebaseerd op intranasale toediening 31.
Sublinguale immunotherapie worden gebruikt om de immuunrespons op verschillende manieren moduleren, hetzij voor inductie van regulatoire reacties die kan verlichten de symptomen van allergische ontsteking en astma 32 of tijdelijke activering van het aangeboren immuun mechanismen induceren van acute longinfecties behandelen zijn.
Het muismodel in deze video is een geschikte werkwijze voor het screenen van verschillende verbindingen als therapeutische middelen voor SLIT.
Dit diermodel een nuttig middel om de impact te bepalenvan SLIT immuunrespons de longen alsmede in andere organen (bijvoorbeeld., afvoerende lymfeknopen of distale mucosale sites) die niet kan worden nagebootst door het gebruik van in vitro modellen. Hoewel er verschillende kranten dat de resultaten verkregen met behulp van sublinguale immunotherapie beschrijven, gedetailleerde methoden voor de procedures van sublinguale toediening niet beschikbaar zijn nog niet gemaakt. Bovendien kan het model worden gebruikt voor de evaluatie van sublinguale vaccins gericht op systemische en lokale bescherming te verlenen in de luchtwegen.
Zoals getoond in de bijgaande video, sublinguale toediening van verbindingen is een eenvoudige procedure die snel kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van uitgebreide training. Doorgaans zal een persoon die bedreven zijn in de behandeling van dieren 1 uur nodig om SLIT presteren in een groep van 10 muizen met behulp van injecteerbare anesthetica zoals beschreven in dit protocol. Als pneumokokken uitdaging ook is uitgevoerd, zal 90 extra min voorbereiden moetende bacteriële suspensie en voer intranasale uitdaging van de dieren.
De FACS protocollen hier gepresenteerde bieden eenvoudig karakterisering van het effect van SLIT bij de lokale plaats van toediening, drainerende lymfeknopen en hun effecten op celdynamiek de longen.
Afzonderlijke analyse van de broncho inhoud en longparenchym is belangrijk om immuun inwoner van de luchtwegen en het infiltreren van celtypen van degenen die in het weefsel blijven discrimineren. Analyse van de BAL inhoud maakt de studie van alveolaire macrofaag omzet en de dynamiek van cellen rekrutering bij alveolaire ruimten geïnduceerd door verschillende behandelingen, bijvoorbeeld. PMN's, eosinofielen, monocyten. BAL kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van uitgescheiden cytokines en chemokines beoordelen door Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of detectie van uitgescheiden IgA antilichamen opgewekt na sublinguale vaccinatie. Studie van weefsel de longenzal karakterisatie van andere celtypes, klassieke dendritische cellen, T-cellen en B-cellen mogelijk.
Bereiding van BAL monsters en lymfeknopen, voor FACS-analyse is eenvoudig. Na monstername, worden normaal gesproken 60 minuten nodig om de kleuringsprotocol voltooien voor 10-20 monsters. Daarentegen zal isolatie van cellen van de longen of sublinguale weefsel meer tijd nodig omdat digestie van de extracellulaire matrix vereist. De absorptie van het therapeutische middel door sublinguaal toegediend worden kunnen worden aangepakt door het volgen van fluorescent of radioactief gelabelde moleculen via in vivo beeldvormende systemen.
Sublinguale immunotherapie is een aantrekkelijke manier om immuunreacties van de luchtwegen en systemisch die kan worden gebruikt voor het behandelen of voorkomen van ademhalingsaandoeningen effectief induceren. Opheldering van de mechanismen die ten grondslag activatie vs tolerantie van de immuunreactie in de luchtwegen na SLIT is cruciaal rationele ontwerp van nieuwe therapeutische strategieën die alleen of in combinatie kunnen worden gebruikt met beschikbare behandelingen tegen verschillende respiratoire toelaat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
- Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
- Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
- Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
- Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
- Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
- Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
- Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
- Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
- Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
- Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
- Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
- Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
- Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
- Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
- Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
- Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
- Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
- Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
- Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
- Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
- Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
- Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
- Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999 (2009).
- Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
- Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
- Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
- Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
- Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1 (2001).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
- Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
- Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).
