Summary
Wir beschreiben die Kombination von Brenn UV-induzierten Photoaktivierung von neuro-Wirkstoffe mit Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in Dendriten und Dornen von Neuronen im Hippocampus bei akuten Gewebeschnitten von Mausgehirn.
Abstract
Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie wurde die Analyse von morphologischen und physiologischen Parametern von Hirnzellen in das intakte Gewebe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. In Kombination mit der Elektrophysiologie, wird häufig verwendet, um aktivitätsbezogenen Calciumsignale in kleinen subzellulären Kompartimente wie Dendriten und dendritischen Dornen studieren. Neben Calcium Transienten induziert synaptische Aktivität auch postsynaptische Natriumsignale, deren Eigenschaften nur unwesentlich verstanden. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die kombinierte Ganzzell-Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Natrium-Bildgebung in der zellulären Mikrodomänen von zentralen Neuronen. Darüber hinaus führen wir eine modifizierte Verfahren für ultra-violetten (UV)-light-induzierte Uncaging von Glutamat, die eine zuverlässige und Schwer Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe ermöglicht. Zu diesem Zweck wurden Ganzzell-Aufzeichnungen auf Ammonshorn Teilung 1 (CA1) Pyramidenzellen bei akuter Gewebeschnitt der durchgeführtenMaus Hippocampus. Neuronen wurden mit Natrium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff SBFI durch die Patch-Pipette gefüllt ist, und Multi-Photonen-Anregung von SBFI aktiviert die Visualisierung von Dendriten und benachbarten Dornen. Um die UV-induzierte Brenn Uncaging zu schaffen, wurden mehrere Parameter, einschließlich der Lichtintensität, Volumen durch die UV-Strahlen Uncaging betroffen, Positionierung des Strahls sowie Konzentration der Käfigverbindung getestet und optimiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die lokale Perfusion mit geschütztem Glutamat (MNI-Glutamat) und ihre Brenn UV-Uncaging Ergebnis in Einwärtsströme und Natrium Transienten in Dendriten und Dornen. Zeitverlauf und die Amplitude der beiden Ströme nach innen und Natrium Signale korreliert mit der Dauer des Impulses Uncaging. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die intrazelluläre Natrium Signale werden in Gegenwart Blocker ionotropen Glutamat-Rezeptoren blockiert, was zeigt, dass sie von Natrium-Influx obwohl dieser Weg vermittelt. Zusammenfassend stellt unser Verfahren ein zuverlässiges Werkzeug für dieUntersuchung der intrazellulären Natrium-Signale durch fokale Rezeptor-Aktivierung in intakten Hirngewebe induziert.
Introduction
Jüngste Verbesserungen in der lichtmikroskopischen Techniken wie Multi-Photonen-Mikroskopie wurden die Untersuchung der morphologischen und physiologischen Parametern von Hirnzellen in das intakte Gewebe mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. In Kombination mit der Elektrophysiologie werden diese Techniken, die heute häufig verwendet, um leistungsbezogenen elektrischen Signale auf Neuronen sowie gleichzeitige Calciumsignale in kleinen Zellkompartimenten zu analysieren, und zwar in feinen Dendriten und Dendriten. Neben Calcium Transienten induziert synaptische Aktivität auch Natrium-Signale in Dendriten und Dornen, sind die Eigenschaften, die weitgehend unerforscht. Solche Signale können durch Zwei-Photonen-Bildgebung von intrazellulären Natrium ([Na +] i), die die Online-Messung von [Na +] i-Transienten über längere Zeiträume ohne nennenswerte Farbbleich-oder Foto-Beschädigung 1,2 können analysiert werden.
Für die Bildgebung von [Na +] i zB Corona Grün oder Grün Asante Natrium 3,4. Die am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Sonde für Na + Abbildungs Natrium-bindenden benzofuran-isophthalat (SBFI). Es ist eine ratiometrische, UV-angeregten Farbstoff ähnlich dem bekannten Calcium-sensitiven Farbstoffs Fura-2 und hat für konventionelle Na +-Bildgebung in vielen Zelltypen eingesetzt worden (zB 5,6). Es gibt verschiedene Möglichkeiten der Anregung des Farbstoffs und das Sammeln ihrer Fluoreszenz. Wenn hohe zeitliche Auflösung (dh eine hohe Abbildungsbildrate) wird in Kombination mit räumlichen Informationen benötigt, kann SBFI aufgeregt mit einer Xenon-Bogenlampe oder einer Hochleistungsleuchtdiode (LED) Gerät und seine Emission mit einem High-Speed-Ladung festgestellt werden -gekoppelten Vorrichtung (CCD-Kamera) 7,8. Für maximale räumliche Auflösung tief im Gewebe, ist Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie die Methode der Wahl 9. Die relativ niedrige Quanten efficiency von SBFI erfordert relativ hohe Farbstoffkonzentrationen (0,5-2 mm) und Direktbeladung der Membran-undurchlässig Form SBFI über einen scharfen Mikroelektroden 10 oder Patch-Pipette 1.
Mit SBFI, früheren Arbeiten in akuten Gewebeschnitten der Nagetier-Hippocampus durchgeführt demonstriert tätigkeitsbezogene Natrium Transienten in Dendriten und Stacheln von CA1 Pyramidenzellen, die vor allem durch Einstrom von Natrium durch ionotropen NMDA-Rezeptoren verursacht werden 1,2. Für die Untersuchung der Eigenschaften derartiger lokaler Natrium Signale genauer ist eine spezifische Aktivierung von postsynaptischen Rezeptoren durch Anwendung der Rezeptoragonisten eine gut geeignete Methode der Wahl. Um präsynaptischen Aktivität und Transmitterfreisetzung zu imitieren, sollte die Anwendung relativ kurz sein und konzentrierte sich auf lokale Stimulation ermöglichen. Dies erweist sich jedoch als ziemlich schwierig in der intakten Gewebe sein. Lokale Anwendung von Druck-Rezeptor-Agonisten mit einem spitzen Pipette ermöglicht eine sehr Brenn apdung, beherbergt aber das potenzielle Risiko für die Herstellung von Bewegung der Struktur von Interesse (zB wie einem Dendriten oder dendritischen Dornen) und damit behindert hochauflösende Bildgebung. Die Eignung der Iontophorese von neuroaktiven Substanzen hängt von ihrer elektrischen Eigenschaften und die hohe Stromamplituden zellulären Artefakte auch zu produzieren.
Ein Weg, um diese Hindernisse zu umgehen ist der Einsatz von Photo-aktivierten Verbindungen und ihre Blitzphotolyse. Grundsätzlich werden zwei verschiedene Prinzipien für Foto-Aktivierung von caged Substanzen verwendet: I) Weitwinkel-Blitzphotolyse 11 und II) Brenn Uncaging Einsatz Scanmodule in Kombination mit Lasern 12. Während Weitfeld Blitzphotolyse wird verwendet, um größere Bereiche von Interesse zu aktivieren, zB eine gesamte Zelle, die Brenn Uncaging wird eingesetzt, um gezielt zu stimulieren kleinen zellulären Kompartimenten. In der vorliegenden Studie wurde ein Verfahren zur Ganzzell-Patch-Clamp-und Multi-p zeigen wir,hoton Natrium Bildgebung in Dendriten und Dornen des zentralen Neuronen, verbunden mit einem modifizierten Verfahren für UV-Licht induzierte Photofreisetzung von Glutamat, die zuverlässig und Brenn Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe ermöglicht.
Protocol
Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland, sowie der Europäischen Gemeinschaft Richtlinie des Rates (86/609 / EWG) durchgeführt. (: O52 / 05 institutionellen Akt-Nummer) Alle Experimente wurden von der Tierschutzbüro der Animal Care und Verwenden Einrichtung der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland mitgeteilt und genehmigt. In Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz (Tierschutzgesetz, Artikel 4 und 7), keine zusätzliche formale Zulassung für die postmortale Entnahme von Hirngewebe notwendig.
Für die Erzeugung der akuten Scheiben wurden Mäuse mit CO 2 betäubt und schnell enthauptet (nach der Empfehlung der Europäischen Kommission veröffentlicht in: Euthanasie von Versuchstieren, Luxemburg: Amt für amtliche Veröffentlichungen der Europäischen Gemeinschaften, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).
1. Herstellung vonLösungen
- Vorbereitung künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für die Präparation, enthaltend (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, und 20 Glucose, mit 95% O 2 und geperlt 5% CO 2, was zu einem pH von 7,4.
- Vorbereitung ACSF für Experimente, die (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, und 20 Glucose, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesprudelt, wodurch in einem pH-Wert von 7,4.
- Vorbereitung intrazelluläre Lösung (ICS), die (in mM): 150 KMeSO 3, 12,5 Hydroxyethyl-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, 1,25 Ethylenglykol-tetraessigsäure (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na GTP. PH-Wert auf 7,3. Speicher Aliquots von 1 ml bei -20 ° C.
- Verdünnen Natrium-Bindung Benzofuran- Isophthalat- (SBFI) -Salz in doppelt destilliertem Wasser und bereiten Aliquots von 5 uleiner 10 mM Stammlösung.
- Tauwetter ICS und fügen SBFI Stammlösung in einer Endkonzentration von 1 mM. Wirbel und Mikro-Filtrat (0,22 um). Halten bei 4 ° C, bis im Experiment verwendet. Nicht wieder einfrieren und nur für einen Tag.
- Bereiten MNI Glutamat Stammlösung von 50 mM durch Lösen der Verbindung in doppelt destilliertem Wasser. Verdünnen MNI Glutamat-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 5 mM in normalen ACSF. Halten bei 4 ° C, bis im Experiment verwendet. Nicht wieder einfrieren und nur für einen Tag. Speicher Aliquots, die nicht sofort in dem Experiment verwendet werden, bei -20 ° C.
2. Präparation der Gewebe
HINWEIS: Die Zubereitung von akuten Hippocampus des Gehirns Nagetier wurde im Detail beschrieben früher 13,14. Kurz gesagt, wurde das folgende Protokoll in der vorliegenden Studie verwendet.
- Nach Enthauptung, schnell zu entfernen, das Gehirn aus dem Schädel.
- Sofort setzen das Gehirn in einer Petrischalemit eiskaltem Dissektion ACSF und sezieren eine Halbkugel, indem eine sagittale Schnitt entlang der Mittellinie.
- Führen Sie einen zweiten Schnitt in der gewünschten Ausrichtung als Sperrfläche und befestigen diese an der Schneidstufe eines Vibratom mit Sekundenkleber.
- Nehmen Schneidkammer und Kühlelement (beide gehalten bei -20 ° C) des Vibratom aus der Tiefkühltruhe und Platz Schneidtisch mit Hirnschnitt in der Kammer. Dann legte Kühlelement in der Kammer und tauchen Gewebe in eiskaltem Dissektion ACSF. Zur Stabilisierung der Vorbereitung, kann man wollen, um den Gewebeblock mit Agar-Gel zu begegnen.
- Schneiden Sie 250 um dick, parasagittale Scheiben des Hippocampus mit der Vibratom. Sicherzustellen, dass alle ACS Flüssigkeiten werden zu allen Zeiten geleitet.
- Nach Schneiden, halten Gewebe auf einem Gitter in einem Becherglas mit der normalen ACSF und Inkubation bei 34 ° C für 30 min. Dann halten bei Raumtemperatur.
3. Vorbereitung der Hardware
Abbildung 1 Schematische Darstellung Lichtwege und experimentelle Kontrolle der Bohranlage, bestehend aus Mehrphotonenbildgebung, Laser-Scanning-UV-Flash-Photolyse und Elektrophysiologie. Die Multiphotonenstrahl (rot) durch eine gepulste, abstimmbaren Infrarot (IR)-Laser erzeugt (TiSa). Es spielt eine mechanische Blende, eine Pockels-"Zelle, und der IR-Detektor (Detektionsstrahlintensität), die alle Steuerung der Laserleistung und seiner Verabreichungsdauer zu ermöglichen. Das Flip-in / out-Flip optional Laserdiode für die Grundausrichtung des Laserstrahls eingesetzt. Der Strahlaufweiter kann in Kombination mit Objektiven mit einem extrem breiten hintere Brennebene verwendet werden. Die ferngesteuerte ND Filterrad kann zusätzlich oder anstelle des Pockels 'Zelle Laserstrahlleistungssteuerung verwendet werden. Nach dem Passieren der Scankopf wird der gepulste IR-Licht auf die Probe geführt. EmittierenTed Fluoreszenzlicht (hellgrün) wird entweder von der externen oder der internen Photomultiplier-Detektoren (PMT) gesammelt. Die äußeren Detektoren sind mit der internen PMTs über einen Hochfrequenzschalter (PMT Controller) synchronisiert. Die Uncaging Strahl (hellblau) wird durch eine UV-Festkörperlaser (DPSS UV-Laser) produziert. Es wird dann an den Galvo-angetriebenen Scanneinheit an der oberen Rückseite der Auflicht-Fluoreszenz Kondensator durch einen Lichtleiter gerichtet. Die genaue Positionierung (chromatische Aberration zwischen Bildgebung und Uncaging Strahl) des Uncaging Ort oder Gebiet wird von der Bildexport aus der Imaging-Software aktiviert ist. Die Zeitablaufmanagement zum Synchronisieren der Bilderzeugung wurde die Elektrophysiologie und die Blitzphotolyse wird elektronisch gesteuert. Durchleuchtungsdetektor (TL-PMT) ist der Bedarf für die Dokumentation der Positionierung der Pipetten innerhalb des Gewebes. Die Steuereinheiten und Software des Abbildungssystems, das modifiziert worden ist, wird verwendet, zu steuern und zu allen anderen Geräten zu synchronisierenbenötigt, um das System zu betreiben. Systemkomponenten markiert, wie "custom" wurden entworfen und bauen / der Autoren angepasst. Einige Komponenten wurden angepasst, um die Anforderungen der kunden-build Multi-Photonen-System zu erfüllen und werden als "verändert" gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Einschalten Komponenten der Mehrphotonensystem. Testen und Anpassen Infrarot-Laserstrahl Ausrichtung.
- Steuerstrahlpositionierung durch Umklappen in der Zentrierung Prisma statt ein Ziel. Wenn der Strahl verrenkt, korrigieren sie durch die Spiegel in das Periskop. Beachten Sie, dass die Zentrierfläche des Prismas ist an der gleichen Höhe wie die hintere Brennebene des Objektivs während der Bildgebung.
- Schalten Sie das Spektrometer und überprüfen Sie die Multi-Photonen-Eigenschaften des Strahls.
- Setzen Parameter des Imaging-Software auf die folgenden Werte: Wählen Sieeiner Bildgröße von 512 x 512 Pixeln für Übersichtsbilder der Zelle (kleiner Clip Boxen mit einem Zoomfaktor von 2,5 für hohe Bildrate und hoher räumlicher Auflösung, beziehungsweise). Stellen Sie Abbildungsgeschwindigkeit zu schnellen Modus und Scan-Modus zu XYT. Z-Schritt sollte 1 um für Übersicht Stacks und 0,2 um detaillierte Stapel, um räumliche Stichprobenanforderungen für Entfaltung später durchgeführt Spiel.
- Anpassen von Multi-Photonen-Laser-Strahl (790 nm) Intensität durch Veränderung der Einstellungen Pockels 'Zelle (endgültige Macht unter dem Ziel: ≈ 14-16 uW) und die Foto-Multiplikatoren (PMT).
- Einschalten und Kalibrieren Uncaging System, indem Sie einen fluoreszierenden Probenträger unter dem Objektiv.
- Mit den Ferngläsern, stellen Sie den Fokus der UV-Optik und räumlich begrenzen die UV-Laserpunkt zu einer Größe von 2 um im Durchmesser maximal durch den Einsatz der Fokussierungseinheit an der UGA Scankopf.
- Starten Sie die Kalibrierung der Steuereinheit Uncaging Software.
- Stellen Sie die UV-Laser, mehrere Punkte in seinen Scan-Bereich, während die Fluoreszenz wird mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Durch Klicken auf den UV-Laserpunkt an jedem Punkt, passen Sie die Positionierung der galvanischen Scanspiegel bis zu einem gewissen entsprechen Koordinate in der Software.
Figur 2. Detaillierte Schema veranschaulicht die Eigenschaften von Anregung und Emission Uncaging Strahlengänge. Die IR Anregungsstrahl (rot) durchläuft die Strahlvereinigungs dichroitischen Spiegel auf der Ebene zu der Filer Revolver im Auflicht-Fluoreszenz Kondensator des Mikroskops und dem Ziel, erreichen die Probe. Die Uncaging Licht (blau) über eine optische Quarzlichtfaser zur Kollimation und Strahl auf die Scan-mi geliefert Fokussierungseinheit und anschließend geführtrrors in der Abtasteinheit, passiert einen dichroitischen Spiegel zu dem Strahlvereinigungs dichroitischen Spiegel. Hier ist mit dem Anregungs Abtaststrahl kombiniert wird. Das emittierte Licht von der Probe folgt der Weg des Anregungsscanstrahlengang in der entgegengesetzten Orientierung der Bildgebungsscankopf. Die Kamera ist für die visuelle Kontrolle der Patch-Pipette und zur Positionierung des Uncaging Strahls in Kombination mit dem konfokalen Laserrastermikroskop (nicht gezeigt). Das grüne Licht Weg für eine optionale Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung, die von den Einsatz mit anderen Anwendungen sein können.
- Verwenden Sie den Blitz-Photolyse-System in der Spot-Modus, um Brenn Anwendungen zu gewinnen. Sicherzustellen, dass die Fokuseinstellung des Uncaging Strahl (mittlere Leistung unterhalb der Objektiv: 0,55 mW) führt zu einer Punktgrße von 1,5 um Durchmesser (xy-Erweiterung) als bei einer fluoreszierenden Folie auf einer z-Ebene positioniert ist, die offenbart, um die der entspricht, ein GewebeScheibe (nicht gezeigt).
- Die genaue Positionierung des Uncaging Fleck durch den Import eines Bildes des Abbildungssystems über eine Netzwerkverbindung zwischen uncaging- und Imaging-Computern erreicht.
- Mit Hilfe eines Screen Grabber-Software, kontinuierlich ausgelesen die Rahmen der Imaging-Software (statt der Kamera Futter) und passen Sie die Bildgebung und Uncaging Rahmen deckungsgleich. Exportieren Jede 10. Rahmen von der Bildbearbeitungssoftware als ein Referenzbild in das Blitzgerät auf die richtige Einstellung während des gesamten Experiments zu gewährleisten.
Abbildung 3. Die Einstellung der Uncaging vor Ort: Um genau zu positionieren, die Uncaging Spot, einen Screenshot von der Imaging-Software (gelber Rahmen) in die Uncaging Software (grüner Rahmen) importiert. Dielinke Bild im gelben Rahmen eine Hallo-Lo codierten Bild (blau: schwarze Pixel, rot: gesättigte Pixel) des gesamten CA1-Pyramidenzellen. Das Bild wird durch die Kalibrierungsgitter der Uncaging Software (grün "X") überlagert. Auf der rechten Seite ist eine vergrößerte Teil der Zelle mit dem überlagerten Uncaging Stelle (rotes Kreuz) gezeigt. Der gelbe Fleck ist der automatisch überlagert Bild der Uncaging Strahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Schaltet Mikromanipulatoren, Elektrokomponenten und Druckanwendungseinrichtung zur Abgabe der Käfigverbindung mit dem Zielbereich.
- Installieren Sie eine Brenndruckapplikationsgerät für lokale Perfusion von Käfigverbindungen. Dies wird die Kosten enorm reduzieren im Vergleich zu Badperfusion dieser Stoffe. Stellen Sie die Haltedruck auf den angegebenen Luftdruck, um einen Widerstand des AC verhindernSF in oder ein Auslaufen von caged Substanzen aus der Anwendung Pipette.
HINWEIS: Die Druckauftragseinrichtung beherbergt eine hochpräzise und ultraschnelle Mikroventil in der Pipettenhalter. Dies ermöglicht eine minimale Anwendung Drücke angewendet und reduziert Bewegungsartefakte auf ein Minimum während der lokalen Durchblutung mit der Käfigverbindung daher. - Ziehen Pipetten für Whole-Cell-Patch-Clamp-und lokalen Perfusion mit feuerpolierten Borosilikatglas Kapillaren. Pipetten haben einen Spitzendurchmesser von ca. 1 um und einen Widerstand von R ≈ 3 MOhm (mit K-MeSO 3 basierenden ICS ermittelte Werte).
- Ort Scheibe in der experimentellen Bad und befestigen es mit einem Gitter (Platin Rahmen 250 um dick, überspannt mit chirurgischen Fäden, Außenmaß 40 um) (4A, B). Verwenden Sie eine umgekehrte, Tip-gebrochen und feuerpolierten Pasteurpipette (Saug Ball an der Seite des gebrochenen Spitze) für Slice-Transfer. Nicht zu verbiegen und andere harte Handhabung der Scheibe.
- Zeigen Bad am Mikroskoptisch und dauerhaft perfundieren Scheibe mit ACSF.
- Last Patch-Pipette mit ICS enthält SBFI und laden lokale Perfusion Pipette mit Käfig Verbindung. Bringen Pipetten mit entsprechenden Mikromanipulatoren. Zeigen Referenzelektrode im Bad. Stellen Sie sicher, dass Sie dauerhaft geerdet, um Schäden an der Kopfstufe (siehe Abbildung 4C) zu vermeiden.
- Senken Sie beide Pipetten in Bad und legen Sie sie über dem Hippocampus CA1-Region. Sanften Druck, um Patch-Pipette (40 mbar) zu einer Verwässerung des IKS mit ACSF zu vermeiden.
- Kompensieren die Offset-Potenzial der Patch-Pipette mit der Elektrophysiologie-Software.
- Ansatz eine CA1-Pyramidenzelle mit Patch-Pipette Einsatz IR-DIC Videomikroskopie. Gelten, bis eine sanfte Saugwirkung Giga-Dichtung erhalten. Wähle eine Zelle, die das Soma von denen 30 -70 um unterhalb der Oberfläche der Scheibe angeordnet, um intakte Zellmorphologie auf der einen Seite und niedrige Streuung und Dämpfung der Uncaging Strahl auf der anderen Seite zu gewährleisten.
- Ausgleich für die schnelle Kapazitäts. Pause Membrane und offene Zelle in Gesamtzellkonfiguration zu erhalten.
- Ausgleich für langsame Kapazität und Serienwiderstand.
- Erlauben der Zelle mit den SBFI-ICS für mindestens 30 Minuten dialysiert werden, bevor der Imaging-Experimente.
- Hinzufügen Tetrodotoxin (TTX, 500 nm) zu ACSF zur Aktivierung von spannungsabhängigen Natrium-Kanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen zu verhindern.
- Visualisieren Zellmorphologie mit Multi-Photonen-Anregung und die daraus resultierenden SBFI Fluoreszenz und wählen Sie eine stachelige Dendriten für Experiment. Zoom für Bilder mit einer höheren Auflösung und legen Sie einen Clip Kasten um den Dendriten.
- Füllen Sie ein Standard-Patch-Pipette mit 10 ul ACSF geschütztes Glutamat. Schließen Sie die Pipette auf die Druckanwendungssystem und verbinden Sie es mit dem Mikromanipulator.
- Zeigen Pipette mit Käfigverbindung in der Nähe der Dendriten (~ 30 um). Positionieren Sie die Pipette, damiteffiziente lokale Durchblutung des Dendriten der Wahl. Stellen Sie den Laser Uncaging: Positionieren Sie den Uncaging Ort in der Nähe (~ 1-2 um) auf die Struktur von Interesse.
- Set Regionen von Interesse von der gewählten Dendriten und neben Stacheln mit Imaging-Software.
- Nähern Sie sich dem Bereich von Interesse und fokal spritzen den Käfig Verbindung für mehrere Sekunden mit niedrigem Druck (<3 PSI). Starten Patch-Clamp und Fluoreszenzaufnahmen (bei 790 nm Multi-Photonen-Anregung) über Triggersignals.
HINWEIS: Während der lokalen Durchblutung des caged-Verbindung, wird der Anregungsstrahl komplett gedimmt, um die Bleich verhindern. - Stoppen lokale Durchblutung der Käfigverbindung. Erhöhen Intensität der Zwei-Photonen-Laser, um eine effiziente Anregung von SBFI ermöglichen und wenden Sie einen UV-Blitz zu Uncaging (Uncaging Dauer 300 ms) zu initialisieren.
- Überwachen Sie Änderungen in SBFI Fluoreszenz. Die Aufnahme nach SBFI Fluoreszenz zurück zum Ausgangswert zurückgewonnen.
- Um die Beteiligung von ionotropen Glutamat-Rezeptoren bei der Erzeugung der Ströme und / oder Natrium Signale durch UV-Flash-Photolyse von caged Glutamat hervorgerufen zu testen, verwenden Rezeptor-Blocker.
- Wechseln Sie zu ACSF mit dem AMPA-Rezeptor-Blocker Cyano-nitrochinoxalin-dion (CNQX, 10 uM) und der NMDA-Rezeptor-Blocker Amino-phosphonopentanoate (APV, 50 uM) zusätzlich zu TTX (siehe oben) und perfundieren Scheibe für mindestens 10 Minute
- Wiederholen Sie die Stimulationsverfahren (siehe 5.4 und 5.5.)
- Reversibilität der Inhibitoren "Auswirkungen
- Wechseln wieder zur normalen ACSF, die nur TTX.
- Perfundieren Scheibe für 20 min.
- Wiederholen Sie die Stimulationsverfahren (siehe 5.4 und 5.5.).
- Zeichnen Sie eine XYZ-Stapel von der Clip-Box-Set für die Region durchgeführten Messungen. Stellen Sie sicher, dass dieser Stapel ist Oversampled räumlich (mindestens 0,2 um pro Pixel), um eine optimale Bild Entfaltung zu ermöglichen und um Bildqualität und Auflösung zu erhöhen.
- Aufzeichnen einer XYZ-Stapel des gesamten Zell-Zell-Morphologie zu bewerten.
- Führen Entfaltungsalgorithmus.
Abbildung 4. Komponenten des Versuchs Bad und Positionierung des Bades am Mikroskoptisch. (A) Die experimentelle Bad aus dem Bad Kammer selbst (blaues Quadrat), die durch eine magnetische Metallring umgeben ist. Die Rohrleitung sorgt für eine kontinuierliche Perfusion der Wanne mit Kochsalzlösung (ACSF). Das Gitter gedrückt halten und fixieren Sie die Scheibe in das Bad Kammer gestellt. (B) Akute Schnittpräparat im Bad Kammer positioniert. Die Scheibe wird durch die Fäden des Gitters (C) Positionierung und die Geometrie des Versuchs Bad am Mikroskoptisch während der Experimente festgelegt..
4. Ganzzell-Patch-Klemm
5. Multi-Photonen-Imaging und Stimulation
Abbildung 5. Experimentelle Protokoll., Ein Experiment, ein Trigger-Impuls (durch rote Vorzeichen (ᴨ) und die rote Linie) initialisiert wird sich gleichzeitig starten Sie die Imaging-(blau), die Elektrophysiologie (grün), und die Verwaltung des Caged Verbindung (gelb) zum Zeitpunkt 0 Sekunden. Während dieser ersten Periode, sollte die Abbildungsstrahlen vollständig gedimmt (hellblau) werden. Nach 4,5 sec (gestrichelte Linie), wird die lokale Durchblutung der Käfig Verbindung beendet und der Abbildungsstrahl sollte seine wor eingestellt werdenKönig Intensität für die Datenerfassung (blau). Durch den gelben Blitz angezeigt; 300 ms: 1,5 sec später (Zeitpunkt 6 sec), eine zweite Trigger-Impuls gegeben wird, die die UV-Blitzgerät (Dauer des Blitzes initialisiert (durch rote Vorzeichen (ᴨ) und die rote Linie) ) und setzt Markierungen in der Elektrophysiologie und der Abbildungsprotokoll.
6. Pharmakologie
7. Morphologie
Representative Results
In der vorliegenden Studie zeigen wir, ein Verfahren für die Multi-Photonen-Mikroskopie von zellulären Natrium Dynamik mit den natriumabhängigen Fluoreszenzfarbstoff SBFI in CA1-Pyramidenneuronen des Hippocampus der Maus akuten Gewebeschnitten. Darüber hinaus zeigen wir, wie man diese bildgebenden Verfahren mit Laser-Scanning-basierte Uncaging neuroaktiven Verbindungen (zB geschütztes Glutamat) und die präzisen Targeting, um zelluläre Mikrodomänen kombinieren.
Laden Neuronen mit SBFI durch die Patch-Pipette aktiviert die Visualisierung der gesamten Zelle mit feinen Dendriten und benachbarten Stacheln durch Verwendung Multi-Photonen-Anregung (6A, B, D und 7A).
Abbildung 6. Sodium Signale und synaptische Ströme durch Flash-Photolyse von caged Glutamat induziert. (A) Maximal Projektionsbild eines CA1 Pyramidenzelle über die Patch-Pipette (PP) mit SBFI geladen. Der Kasten zeigt das gezeigte in B. LP vergrößert Bereich zeigt die Position und Orientierung der Pipette für die lokale Durchblutung geschütztes Glutamat. (B) Hochleistungsmaximum Projektion von einem Stapel von optischen Schnitten eines Dendriten mit angrenzenden dendritischen Dornen. Die Stapel optischer Schnitte unter z-Ausrichtung und Entfaltung. Das rote Kreuz zeigt die Zielregion des Uncaging Strahl. Die orange gepunktete Linie umreißt den Bereich von Interesse, von dem die Fluoreszenzemission aufgezeichnet. Die Box gibt den dargestellten Bereich in D. (C) vergrößert Links: Sodium-Signal (obere Reihe) und somatische innen Strom (untere Reihe) durch Flash-Photolyse von caged Glutamat (von gelber Blitz gekennzeichnet) induziert. Die rote Linie stellt eine Anpassung der experimentellen Daten. Der graue Bereich stellt die Periode, in der die Uncaging Blitz (300msec) behindert die Abbildung der Fluoreszenz SBFI. Rechts: Ohne Vor-Perfusion mit geschütztem Glutamat, das gleiche UV-Blitz weder evozierte eine Änderung in SBFI Emissions, noch einen nach innen gerichteten Strom (D) Links:. Hohe Leistungs Bild des Dendriten und den angrenzenden Stacheln wie in B abgegrenzt Daneben das gleiche Bild mit umgekehrten Grauwerte. Die gepunkteten Linien zeigen die Bereiche von Interesse, bei denen die Fluoreszenzemission aufgezeichnet. Das rote Kreuz zeigt die Lokalisierung der Uncaging Strahl. Rechts: Sodium Transienten, die durch UV-Flash-Photolyse von caged Glutamat induziert. Blaue Kurve: Natrium-Signale in Dendriten; rote Spur: Mittelwert der Reaktion von drei Stacheln neben dem Uncaging Ort; grüne Spur: Mittelwert der Reaktion von drei entfernten Stacheln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Nach lokalen Perfusion mit CagedGlutamat, Aufbringen eines UV-Blitzes in der Nähe eines Dendriten in Folge einer vorübergehenden Abnahme der Fluoreszenzemission von SBFI, was eine Zunahme der intrazellulären Natriumkonzentration (6C, D und 7B). Zur gleichen Zeit wurde ein Einstrom im Soma (6C und 7B) aufgezeichnet. Erhöhen der Dauer der UV-Blitz Folge zunehmenden Amplituden sowohl der nach innen hervorgerufenen Ströme und die Natriumsignale (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass das System gut innerhalb seines Dynamikbereichs und weder Uncaging oder zellulären Reaktionen wurden gesättigt. Aufbringen einer UV-Blitz gleicher oder längerer Dauer, um Scheiben, die nicht mit geschütztem Glutamat vorge perfundiert waren, nie ausgelöst Änderungen SBFI Fluoreszenz noch Einwärtsströme, was anzeigt, daß diese Signale durch die Demaskierung Glutamat (Figur 6c). Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass keine gegenseitige Abhängigkeit der Patientenlagerungs- und Uncaging Komponenten u beobachtetnder unseren experimentellen Bedingungen. Natrium-Signale auch in dendritischen Dornen (6D) detektiert werden. Während wir nicht versuchen, der Stimulation eines einzelnen Wirbelsäule nur mit Glutamat Uncaging erreichen, tendenziell Spitzenamplituden zu sein in der Nähe der Stacheln Uncaging Stelle etwas höher, während weiter entfernt Stacheln zeigten nahezu identische Fluoreszenzänderungen als Mutter Dendriten (6D).
Schließlich untersuchten wir den Weg für Natrium-Einstrom in Dendriten und Dornen in Reaktion auf Uncaging von Glutamat. Zu diesem Zweck verwendeten wir CNQX und APV, die selektive Blocker für die Natrium-permeable, ionotropen Glutamat-Rezeptoren des AMPA- und NMDA-Subtyps bzw. sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Glutamat-induzierte intrazelluläre Natriumsignale und die hervorgerufene Körperströme wurden in der Gegenwart dieser Blocker (7B) weggelassen. Nach Auswaschen der Blocker, werden die Signale wieder. Dies zeigt, that Uncaging von Glutamat aktiviert ionotropen Glutamat-Rezeptoren auf CA1-Pyramidenneuronen, die den Einstrom von Natrium in Dendriten und Dornen zu vermitteln, was in der intrazellulären Natrium-Transienten und Einwärtsströme.
Abbildung 7. pharmakologische Profil von Natrium evozierte Signale und Einwärtsströme. (A) SBFI gefüllten CA1 Pyramidenzelle mit Patch-Pipette (PP) mit dem Soma befestigt (B) Links:. Sodium vorübergehend und somatischen Strom, der durch Photoaktivierung von geschütztem Glutamat in einem Dendriten induziert und befestigt Stacheln Center:. Perfusion mit der ionotropen Glutamatrezeptorblocker CNQX und APV hemmt sowohl die Natrium-Signal und die nach innen gerichteten Strom von Photofreisetzung induzierten. Rechts: Nach dem Auswaschen der Blocker die Signale wiederhergestellt werden. Die rote Linie repräsents eine Anpassung der experimentellen Daten. Der graue Bereich stellt die Periode, in der die Uncaging Blitz (300 ms) behindert die Abbildung SBFI Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die vorliegende Studie zeigt, dass SBFI ist für Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in kleinen zellulären Kompartimenten gut geeignet. Es muss berücksichtigt werden, jedoch, dass die Quanteneffizienz der SBFI eher gering 15 und relative Veränderungen in der Natriumkonzentration ziemlich klein mit physiologischer Aktivität. So ist hochauflösenden Messung von Na +-Transienten in feinen Prozesse eine relativ langwierige Aufgabe, und Binning-oder Mittelwertbildung aus mehreren Studien notwendig sein, um zufrieden stellende Signale zu erhalten. Außerdem ist die Kinetik der Natrium Transienten raschend langsam, was es obligatorisch, für längere Zeitperioden aufzuzeichnen. Diese Beobachtung entspricht den in früheren Studien, in denen monoexponentiellen Natrium Transienten in neuronalen Dendriten und in Astrozyten durch große Zerfallszeitkonstanten im Bereich von 10 sec bei Raumtemperatur 1,2,6 gekennzeichnet. Natrium Transienten scheinen somit einen viel langsameren Zeit Co ausübenUrse und viel größer Abklingzeitkonstanten im Vergleich zu Kalzium-Transienten 16.
Beiseite, diese Nachteile zu setzen, erweist sich Natrium-Bildgebung ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften der neuronalen Subdomains sein. So kann beispielsweise Natrium-Bildgebung dienen erregenden synaptischen Aktivität auf oder in der Nähe von aktiven Synapsen überwachen. Da Natrium im wesentlichen nicht gepuffert 8,17, sind Aktivität induzierte Natrium Transienten linear auf einer breiten Palette von synaptischen Glutamatfreisetzung bezogene oder exogen Glutamat. Sie repräsentieren somit direkten und unvoreingenommene Indikatoren neuronaler glutamatergen Aktivität. Außerdem Natriumindikatorfarbstoffe zeichnen sich durch hohe K d 's (SBFI K d im Bereich von 25 mm 1). Selbst bei den verwendeten, um eine ausreichende Helligkeit zu erreichen relativ hohe intrazelluläre Farbstoffkonzentrationen (in der Regel 0,5 bis 1 mm), der hohe K d 's bedeuten, daß die Farbstoffe selbst nicht als Puffer für S handelnOdium. Folglich haben sie nicht die Amplitude noch zeitliche Verlauf der Natrium-Transienten verzerren, das ist immer ein Problem, wenn Calcium-sensitiven Farbstoffe werden in die Zellen 18 eingeführt. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass die erfassten Signale stellen ein gutes Maß für die "echten" Änderungen der intrazellulären Natrium. Ihre langsame zeitliche Verlauf bedeutet dann, dass die Geschwindigkeit für die intrazelluläre Diffusions Natrium in Neuronen ist viel kleiner als bisher angenommen 19.
Eine entscheidende Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung von Experimenten der Bewältigung der Eigenschaften von erregenden synaptischen Übertragung und Natrium-Influx Wege in Stacheln und Dendriten ist die Induktion einer schnellen und stark lokalisierte Aktivierung der postsynaptischen Strukturen. Dies kann durch schnelle und lokale Applikation von Glutamat oder Glutamat-Agonisten in der unmittelbaren Umgebung einer Wirbelsäule oder einem Dendriten durch den Blitz-Photolyse von caged Verbindungen erhalten werden. Blitzphotolyse nicht mechanisch damage das Gewebe, ist frei von Bewegungsartefakten und ist gut für die Untersuchung der damit verbundenen Fragen etabliert (zB lokale Calcium-Signal). Der Durchmesser des Uncaging Stelle betrug 1,5 um in der xy-Ebene. Uncaging fast eine stachelige Dendriten induzierte Natrium-Signale in beiden Stacheln und die Mutter Dendriten. Während die Signale eher größte in Stacheln am nächsten an der Uncaging Ort zu sein, waren die Amplituden in der übergeordneten Dendriten und Dornen weiter weg noch recht ähnlich zu denen in unmittelbarer Nähe des Uncaging Ort. Uncaging wurde für 300 ms, während der innere Ströme in Amplitude erhöht geführt. Uncaged Glutamat könnte im Gewebe während der gleichen Zeitperiode diffundiert sind, Aktivierung ionotropen Glutamat-Rezeptoren und Natrium-Influx auf dendritische Dornen Regionen und weiter weg von der Uncaging Ort.
Eine intrinsische Problem, das bei der Verwendung eines UV-Laser für die Photolyse von caged Verbindungen durch die Zelle Badelösung verabreicht trittist "innere Filter '. Aufgrund der hohen Absorptionsrate des Käfigs wird UV-Licht stark entlang dem Weg von dem Ziel zu der Stimulationsstelle 20,21 gedämpft. Ein möglicher Weg, um dies zu vermeiden ist die lokale Perfusion mit dem Käfig, der nur an der Stimulationsstelle, die außerdem verringert die Menge der Caged Compound auf ein Minimum beschränkt ist erforderlich. Im Vergleich zu UV-Laser-Scanning-vermittelte Uncaging, nahen Infrarot-Zwei-Photonen-Uncaging 22 ist räumlich präzise, vor allem, weil die Genauigkeit der Stimulation in der z-Achse erhöht. Auf der anderen Seite, aufgrund der kleinen Querschnitt von allgemein verwendeten Käfige für längere Wellenlängen wie bei der Zweiphotonenanregung verwendet wird, entweder eine hohe Konzentration des photoaktivierbaren Verbindung oder sehr hoch ist, potentiell phototoxischen Lichtintensitäten erforderlich sind. Auch Zwei-Photonen-Photofreisetzung erfordert eine viel höhere Investitionen in die Ausrüstung; unter anderem eine zusätzliche IR-Laser sowie die erforderlichen optischen Komponenten benötigt werden.
Sowohl SBFI und MNI-Glutamat sind erregbar in der identischen Wellenlängenbereich. Dies kann zu einer ungewollten Wechselwirkungen von UV-Laser und Uncaging SBFI oder IR-Imaging und Laser-MNI-Glutamat führen, was in der Bleich SBFI vom Uncaging Flash und / oder einer kontinuierlichen Uncaging von Glutamat durch die IR-Strahl. Wie in 6C gezeigt, weder eine UV-Blitz selbst noch die Mehrphotonenabbildungs verursacht jedoch solche Wechselwirkungen unter unseren experimentellen Bedingungen.
UV-Blitzsysteme ähnlich dem hier beschriebenen werden routinemäßig in vielen Laboratorien und relativ einfach in bestehende Multi-Photonen-Imaging-Mikroskop aufgenommen werden. Es bietet den Vorteil, dass der Laserstrahl für die Photolyse frei im Blickfeld befinden. Darüber hinaus ermöglicht das System eine schnelle und automatische Neupositionierung des Laserstrahls und die Freisetzung Volumen bzw. in das Blickfeld während eines Experiments. Our Änderung vereinfacht und verbessert die genaue Positionierung des Uncaging Ort, so dass die Rahmen der Imaging-Software kann auf Bildgebung und Uncaging Rahmen deckungsgleich einstellen zu dienen.
Zusammengenommen Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Natrium-Bildgebung in Dendriten und Dornen des zentralen Neuronen, verbunden mit einem modifizierten Verfahren für UV-Licht induzierte Photofreisetzung von Glutamat, eine zuverlässige und Brenn Aktivierung von Glutamat-Rezeptoren im Gewebe. Es kann somit dazu dienen, die Eigenschaften der exzitatorischen synaptischen Transmission und postsynaptischer Natrium Signale in Neuronen im intakten Gewebe zu analysieren.
Disclosures
Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte. Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung ermöglicht Open Access-Veröffentlichung von Rapp OptoElektronik (Wedel, Deutschland), die ein Instrument in der Video-Artikel verwendet wird, erzeugt. Das Unternehmen war in den Experimenten noch in der Datenverarbeitung noch in der Handschrift weder schriftlich beteiligt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Ro2327 / 6-1), um CRR Die Autoren möchten Durry S. und C. Rodrigo für kompetente technische Unterstützung, und M. Dübbert (Elektronik-Labor, Zoologisches Institut danken unterstützt , Universität zu Köln, Deutschland) um Hilfe bei der Umsetzung der Pockels-Zelle-Controller und die HF-Schalter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
| Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
| Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
| Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
| Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
| IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
| IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION |
| IR power monitor | Custom built | ||
| Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
| Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
| ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0 |
| Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
| Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
| Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
| Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
| Shutter controller | Custom built | ||
| Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
| Slicer/Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
| Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
| UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
| UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
| SBFI K+ salt | Teflabs | OO32 | |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
| NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamate released upon UV absobtion |
References
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