Abstract
İnsektisit direnç sıtma kontrol programları için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sivrisinekler sıtma tropikal ülkelerde bir yerde hazır ve nazır sorunu kontrol yapma, hızlı ortamındaki değişikliklere geniş bir uyum. insektisit dirençli popülasyonların ortaya çıkması vektör sivrisinek kontrolü için yeni ilaç hedef yolları ve bileşiklerin keşif garanti. Epigenetik ilaçlar iyi ancak çok böcekler üzerindeki etkileri hakkında bilinen değil, kanser araştırma kurulmuştur. Bu çalışma sıtma vektörü, Anopheles gambiae üzerine, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), kanser tedavisi için bir deneysel epigenetik ilacın toksikolojik etkilerini inceleyen için basit bir protokol sağlar. Bileşik tedavi kontrole göre yetişkin sivrisinekler doğurganlığını düşük ise mortalite ve boyut olarak azalma konsantrasyona bağlı bir artış DZNep maruz olgunlaşmamış sivrisinek gözlenmiştir. Buna ek olarak, S, bir ilaca bağlı bir azalma vardı -tedavileri kontrol etmek DZNep göreceli maruz kaldıktan sonra sivrisinek adenozilhomosisteine (SAK) hidrolaz aktivitesi. Bu protokoller da, suda çözünür epigenetik ilaçların veya bileşiklerin toksikolojik etkileri keşfetmek için eşsiz bir çoklu-uçlu yaklaşımı göstermek, deneysel ilaç için birden fazla toksikolojik uç noktalar değerlendirmek için basit, adım-adım prosedürü ile araştırmacı sağlamak ve Vektör Sivrisinek ve diğer böceklere karşı ilgi.
Introduction
Sıtma dünyada böcek bağlı ölümlerin en fazla sayıda sorumludur. Tahminen 219,000,000 olgu, öncelikle, Afrika 1 yaklaşık 660,000 ölüm ile sonuçlanan, dünya çapında yılda görülür. Uyumlu çabalara rağmen, sıtma programları çeşitli sorunlarla karşı karşıya. Insektisit tedavi cibinlik ve programın kapalı kalan püskürtme formu anahtar bileşenleri, yerel topluluklarında insektisit direnci bu çabaları 2 engel iken. insektisit dirençli sivrisinek popülasyonları hızlı artış büyük ölçüde kendi ortamında değişikliklere çabuk adapte ve farklı nişler 3,4,5 sömürmek için sıtma sivrisinek yeteneği atfedilir. Direnç mevcut mekanizmaların üstesinden gelmek için, yeni insektisit hedefleri ve gelecek nesil bileşiklerinin keşif garantilidir. Sıtma m değişik yaşam evrelerinde deneysel insektisitlerin etkinliğini belirlemek için basit bir adım adım protokolüosquitoes ölçüde bu çabalarını artırmak olacaktır.
Hücre hatları ve hayvan modellerinde uyuşturucu etkileri Farmakolojik çalışmalar hücrelerin ve organizmaların genetik ve fizyoloji modüle için yararlı bir araç olarak epigenetik ilaçların kullanımını kurduk. DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu altta yatan bir DNA dizisini 6 değiştirmeden çok hücreli organizmalarda gen ifadesini etkileyen iki epigenetik mekanizmalar vardır. Böyle metilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, hücresel bütünlüğü ve gen ifadesini sürdürülmesinde önemli bir rol oynar ve birçok temel süreçleri 7,8,9 etkileyebilir. Bazı böcek türlerine Araştırma hücrelerinin oluşumu ile ilgili işlemlerde epigenetik önemi vurgulanmıştır ve hücre bakım 10, hem de dozaj telafisi 11 kök var. Ancak, hastalık vektörlerinde bu yaklaşım henüz keşfedilecek edilir. Sivrisinekler bu sistemi modüle bir bileşik Kullanımı bize verebiliryeni insektisit hedef yollar içine manzaraları. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), değişik kanser türlerinin üzerindeki etkisi 12,13,14,15,16 incelenmiştir bilinen bir histon metilasyon inhibitörüdür. DZNep dolaylı olarak histon lizin, N -methyltransferase önleyen bir kararlı, suda çözünebilen epigenetik ilaç (EZH2), memeli hücrelerinde Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) 'in bir bileşeni. PRC2 çok hücreli organizmalarda kök hücre büyümesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, ve histon metilasyon PRC2 aracılı gen susturma önemli bir yönüdür. Bağışıklık yetersizliği olan fareler içinde DZNep ile ön-muamele edilmiş hücreler, 17 daha az tümörijenik olduğu gösterilmiştir. Bu ilaç gibi EZH2 18 karıştığı olduğu alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi diğer hastalıklar, eğitim için kullanılan hale gelmektedir. DZNep kurulmuş bir S -adenosylhomocysteine (SAK) hidrolaz inhibitörü 19, 20. in SAH hidrolaz sonuçlarının önlenmesiSAK birikimi ve buna bağlı olarak, temin edilebilen metil donör gruplar sınırlayarak metiltransferaz aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. SAK metabolik yollardaki böcekler dahil olmak üzere, pek çok organizmalar tarafından kullanılan bir amino asit türevidir. Yeni yapılan bir çalışmada diapause etkileyebilir ve böcekler 21 gelişimini geciktirebilir düşük dozlarda o DZNep göstermiştir.
Burada, sivrisinek çeşitli yaşam sahnelerinde suda çözünür bileşik etkilerini araştırmak için sağlam bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokolün üç parça olgunlaşmamış sivrisinekler, yetişkin kan-besleme kadın ve yetişkin erkek ve dişi sivrisineklerin enzim aktivitesi üzerine bir suda çözünür bileşik etkilerini incelemek için talimatları içerir. İlk olarak, DZNep olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma çalışma için su içinde çözülmüştür. Bu ilaç maruziyeti 10 katlık bir artış ortaya çıkan herhangi bir karşılaştırma yapmak amacıyla iki konsantrasyonda yapılır. Yetişkin dişi sivrisinekler, DZNep ilacın etkisini araştırmak içindefibrile koyun kanı ilave ve dişilere yapay kan beslenir. Daha sonra, doğurganlık üzerindeki ilacın sonucu incelenmiştir. Son olarak, bir enzim etkinliği tahlili Yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak 5,5'-ditiyobis- (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile gerçekleştirilir. Bu protokol, bir sıtma sivrisinek Anopheles gambiae ile geliştirilmiştir iken, kolayca sivrisinek ya da diğer böcek herhangi bir türün ilgi bileşiklerinin etkilerinin araştırılması için adapte edilebilir. Bu protokol detaylı teknikler etkili bir şekilde su ya da sulu ortam içinde, sınırlı ya da çözünürlüğe sahip bir ilaç için tatbik edilemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: protokol üç parça larva sivrisinek, doğurganlık etkisini incelemek için yetişkin kadın için DZNep bir kan-tabanlı maruz kalma DZNep ilacın sulu pozlama tarif ve DZNep tarafından SAK hidrolaz önleme basit bir kolorimetrik tekniği kullanılarak ölçüldü. Bu tahlillerin bir şematik temsilidir, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
1. Olgunlaşmamış Sivrisinek Geliştirme ve Sağkalım Tahliller
NOT: Bu kısım, sivrisinek larvaları gelişimi ve hayatta kalma etkileyen bir suda çözünür ilaç kullanımını açıklar.
- Hatch A. 28 ° damıtılmış su içinde C (dH 2 O) ve arka onlara 2. evre larvaları ile gambiae yumurta.
- Altı-çukurlu DNAz, RNAse içermeyen bir hücre kültürü plakası almak ve her bir oyuğa 10 mi DH 2 O dökün.
- 2. instar de sivrisinek larvaları seçin ve iyi başına 15 larva ekleyin. Plaka 2. evre larvaları eklemeden önce, sfazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine bunları ut.
- Renk kodlu bantlar ile Etiket kuyu deney rastgele. Her plaka (Şekil 2) test konsantrasyonu başına 2 kuyu etiketleyin.
- DH 2 O, 1 ml, 0.3 mg DZNep eritilmesi ile, 1 mM DZNep hidroklorür (MW = 298,73) stok çözeltisi hazırlayın 0.5 uM ve 5.0 uM bir nihai konsantrasyon elde etmek için etiketli çukurlara DZNep.HCl stok solüsyonu eklenir.
NOT: Stok solüsyonu 4 ° C'de saklanabilir Kısa vadede (bir ay 1 gün) veya -20 ° C için Uzun vadede (uzun bir ay) için ° C.
NOT: Yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda için stok solüsyonu ilave belirgin kuyulardan su hacmini değişmez. Bununla birlikte daha yüksek konsantrasyonları durumunda, bu bileşiğin herhangi bir gereksiz şekilde seyreltilmesinden kaçınmak için, larva ortam içinde çözülmesi için tavsiye edilir. - Her kuyuya pul balık yiyecek eşit miktarda ekleyin. Plaka Kapaks ve 28 inkübe Bir kuluçka ° C.
- 24-saatlik maruziyet süresinden sonra DZNep-işlenmiş ve işlenmemiş larva sivrisinekler için mortalite kaydedin. Çıkarın ve herhangi bir ölü larva atın. Tüm larvalar kalıp kadar her gün bu kaydı tekrarlayın veya pupa ve yetişkin olarak ortaya çıkar. Bunlar pupa kadar larva büyüklüğü her iki günde bir, örneğin, gün 0, 2, 4, 6, 8 kaydedin.
- Yeterli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak larva gelişimi ve mortalite verileri analiz.
NOT: Çubuk grafik, Microsoft Excel'de ölüm verileri temsil etmek için kullanılabilir. Çok Değişkenli Varyans Analizi (MANOVA) ilacın farklı dozlarının sivrisinek larvalarının önemli ölçüde farklı yaşam neden olmadığını ortaya çıkaracaktır gibi JMP ya da SPSS gibi bir yazılım ile seslendirdi.
Kadın Sivrisinekler Yapay Besleyiciye sayesinde İlaç yönetme 2. Verimlilik Testi
NOT: Bu bölümde kan a ilacın eklenmesini detaylarınd yapay besleyici sistemini kullanarak yetişkin dişi sivrisinekler için beslenme.
- Kontrol ve test kafes erkek ve dişi sivrisineklerin eşit sayıda yetişkin sivrisinek kafesleri ayarlayın. Kadın kadar kafesleri hem pamuk topları batırılmış% 10 şeker çözeltisi sağlayın (3-5 gün Anopheles gambiae için optimum olan) beslemek için hazırız.
- 2 saat önce kan beslemeye, kadın aç sağlamak için pamuk topları kaldırmak.
- Bir ters geniş alt cam huni (çap = 50 mm, uzunluğu = 70 mm) ve endüstriyel yapıştırıcı ile kapatılmış bir çevreleyen plastik oluşan iki yapay kan besleyiciler birleştirin. Girişi ve su çıkışı için bağlantı üzerinden iki besleyiciler 'çıkışları (çap = 10 mm) plastik borular (çap = 7 mm) takın. "Kontrol" ve iki besleyiciler Etiket "5 mcM DZNep."
- Beslenmesi için program kurmak, piyasada mevcut ısıtma elemanı kullanılması. "Menü" "Ayarlar" gidinve "Ayar Noktaları" seçeneğini seçin; Önceden yüklenmiş programlar görünecektir. "SP1" seçiniz ve 37 sıcaklığını ayarlamak ° C.
NOT: ısıtma elemanı uygulanan kan, sabit bir sıcaklıkta muhafaza edilmesini sağlar. Ek program ayarları farklı sivrisinek ya da böcek türleri için de kullanılabilir. - Su ile bir kova doldurun ve suya ısıtma elemanı batırmayın.
- Parafilm bir kare parça (50 mm x 50 mm) kesin ve ince bir zar film yapmak için streç. Parafilm ile yapay besleyiciler alt örtün. Parafilm (50 mm x 10 mm) başka bir parça kesin, onu germek ve besleyiciler kenarları mühür.
- Tüpler tarafından besleyiciler ve ısıtma elemanı bağlayan, sistemi monte edin. Tamamlandığında, sistem üzerinde geçiş ve "SP1" seçeneğini seçin. Basın sistemini başlatmak için "Enter".
NOT: Su 37 ısıtılmış alacak C ° ve bu sıcaklıkta muhafaza edilmiştir. - Inci Monitörsu kova bir termometre kullanarak su e sıcaklığı.
NOT: konnektörleri ve tüpler kan sıcaklığı 37 ° kalır, böylece sistem üzerinden sürekli bir su sirkülasyonu korumaya yardımcı ° C. - Herhangi bir kan dökülmemesi temizlemek için kullanılan olacak% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile bir düz dipli tepsiyi doldurun.
- Bir mikrosantrifüj tüpüne defibrile koyun kan 2 ml ekleyin. "Kontrol" olarak etiketleyin. "5 mcM DZNep" "5 mcM DZNep" etiketli deneysel tüp DZNep stok solüsyonu (adım 1.5 bakınız) .Add 6 ul olarak etiketlenmiş deneysel tüp için işlemi tekrarlayın yavaşça bunu birkaç kez ters yüz edilerek kan ve ilaç karıştırın. Oda sıcaklığında tüpü 10 dakika kuluçkalayın.
- Bir pipet kullanarak, uygun şekilde etiketlenmiş besleyiciler üstüne kontrol ve test kan 2 ilave edin. Çamaşır suyu çözeltisi içinde pipet atın. Karanlık bir çanta ile kafesi örtün ve f teşvik etmek periyodik kafesine havayı solumakbeslenmesi için emales.
- Sivrisinek yaklaşık 30 dakika boyunca besleme olsun. Besleme tamamlandıktan sonra, besleyiciler almak, ısıtma elemanı kapatın ve Parafilm şerit. Yaklaşık 5 dakika için ağartıcı çözeltisi içinde besleyici daldırın ve iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın.
- Besleyiciler çıkarın ve 48 saat için kafesleri şeker su ile pamuk topları koymak. Yumurtlama kolaylaştırmak için bir gecede kafeslerde su ve filtre kağıdı içeren bir yumurta yemek yerleştirin. Ilgili test veya kontrol konsantrasyonu her yumurta yemek etiketleyin.
- Stereo mikroskop altında yumurta sayısını ve yapısını ertesi gün yumurta yemek çıkarın ve inceleyin. Q-colors5 yazılımını kullanarak görüntüleri edinin. Yumurta sayısını. Test ve kontrol kafesleri elde edilen yumurtaların sayısı farkı analiz edin.
NOT: t-test yumurta sayısı (p ≤0.05) önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.
Sivrisinek Enzim Önlemesinin 3. Biyokimyasal Deneyiİlaç tarafından
NOT: Bu kısım, yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak DTNB kullanılarak, bir enzim aktivite deneyi tarif eder.
- DH 2 O 1 L HPO 4 Na 2 14.19 gr eklenerek bir 0.1 M Na-2 HPO 4 (dibazik sodyum fosfat) çözeltisi hazırlayın Daha sonra, DH 2 O, 1 L PO 4 NaH 2 13.79 gr eklenerek 0.1 M NaH 2 PO 4 (monobazik sodyum fosfat) bir çözelti hazırlamak
- PH 8.5, 0.1 M NaH 2 PO 4 çözeltisi, 0.1 M Na-2 HPO 4 çözelti titre edilir.
Not: Bu, 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) çalışma stok çözeltisi olacaktır. - % 0.3 Triton X-100 ilave edilerek 0,1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) içindeki bir homojen hale getirme çözeltisi hazırlayın.
NOT: homojenizasyon çözelti 4 O ° C'de saklanabilir - Prepare 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5), 10 ml SAK 6.15 mg çözülmesiyle 1.6 mM SAK (MW = 384,4) çözeltisi eklendi.
- 0,1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5), 10 ml DTNB 6.3 mg çözülmesiyle 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) çözeltisi hazırlayın. Kullanılana kadar buz üzerinde taze DTNB çözümü tutun.
- 1 ml dH 2 O. DZNep 0.3 mg çözülmesiyle 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) çözeltisi hazırlayın Daha sonra, dH 2 O. 0.002 uM 1.000 uM konsantrasyonlarda bir seri içinde 1 mM DZNep çözeltisi seyreltik
- DZNep tarafından SAH hidrolaz inhibisyonunu ölçmek için, sivrisinekler ham enzim özü hazırlanması: buz gibi soğuk 0.1 M NaH 2 PO 4 (pH 8.5) ihtiva eden% 0.3 Triton X-1 ml 10-olmayan kan beslenen yetişkin sivrisinekler homojenize 100, bir cam doku homojenleştirici kullanılarak. Bir 1.5ml mikrosantrifüj tüp Homojenat aktarın.
- 4 ° C'de 10,000 x g'de 5 dakika boyunca Homojenat santrifüj. Temiz süpernatant aktarın1.5 ml mikrosantrifüj tüp. SAK biyokimyasal analiz için enzim kaynağı olarak supernatant kullanın.
- Boş tedavisi için (yani, DZNep, enzim yok), 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB ve 100 ilave ul 0.1 M Na-2 HPO 96 oyuklu her bir gözeneğine 4 (pH 8.5), düz dipli mikroplaka.
- Kontrol (yani, DZNep) için, 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB ilave, 50 ul 0.1 M Na-2 HPO 4 (pH 8.5) ve 50 ul enzim bireye (SAH hidrolaz ham özüt elde edilmiş) kuyular.
- DZNep muameleler için, 50 ul 1.6 mM SAK, 50 ul 1.6 mM DTNB, tek tek oyuklara 50 ul enzim ve 50 ul seçilen DZNep konsantrasyonu ekleyin. Tedavi ve kontrol başına 4 çoğaltır hazırlayın.
- 96-çukurlu bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 20 saniye aralıklarla, 5 dakika boyunca 405 nm de SAK enzim örneklerin optik yoğunluk (OD) okuyun.
- Kontrol a gelen boş OD çıkarmand tedavi OD de her elde. Aşağıdaki denklemi kullanarak SAK hidrolaz aktivitesini kalan yüzde hesaplayın:% Artık Aktivite = (Tedavi OD / Kontrol OD) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, deneylerin bir şematik temsilidir; Bu makalede listelenen prosedürün çeşitli adımları açıklar. Protokol sivrisinek farklı yaşam evrelerinde dayalı olarak, burada ayrıntılı deneyler için takip edilecek belirli bir düzen vardır. Kullanıcı örnek durumuna bağlı olarak, aynı anda bir veya daha fazla deneyleri yapmak için seçebilirsiniz.
Şekil 2 olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma deneyleri için ayarlanmış plaka gösterir. Test konsantrasyonları ve kopya sayısı, kullanıcının ihtiyaçları ve uyuşturucu durumuna bağlı olarak değişebilir. Olgunlaşmamış sivrisinek deneyi için, DZNep 1 mM stok çözelti, 0.5 uM ve bir ilaçsız popülasyonu içeren oyuklara sahip bir kontrol tava ile birlikte 5 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için sivrisinek içeren su ilave edildi. Deney göstermiştir ki daha larva ve pupa GözetimDZNep işlenmiş oyuklarda göre, kontrol oyuklarında Ived.
Şekil 3 deney sırasında sıtma sivrisinek genel hayatta kalma üzerine DZNep etkisini göstermektedir. Sonuçlar epigenetik ilaç DZNep büyüme ve gelişmeyi bastırır ve olgunlaşmamış sivrisineklerin mortalite uyardığını ortaya koymuştur. 5 uM maruz kişiler, çok sayıda farklı olarak 8. günde ölmüştür ise 0.5 uM maruz sivrisinek çoğunluğu, deney 10. günde öldü, kontrol tedavisi (ilaç yok) olarak sivrisinekler ölüm kalmıştır etkilenmeyen ve çeşitli deney gününde 8 yetişkin olarak ortaya çıkmıştır. Bir ters ilişki ilaç konsantrasyonu ve sivrisinek vücut büyüklüğüne (Şekil 4) arasında gözlenmiştir.
Şekil 5, sivrisinek doğurganlık üzerinde DZNep etkisini göstermektedir. Kan DZNep içeren beslenen yetişkin dişi sivrisinekler önemli bir reductio sergiledin canlı yumurta sayısında. Şekil 5A kontrol kafes (ilaç yok) elde edilen yumurta gösterir. Şekil 5B testi kafesinden elde edilen yumurta gösterir. Test kafesine elde edilen yumurtaların büyük bir kısmı koyu renkli ve normal kan beslenen dişi sivrisinekler (Şekil 6) elde edilen yumurtaların karşılaştırıldığında yüzer parçalar (exochorion hava dolu açılımları) yoktu. koyu renkli yumurta ile birlikte yüzen olmaması exochorion oluşumunda epigenetik potansiyel rolünü gösterir.
Şekil 7 yetişkin erkek ve dişi sivrisinekler sıtma SAK hidrolaz aktivitesi üzerine DZNep etkisini göstermektedir. OD bir DZNep bağımlı azalma DZNep SAH hidrolaz aktivitesi inhibe ettiğini gösteren kontrol muamelesi (ilaç yok) ile karşılaştırıldığında her bir ilaç tedavisi için görülmektedir.
Şekil 1:. Sıtma sivrisinekler üzerinde bir epigenetik ilaç kullanan tahlillerin şematik gösterimi düzeninin sol kısmı olgunlaşmamış sivrisinek kullanarak geliştirme ve hayatta kalma deneyleri gösterir. orta kısmı yetişkin kadın için ilaç, kan-besleme yoluyla doğurganlık deneyi göstermektedir. sağ kısmı ilaç ile enzim inhibisyonu biyokimyasal deneyi göstermektedir.
Şekil 2: Levha olgunlaşmamış sivrisinek geliştirme ve hayatta kalma tahlil tasvir "C" işaretleri kontrol kuyuları Etiket.. Etiket "0,5" 0,5 uM DZNep ile kuyu gösterir. Etiket "5", 5 uM DZNep ile kuyu gösterir.
Şekil 3: sıtma sivrisinek hayatta kalma ile ilgili DZNep etkisi. konsantrasyon-bağımlı bir ölüm olgunlaşmamış sivrisinek ile görülmektedir.
. Şekil 4.:. 0.5 uM DZNep (boyut = 4 mm) (C), larva ile muamele olgunlaşmamış sivrisinekler üzerinde DZNep Etkisi (A) Kontrol tedavisi (boyut = 5 mm) larva (B), larva 5 ile işlemden geçirildi mcM DZNep (boyut = 3 mm). Bütün larvalar deney aynı gün ölçüldü.
Şekil 5:. Kontrol muamelesi sivrisinek doğurganlık Yumurta tabağına DZNep Etkisi (ilaç yok) sivrisinek yumurta çok daha büyük bir sayı içerir, (A) iştigal5 mcM DZNep (B) ile tedavi kadın yumurta yemek ile kırmızı.
Şekil 6: Bir mikroskop altında görülen sıtma sivrisinekler yumurta yapısına DZNep Etkisi. Kontrol tedavisi (A) Yumurta (ilaç yok) sivrisinek yüzen ve rozet gibi meclisleri. (B) Yumurta yüzen ve rozet benzeri derlemeler eksikliği DZNep 5 uM ile tedavi sivrisineklerden gösterilecek.
Şekil 7:. Sıtma sivrisinek DZNep tarafından SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep kontrol muamelesi (ilaç yok) ile karşılaştırıldığında, OD bir azalmaya neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün başarılı bir uygulama için hayati birkaç adım vardır. Larva deneyi için, bakım doğru etiket ve her test konsantrasyonu çoğaltmak için alınmalıdır. Test örnekleri rastgele ve ilgili test kuyuları ilacın belirlenen miktarda ilave kurmak bu deneysel önemli bir parçasıdır. 96 oyuklu bir mikro-2 nci instar sivrisinek larvaları eklemeden önce, her bir larva fazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine konabilir. Kuruma önlemek için, larva hemen forseps bir künt çifti kullanılarak mikroplak kuyularına transfer edilmelidir. Bu her bir mikro-su hacmini sağlar ve beklendiği gibi, ilacın konsantrasyonunun devam etmektedir. Vücut uzunluk ölçüm larvaları aktarırken, bu sabit tutmak amacıyla, birkaç dakika süreyle buz üzerinde larvaları konulması tavsiye edilmektedir. Farklı bir bileşik için bu protokol adapte zaman bakım her oyuğa ilave stok çözeltisi miktarını belirlemek için önlem alınmalıdıriyi. Bu gibi durumlarda, bu direkt olarak öncesinde her bir mikro-larvaları ilave su içinde bileşik hesaplanan miktarının çözünmesi için daha iyi olabilir.
Kan tahlilleri beslenme için, sivrisinek deney öncesi şeker suya en az 2 saat kaldırarak uygun hasret hayati önem taşıyor. Aksi takdirde eksik beslenme ve yetişkin dişi yumurta üretimine küçük etkiye neden olabilir. DZNep çözmek için bir kaç dakika sürer gibi iyice karıştırılması ve kandaki ilaç düzgün dağılımı, hem de önemli bir adımdır. İlaç tedavi edilen kan hemen beslenirse, DZNep eşit sivrisinek sisteminde ve almaz. Kuvvetle defibrile kan daha iyi sonuçlar için (ekstraksiyon tarihten itibaren bir haftadan az yani) taze olması tavsiye edilir.
Ilgi konusu bir bileşiği ile, bir biyokimyasal deneyde başarısı için kritik öneme çok aşama bulunmaktadır. Bu proto kullanılan her stok solüsyonu konsantrasyonları col DZNep için optimize edilmiştir. Farklı bir bileşik için protokol uyarlamak için, farklı pH bir dizi test öneririz, SAK, DTNB konsantrasyonları ve böcek örnek boyutları en güvenilir sonuçları belirlemek için. Ham enzim özütü hazırlanması, bu prosedürde en zaman alıcı bir aşamadır. Homojenat hazırlanması sırasında emme okuma engelleyebilir yüzer maddesinde mevcut olan lipidler gibi, en fazla 10 yetişkin sivrisinekler kullanılması tavsiye edilir. Bu sorunu önlemek için, (bir tek kanal mikropipet kullanarak) süpernatant lipidlerin üst tabaka adımı 3.8 sonra kaldırılabilir. Üst sıvı temiz bir mikrofüj tüpüne aktarılmıştır gerekir. Adım 3.8 kalan viskoz lipitleri atmak tekrar edilmelidir. kalan berrak yüzer tüm tüpler bir araya toplanmış ve yavaşça karıştırılmalıdır. Bir çok-kanallı bir pipet kuyularında SAK eklemek için yüksek verim için kullanılabilir. DTNB deneyinde bir göstergesi olarak kullanılmaktadır ve son hazırlanır ve buz üzerinde tutulmalıdır.
nt "> Bu protokol sivrisinek farklı yaşam evrelerinde bir bileşiğin etkilerini test etmek basit adımda ile kullanıcıya sunar. Ancak, bu protokolün kullanımına bazı kısıtlamalar. Bu teknik DZNep suda çözünürlüğü öncelikle bağlıdır vardır. Olgunlaşmamış larvaları çevreleyen ortam içinde çözüldü ilaca maruz kalmaktadır. bileşiği Eğer test edilen sulu ortam içinde çözünür olan, bu protokol için daha az etkili olabilir. doğurganlığını test için, defibrile koyun kanı içinde çözülmüş ilacın yetişkin kadın tabi tutuldu. This bir laboratuar (yani, sivrisinek beslenmesi için fare veya kobay kullanır) doğrudan memeli kan sivrisinek koloniler rears eğer mümkün olmazdı.Bu makalede belirtilen farklı tahlillerin kombine böcekler üzerinde bir suda-çözünür bileşiğin etkisini test etmek için yeni bir yol sağlar. DZNep çok kanser araştırmaları için, in vitro olarak, hücre çizgileri ile ilave edilir; Bununla birlikte, bu protokol u sağlarser in vivo bir böceğin çeşitli yaşam evrelerinde herhangi etkilerini incelemek için. Buna ek olarak, aynı zamanda toksikolojik analizler için adım-adım kurallarına araştırmacı sağlar. Mevcut literatürde, bilgi böcekler üzerinde epigenetik ilaçların etkileri konusunda sınırlıdır. Örneğin, DZNep kullanarak, potansiyel böcek kontrol maddeleri gibi diğer epigenetik ilaçlar ya da yeni bileşikleri keşfetmek yönelik bir ön koşul adımı olarak kullanılabilir bir işlem sağlar. Bu protokol, sıtma sivrisinek için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu DZNep etkisi ya da başka bir sivrisinek ya da böcek türlerinde söz konusu herhangi bir suda çözünür bileşik, test etmek için adapte edilmiş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
