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Biology

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en doi: 10.3791/52043 Published: November 13, 2014

Summary

El músculo esquelético es esencial para la locomoción y es la tienda principal proteína de los cuerpos. Se describen las medidas de salud musculares dentro de C. elegans. Los posibles cambios en la estructura y la función muscular se evaluó a través de las buenas prácticas agrarias localizadas y colorantes catiónicos.

Abstract

El músculo es un tejido dinámico que responde a los cambios en la nutrición, el ejercicio, y el estado de la enfermedad. La pérdida de masa muscular y la función con la enfermedad y la edad son cargas importantes de salud pública. Actualmente entendemos muy poco sobre la regulación genética de la salud muscular con la enfermedad o la edad. El nematodo C. elegans es un modelo establecido para la comprensión de la regulación genómica de los procesos biológicos de interés. Músculos de la pared del cuerpo de este gusano muestran un alto grado de homología con los músculos de las especies de metazoos superiores. Desde C. elegans es un organismo transparente, la localización de GFP a las mitocondrias y sarcómeros permite la visualización de estas estructuras en vivo. Del mismo modo, la alimentación de animales colorantes catiónicos, que se acumulan basa en la existencia de un potencial de membrana mitocondrial, permite la evaluación de la función mitocondrial in vivo. Estos métodos, así como la evaluación de la proteína muscular homeostasis, se combinan con la evaluación de la función muscular animal completo, en forma de ensayos de movimiento, para permitir la correlación de defectos sub-celulares con medidas funcionales de rendimiento muscular. Así, C. elegans proporciona una potente plataforma con la cual evaluar el impacto de las mutaciones, caída de genes y / o compuestos químicos sobre la estructura y la función muscular. Por último, como GFP, colorantes catiónicos, y los ensayos de movimiento se evalúan de forma no invasiva, los estudios prospectivos de la estructura y la función muscular pueden llevar a cabo en todo el curso de la vida y esto en la actualidad no pueden ser fácilmente investigaron in vivo en cualquier otro organismo.

Introduction

El músculo es un tejido multifuncional, muy apreciado por su papel en la locomoción, el apoyo postural y el metabolismo. El desarrollo y mantenimiento de músculo sano requiere la coordinación de múltiples procesos y componentes celulares. Ya sea a través daño o enfermedad, puede ocurrir la desregulación, resultando en la estructura muscular alterada y / o función. Declive asociado a la edad en la función muscular presenta una importante carga para los presupuestos de salud en el mundo occidental, ya que el músculo masa 1,2 y particularmente la fuerza muscular y la resistencia 3.5 se correlacionó negativamente con la mortalidad. La medición de los aspectos relacionados con el deterioro de la función muscular, tales como la función mitocondrial alterada o perturbación sarcómero, se puede lograr una mejor comprensión de los mecanismos que sustentan el desarrollo muscular y la salud en general.

Elegans C aenorhabditis (C. elegans) es una microscópicos bes nematodost sabe porque fue el primer organismo multicelular tener la totalidad de su genoma secuenciado 6, el primero en tener los genes silenciados mediante RNAi 7, y la única metazoos tener sus todo linaje de células 8 y 9 neuroanatomía determinado. C. elegans fue propuesto por primera vez como un modelo para el estudio del control genético de la conducta en 1974 por Sydney Brenner 10 y la importancia de esto y el trabajo posterior fue reconocida con el primero de los tres premios Nobel otorgados a C. elegans investigadores. Aproximadamente el 35% de C. elegans genes ortólogos han identificado en seres humanos, con C. elegans ser un organismo clave utilizada para entender el control genético del desarrollo muscular 11. Casi todos los genes en el genoma de C. elegans puede ser derribado mediante RNAi 7,12. Por lo tanto, derribando los genes en el músculo completamente desarrollado, los componentes genéticos que contribuyen a la regulación de la salud muscular puede ser investigado con relativa sencillez 13.

La capacidad combinada de usar RNAi, mutantes, y compuestos químicos hace que C. elegans un sistema principal de la exploración de la regulación genética 7,14,15 de la estructura y función de los músculos con 16 años de edad y en modelos de enfermedad 17. El impacto de la caída de genes, mutación y / o la exposición a compuestos químicos sobre la estructura y / o función muscular puede medirse a través de múltiples aspectos. Aquí se describen brevemente las técnicas simples para la evaluación de C. elegans estructura y función muscular, muchos de los cuales se puede utilizar en estudios prospectivos de la salud del músculo.

El desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP) 18 ha permitido la visualización tanto de la localidad de proteínas específicas y la estructura general de los orgánulos en C. elegans. Aquí le explicamos cómo las buenas prácticas agrarias expresó especicamente dentro del cuerpo músculo de la pared mitocondrias, núcleos, o sarcómeros se pueden utilizar para determinar si la distrofia de estas estructuras subcelulares está presente. Como estructura no es siempre un sustituto fiable para la función, también explicamos cómo el uso de colorantes catiónicos en vivo permite la evaluación del potencial de membrana mitocondrial alterada dentro de los músculos. Cuando se utilizan los colorantes en combinación con GFP, que permiten el estudio de la arquitectura y de la función de una manera temporal durante toda la vida. Por último, también explicamos cómo la homeostasis de proteínas en el músculo puede ser evaluado y cómo todas estas medidas se puede utilizar para correlacionar los cambios en la salud músculo animal entero mediante el uso de ensayos de movimiento. Estas técnicas, combinadas con caída de genes, mutaciones, y / o compuestos químicos proporcionan un arsenal de gran alcance para el estudio de cómo los genes o compuestos específicos influyen en la salud del músculo in vivo. Los paralelos en la estructura, el metabolismo y la función muscular bruta de entre C. elegans ymamíferos significan C. elegans es un organismo modelo excelente para la comprensión de la regulación de los músculos en los organismos superiores, incluidos los humanos.

Protocol

1. Cepas, Cultura, y Microscopía

  1. Manejar y mantener cepas de C. elegans como anteriormente descritos 19. Las cepas están disponibles en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC).
    NOTA: Las cepas utilizadas en estos experimentos fueron CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3-lacZ :: Ngfp; Pmyo-3 :: Mtgfp) I; él-8 (e1489) IV) con proteínas de fusión GFP localizados a las mitocondrias y núcleos; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); UNC-54 :: lacZ V) con proteínas de fusión GFP localizados en el aparato contráctil y PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); UNC 54 :: lacZ) V) con proteínas de fusión β-galactosidasa localizadas en el citosol.
  2. Experimentos de ARNi completos tal como se describe anteriormente para los experimentos de ARNi multigeneracionales 13 y obtener bacterias RNAi de la secuencia verificados biblioteca ORF-RNAi construido por Marc Vidal et al. 12.
  3. Construir las cepas que contienen <em> CCIS 4251, jls01 o CCIS 55 usando técnicas estándar 20. Utilice estos transgenes para crear una cepa para evaluar la estructura de la red mitocondrial, organización miosina o el estado de Proteostasis, respectivamente. Cruzar las cepas en un mutante que buscabas en uno de estos compartimentos subcelulares se desea en cada animal.
  4. Utilice el inhibidor de PtdIns-3-quinasa, LY-294002 (LY) como se describió previamente 21. Brevemente, añadir LY-294002 a una concentración final de 160 mM en la parte superior de las placas-OP50 sin semillas secas NGM.
  5. Captura todas las imágenes utilizando un filtro de las buenas prácticas agrarias para experimentos basados ​​en las buenas prácticas agrarias y un microscopio con un filtro de paso triple, que permite obtener imágenes de los canales rojo, verde y azul al mismo tiempo para evaluar el potencial de membrana en vivo con C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, comúnmente comercializado como MitoTracker Red CMXRos. Llevar a cabo el análisis de imágenes y la preparación figura en el software de procesamiento de imágenes.

  1. Un mínimo de 1 día antes es necesario, haga tampón M9 - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42.27 mM Na 2 HPO 4, NaCl 85,56 mM (concentraciones finales), y esterilizar en autoclave. Una vez enfriado a 45 ° C, añadir estéril MgSO 4 a 1 mM después de la esterilización en autoclave para evitar la precipitación 22. Deje que se enfríe la M9 a 4 ° C y alícuota en tubos de 50 ml.
  2. En el día del experimento, añadir 3 ml de tampón M9 a una sola placa de 9 cm con altos números de larvas L1. Lavar la placa varias veces por aspiración el líquido M9 y pipeteado contra la superficie del agar con la placa realizada en un ángulo.
  3. Lavar las de L1 de la placa y luego transferir el M9 a un tubo de ensayo de 10 ml con una pipeta.
  4. Dejar durante 2,5 minutos para permitir que el adulto más grande y animales etapa larval posteriores a caen al fondo del tubo de ensayo y los animales L1 más pequeños permanecen cerca de la top del tampón M9.
  5. Retire las 500 l de M9 en el tubo de ensayo con una pipeta. Entonces pipetear las larvas L1 M9 que contiene a una nueva placa de NGM se sembró con 500 l OP50 bajo un microscopio de disección.
  6. Por lo general, el objetivo de transferir ~ 200-300 larvas L1 por placa. Monitorear placas todos los días de la edad adulta y, si es necesario, recoger los animales en placas OP50 NGM frescos para evitar OP50 fuente de alimento se consume.
    NOTA: Esto es por lo general 1-3 gotas de M9 utilizando una pipeta P1000, aunque esto varía en gran medida dependiendo de la cantidad de la L1 en la plancha original.
  7. Si se desean los estudios prospectivos en los animales individuales, una vez que los animales llegan a la edad adulta, recoger animales individuales para separar NGM placas sembradas. Animales de Transferencia de cada 24 a 48 horas para separar a partir de animales de larvas.

3. Movimiento Ensayos 19

  1. Un mínimo de 2 horas antes de comenzar la experimentación, eliminar una parte alícuota de 50 ml de M9 y permitir que se equilibre a la temperatura ambientebibliografía.
  2. Escoja un solo animal adulto en el buffer M9 50 l en un portaobjetos de microscopio.
  3. Cuente el número de curvas del cuerpo izquierda y hacia la derecha en 10 segundos, donde uno hacia la izquierda y una curva hacia la derecha es igual a un accidente cerebrovascular.
  4. Repita el conteo de golpes del cuerpo para dar un total de por lo menos 5 mediciones a partir del cual se puede tomar un promedio. Multiplique estas cifras por seis para dar la tasa de movimiento por minuto.
  5. Con una pipeta, transferir el animal de nuevo a la placa de Petri. Este método permite la medición temporal de movimiento durante toda la vida útil en C. elegan s.

Figura 1
Figura 1: ensayos de movimiento. Una vez que los gusanos se recogen en el búfer, uno hacia la izquierda (A) y uno hacia la derecha (B) curva se suman para dar un movimiento completo(Accidente cerebrovascular).

4. Obtención de imágenes de mitocondriales Redes y sarcómeros en músculo de la pared del cuerpo

  1. NOTA: El mismo protocolo se aplica para la imagen tanto de la mitocondria y sarcómeros.
  2. Sincronizar gusanos como se describió previamente (Sección 1) y crecer durante 48-60 horas a 20 ° C cuando van a llegar a la edad adulta joven.
  3. Escoja 20 gusanos (representativas de la placa) de las placas a 20 l M9 en un portaobjetos de microscopio.
  4. Aplicar una hoja de cubierta y proceder a la imagen usando un microscopio de fluorescencia bajo un filtro de las buenas prácticas agrarias (460-500 nm, azul luz de excitación) a 40 aumentos.

5. Evaluación de Potencial de membrana mediante el uso de un ensayo in vivo de Acumulación con MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Sincronizar CB5600 (Sección 1), todos los etiquetados con las buenas prácticas agrarias en las mitocondrias de los músculos, y crecer hasta la edad adulta temprana en NGM contiene OP50 por 48-60 horas a 20 ° C.
  2. Añadir 100 ml de DMSO a la alícuota de 50 g de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para hacer una solución madre de 940.692 M.
  3. Tome 1 l de la solución madre de 940.692 M y resuspender en 199 l M9 para crear una solución de trabajo de 4,70 m (4,70346 m). Preparar esta en marrón tubos de 1,5 ml porque C 32 H 32 Cl 2 N 2 O es fotosensible.
  4. Preparar 20 ml de alícuotas de los 4,70 M de solución (20 gusanos adultos por 20 l alícuota) de trabajo.
  5. Escoja 20 animales adultos en 20 l de 4,70 M C 32 H 32 Cl 2 N 2 O en los marrones tubos de 1,5 ml. Incubar a 20 ° C durante 1 hora.
  6. Después de la incubación de 1 hora, añadir 1 ml M9 a los marrones tubos de 1,5 ml que contienen los gusanos, se centrifuga a 2.000 g durante 10 segundos y luego eliminar el sobrenadante. Repita este paso de lavado antes de resuspender el sedimento de gusano y la transferencia de los 20 μ restantesl (que contiene los gusanos) a una diapositiva para formación de imágenes.
  7. Tomar imágenes de la mitocondria con un aumento de 40X utilizando un filtro de paso triple, que permite la visualización tanto de los canales rojo, azul y verde simultáneamente. Imaging utilizando el filtro de paso de triple muestra co-localización de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O con GFP localizada en las mitocondrias que aparecen como naranja.
  8. Después de haber tomado una imagen de la mitocondria de naranja, foto-blanquear el animal durante 10 segundos utilizando la luz de longitud de onda 540/25 nm en ajustes máximos con todos los filtros removidos. Esto blanquear el rojo dentro de las mitocondrias y revelar la GFP mitocondrial solo para confirmar colocalización en las mitocondrias del músculo.

6. Evaluación de la Degradación de proteína muscular en C. elegans

  1. Sincronizar PD55s (o cualquier cepa que contiene el transgén lacZ) en placas de NGM sembraron con OP50 (Sección 1). Crecer a la edad adulta de 48 a 60 horas a 20 ° C.
  2. Escoja 20 gusanos adultos en 20 l ddH2O en un portaobjetos de microscopio. Tenga cuidado para tratar de recoger sólo el gusano y no cualquier bacteria con la selección. Etiquetar el portaobjetos de un microscopio en un lápiz.
  3. Coloque en el desecador durante 30 min se sequen y agrieten la cutícula de los animales. Asegurar un sello hermético en el desecador con grasa alrededor del sello.
  4. Compruebe la desecación ha sido eficaz bajo un microscopio de disección (Figura 2).
  5. Sumergir el portaobjetos en acetona enfriada con hielo durante 3,5 min y después se dejan el portaobjetos de microscopio sobre una toalla de papel a temperatura ambiente durante 15 min para permitir que la acetona en la diapositiva se evapore. En este punto descongelar el tampón de X-gal y la oxidación y permitir equilibrar a temperatura ambiente.
  6. Añadir 2 l X-gal a 100 l de tampón de oxidación y agitar suavemente para asegurar esto es homogénea. Este es el maestro de la mezcla tampón de X-gal / oxidación.
  7. Añadir 20 l de la mezcla maestra de amortiguación X-gal / oxidación para cada uno oárea riginal de 20 gusanos. Inspeccione bajo un microscopio de disección para asegurar la mezcla maestra cubre por completo todos los animales totalmente. Inclinar suavemente el portaobjetos de un microscopio para mover la mezcla maestra sobre las áreas donde los animales no están cubiertos.
  8. Coloque el portaobjetos de un microscopio en una cámara de humedad durante 1-2,5 horas a 20 ° C. Animales de imagen cuando un color azul oscuro está presente en los músculos de la pared del cuerpo de los animales de control. Evaluar los animales de control bajo un microscopio de disección cada 15 minutos para determinar cuando los animales deben ser reflejados.

Figura 2
Figura 2: Evaluación de la degradación de la proteína muscular usando ensayos de β-galactosidasa. (A) Los animales que contienen un transgén lacZ se recogen de las placas de Petri a 20 l ddH 2 O en un portaobjetos de microscopía (B). Los animales son desecado y se convierten en fracturado (D). Una vez que la acetona se evapora, se añade la mezcla maestra tampón de X-gal / oxidación (E). El desarrollo del color azul en los animales de control se evalúa a intervalos de 15 min (FL) a partir de t = 0 min (F) hasta que un color azul oscuro se obtiene a través de la longitud de los animales (L). Imágenes de gusanos se toman con un aumento de 2,5 veces en AE y 8X en FL. Aleja en C, D, F, G y L son 4X el aumento original.

Representative Results

Movimiento Los ensayos para cuantificar defectos Movimiento

Descenso Movimiento es un buen predictor de mortalidad en C. elegans 16, con una disminución de las tasas que indican problemas con el sistema neuromuscular. Cambios en el movimiento, como se evaluó por ensayos de movimiento, pueden resultar de ARNi contra un gen específico o tratamiento farmacológico (Figuras 3-5) o en animales mutantes 13, 23. Una disminución en el movimiento puede resultar de desarrollo alterado por ejemplo después de golpe abajo de los genes en el desarrollo de transporte de electrones que codifican complejo I, III, IV o V 24. Además, las intervenciones específicas pueden ser probados en sólo adultos C. elegans con el fin de investigar el efecto sobre la fisiología post-desarrollo. Por ejemplo, los animales tratados con RNAi contra unc-112, que codifica la C. elegans orthologue de kindlin-1 que se localiza a la integrina que contienecomplejos de unión de músculos (Figuras 3 y 4), o gas-1, que codifica un componente del complejo I de la cadena de transporte de electrones (Figura 4), ​​muestran una reducción progresiva en el movimiento versus control 48 a 72 horas después de la edad adulta. Esto puede ser indicativo de problemas con la fisiología del músculo. Del mismo modo, una pérdida de movimiento 24-72 horas se observa en la respuesta al tratamiento de los adultos normalmente desarrolladas con el tratamiento con el inhibidor de PI3K LY-294002 (Figura 5). También es posible para probar el efecto de un segundo tratamiento RNAi, la mutación o de una droga en la restauración de movimiento en animales que presenten reducida movimiento en respuesta a una intervención inicial. Por ejemplo, UNC 112 mutantes muestran una reducción cuantificable en movimiento en comparación con animales de tipo salvaje que se atenúa en presencia de una segunda mutación en dim-1 13. Por lo tanto, los ensayos de movimiento pueden identificar tanto las intervenciones que alteran neuromuscudesarrollo lar y / o función, así como los que mejoran y / o restaurar la función neuromuscular.

Evaluación de Sarcómero Interrupción

Habiendo identificado un defecto de movimiento, a menudo es deseable determinar si la causa del defecto movimiento puede explicarse por problemas dentro de los nervios, músculos, o ambos. Sarcómeros son los varios complejos de proteínas dentro de los músculos que permiten la contracción y así forzar la generación y el movimiento. Por animales que utilizan proteínas de fusión que expresan GFP miosina localizados en el aparato contráctil, el grado de perturbación de los filamentos de miosina y sarcómeros se puede observar relativamente no invasiva y de forma prospectiva en los animales individuales a través del desarrollo y / o la edad adulta. Animales de tipo salvaje muestran sarcómeros dispuestos que aparecen verdes como múltiples líneas rectas paralelas dentro de cada músculo del cuerpo de la pared (Figura 3). La interrupción de estas matrices normales puede ser relativamente menor consarcómeros dispuestos aparecen fusionar en lugar de permanecer en paralelo. Este fenotipo, visible con unc-112 RNAi en t = 24 h o 48 h (Figura 3), es comparable a la transmisión de Z-línea de sitios de unión de actina en el músculo de los mamíferos. Del mismo modo, pequeñas porciones de las matrices pueden colapsar o pueden desaparecer por completo tal como tratamiento con unc-112 RNAi en t = 48 h o t = 72 h (Figura 3). La presencia de defectos del sarcómero en el músculo de los animales que muestran un defecto de movimiento (Figura 3) es suficiente para explicar el defecto movimiento pero no necesariamente descarta otros problemas con los músculos, los nervios, y / o en otros tejidos en respuesta a una intervención .

Evaluación de la estructura mitocondrial Red

En la presencia de un defecto de movimiento a veces es deseable para examinar el músculo para otros defectos que pueden causar o contribuir al movimiento deperfecta. Las mitocondrias proporcionan la mayor parte de la energía celular y la disminución de movimiento puede ser el resultado de la reducción de la provisión de ATP, reduciendo la energía disponible para la contracción muscular. Así, la estructura de las mitocondrias puede ser examinado para detectar anomalías. Es importante no para anestesiar a los animales con azida de sodio ya que induce la rápida fragmentación mitocondrial; animales en estos experimentos fueron inmovilizados por la presión aplicada por la hoja de la cubierta. Dentro de tipo salvaje C. elegans músculo de la pared del cuerpo, las mitocondrias están contenidas dentro de las redes organizadas (Figura 4) y existe la mitocondria y la función como un retículo 25. La interrupción de la red de las mitocondrias se presenta como la fragmentación de la red (gas-1 RNAi, la Figura 4B) 26. La fragmentación puede llegar a ser tan grave que hay apariencia de redes organizadas permanece como el tratamiento con UNC-112 RNAi (Figura 4 B y C) 13. Como with interrupciones en la estructura del sarcómero, defectos en el músculo estructura mitocondrial en animales que muestran un defecto de movimiento pueden ser suficientes para explicar el defecto movimiento, pero esto no excluye necesariamente a otros problemas con los músculos, los nervios, y / u otros tejidos. Por ejemplo, unc 112-mutantes 13 y el tratamiento con unc-112 RNAi (Figuras 3 y 4) de visualización tanto sarcómeros interrumpidos y rompen la estructura mitocondrial.

Evaluación de la función mitocondrial en Vivo

El potencial de membrana mitocondrial determina la capacidad de las mitocondrias para crear la fuerza motriz de protones y generar ATP 27, por lo tanto, la capacidad de evaluar el potencial de membrana mitocondrial in vivo indica la capacidad de ese animal para producir ATP. Como interrupciones estructurales mitocondriales pueden o no alterar la capacidad funcional mitocondrial, puede ser desirable para evaluar la función mitocondrial en animales que presenten estructura mitocondrial alterada. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O se acumula en la mitocondria, de todos los tipos de células, donde un potencial de membrana está presente y las manchas de la mitocondria 28 (Figura 4C). Para evaluar específicamente la función mitocondrial en el músculo, se puede utilizar C 32 H 32 Cl 2 N 2 O y GFP marcado mitocondrias del músculo para demostrar los efectos de una intervención específicamente en las mitocondrias del músculo (Figura 4C). Por ejemplo, la pérdida de potencial de membrana mitocondrial tras el tratamiento con unc-112 RNAi impide C 32 H 32 Cl 2 N 2 O de entrar en la matriz. Por tanto, las mitocondrias muestran poca o ninguna tinción con rojo de la mitocondria, además de la GFP etiquetado de las mitocondrias (Figura 4C). Photo-blanqueo también se puede utilizar para confirmar que el observadomitocondrias son específicamente aquellos en el músculo (Figura 4C). Identificación de una reducción de la capacidad para producir ATP es suficiente para dar cuenta de un defecto de movimiento observado, pero no descarta que otros problemas dentro de los músculos, los nervios, y / u otros tejidos. Independientemente, como la reducción de la capacidad de producción de ATP está asociada con estados de enfermedad en los seres humanos y el envejecimiento 29 30, la identificación de un defecto de este tipo en respuesta a una intervención proporciona una plataforma para el cribado de compuestos y / o tratamientos de ARNi que mejoran la capacidad de producción de ATP y éstos pueden entonces estudiar más a fondo para el potencial terapéutico.

Evaluación de la degradación de proteínas

En la presencia de un defecto de movimiento y sarcómeros y mitocondrias normales a veces es deseable para examinar el músculo para otros defectos que pueden causar o contribuir al defecto movimiento. La capacidad de mantener la homeostasis de la proteína es una firma de nimal de salud, mientras que una reducción en la síntesis de proteínas y / o un aumento en la degradación de proteínas es una consecuencia del envejecimiento 31 y múltiples estados de enfermedad 32,33. Por lo tanto, puede ser deseable para examinar músculos de los animales con un defecto de movimiento para la homeostasis proteína alterada. Esto se puede lograr a través de la evaluación de los niveles de proteínas musculares citosólicas. El uso de las proteínas codificadas transgénicamente permite la evaluación del músculo Proteostasis específico. Por ejemplo, el uso de animales que contienen β-galactosidasa, fusionado a una porción N-terminal de la miosina, que se sintetiza bajo el control de un promotor y potenciador de la miosina del músculo permite la evaluación citosólica contenido de proteína 19. La presencia de la mancha azul en adultos de tipo salvaje demuestra la presencia de β-galactosidasa activa y la ausencia de degradación de la proteína citosólica patológica. Una pérdida de la tinción en respuesta al tratamiento sugiere la degradación de proteínas patológica se está produciendo (Figura 5 13,14,19. Por ejemplo, de tipo salvaje animales no tratados presentan una intensa mancha azul de 72 horas después de la edad adulta, mientras que LY-249002 animales tratados muestran una falta de tinción (Figura 5). Al igual que con defectos en la estructura del sarcómero y la función mitocondrial, la presencia de la degradación de proteínas musculares patológica es suficiente para dar cuenta de un defecto de movimiento observada pero no necesariamente descarta otros problemas con los músculos, los nervios, y / u otros tejidos.

Figura 3
Figura 3: (A) UNC-112 RNAi causa un defecto importante movimiento en t = 72 h (B) Evaluación de la estructura vistió A-banda dentro de los músculos de la pared corporal.. En wt, A-bandas en el músculo aparecen como líneas rectas en la edad adulta joven (t = 0 h) y se mantienen en gran medida uniforme hasta más allá de las 72 horas de la edad adulta (véase peso de zoom). unc-112 ARNi hace que los sarcómeros perder arquitectura en pequeñas áreas de el músculo (t = 24 h), se derrumbó y sarcómeros desaparecidos (t = 48 h), agregación (panel superior t = 72 horas y zoom) y la pérdida de la linealidad de sarcómeros (panel inferior t = 72 h) y el zoom. Las barras de escala representan 25 M y zooms son 2,5 veces.

Figura 4
Figura 4: (A) UNC-112 o gas-1 RNAi causa un defecto movimiento (B) Evaluación de la estructura mitocondrial en músculo de la pared del cuerpo.. Las mitocondrias en el músculo aparecen como líneas rectas en red en la edad adulta joven (en peso). El tratamiento de los animales con UNC-112 RNAi produce mitochondrfragmentación ial como ya se observó entre las 24 horas y las 72 horas de la edad adulta (zooms y flecha) 13. Asimismo, RNAi contra gas -1 resultados en la fragmentación de las redes mitocondriales como anteriormente observaron 26. Estos están presentes como pequeñas lagunas en la red mitocondrial en t = 24 horas y el progreso a la desorganización generalizada en 72 horas (ver zoom y flecha). (C) Evaluación del potencial de membrana mitocondrial in vivo. En los animales también contienen GFP localizada en las mitocondrias, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O se acumula en las mitocondrias del músculo de la pared del cuerpo y aparece de color naranja bajo un filtro de paso de triple de la edad adulta joven (t = 0 h) hasta la edad adulta puesto 72 h. El tratamiento con unc-112 RNAi causa una pérdida progresiva del potencial de membrana como se muestra a las 72 horas, donde las mitocondrias restantes muestran una menor acumulación de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs. peso. Photobleaching para 10 SEc usando blanqueadores 540/25 nm luz del rojo de la MitoTracker y revela la GFP localizada en las mitocondrias del músculo (+ de blanqueo de fotos). Las barras de escala representan 25 micras y zooms en son 2,5 veces.

La Figura 5
Figura 5: (A) El tratamiento con LY-294002 animales induce un defecto de movimiento (B) Evaluación de la degradación de proteínas utilizando un ensayo de β-galactosidasa.. Edad sincronizado peso larvas L1 se cultivan a la edad adulta a los 20 ° C (t = 0 h) antes de transferir a NGM sembrado con OP50 (control de peso) o NGM siembra con LY-294002 (tratamiento inhibidor de PI3K) durante 24 horas a 20 ° C . En A, aproximadamente 20 a 30 animales se tiñeron para la actividad β-galactosidasa (azul) en t = 0 horas y después de 24 h, 48 hy 72 h.

Discussion

Estos métodos permiten la exploración de músculo de la macrophysiology de movimiento para la identificación de defectos subcelulares que son suficientes para causar un defecto movimiento. Cuando se combinan estos métodos permiten el análisis detallado de los músculos. El conocimiento adquirido permite realizar más pruebas de hipótesis musculares orientadas a que pertenecen a la general de la fisiología, la fisiopatología y el envejecimiento.

Movimiento ensayos

Un defecto de movimiento indica una alteración de la función neuromuscular normal. Esto puede ser específico a los nervios o músculos o puede ser común entre varios tejidos. Las etapas más difíciles de los ensayos de los movimientos que terminan están seleccionando los gusanos que son representativos de la población y / o el tratamiento, y también asegurar que el experimentador no daña al animal después de la transferencia a M9. Es importante tener un gran tamaño de la muestra para obtener una evaluación de representación y precisa de movimiento. Cuando el ensayo altamente plumaetrant efectos, por ejemplo, ven con tanta frecuencia en los mutantes, un tamaño de muestra de diez animales cada uno evaluó para el movimiento diez veces es suficiente para encontrar diferencias estadísticamente significativas frente de tipo salvaje. Sin embargo, la simplicidad de los ensayos de movimiento y la facilidad de cultivo de C. elegans significa que cientos de gusanos pueden ser rápidamente evaluados con el fin de asegurar resultados cuantitativamente robustos. Cuando el ensayo de los efectos que aparecen en la actualidad sólo una parte de la población es importante para determinar qué proporción de la población parece estar afectada, así como la gravedad de los defectos de los animales más afectados. En tales situaciones, un mayor número de animales deben ser evaluados con el fin de proporcionar los datos mínimos para la proporción de la población afectada. Frecuentes tanto de drogas y tratamientos RNAi producirán defectos graves con el movimiento en una pequeña proporción de la población. En algunos casos el aumento de la dosis del tratamiento y la o el método de entrega se incrementará la proporción de affanimales ejadas y curvas de respuesta de dosis de funcionamiento pueden ser útiles en la determinación de la concentración óptima de un fármaco o RNAi. Una segunda limitación de este ensayo movimiento es que los gusanos son manipulados para evaluar el movimiento. Por lo tanto, los gusanos se estimularon tanto y sometidos a algún grado de estrés osmótico al recogerlo en líquido. El grado de estrés osmótico puede ser limitada mediante el uso de M9 o BU tampón 19 en lugar de agua. Algunas de estas limitaciones se alivian mediante la medición de movimiento habitual en los platos usando los sistemas de seguimiento disponibles en el mercado 34 o plug-ins gratuitos para ImageJ 35. La medición de la velocidad de movimiento de un animal puede proporcionar información importante sobre la salud muscular en general, incluidos los cambios en la función que se puede medir a través de la esperanza de vida y la no invasividad de este método es la clave para los estudios de larga duración prospectivos de la función muscular.

Formación de imágenes del aparato contráctil

<p class = "jove_content"> La cepa de gusano utiliza aquí para estructura del aparato contráctil imagen era PJ727 36, que expresa una proteína de fusión GFP miosina que se localiza en sarcómeros dentro de los músculos de la pared corporal. El uso de esta cepa permite la visualización de la estructura del sarcómero en animales vivos. Similar al ensayo de movimiento descrito anteriormente, una ventaja clave de la utilización de GFP marcado sarcómeros para evaluar la estructura del sarcómero es que el método es relativamente no invasiva y por lo tanto se puede utilizar para el seguimiento prospectivo estructura del sarcómero en los animales individuales durante toda la vida. La mayor dificultad con este método es que los gusanos que se toman las radiografías siguen vivos y por lo tanto en movimiento, lo que hace que sea difícil conseguir imágenes bien enfocadas. Varios métodos pueden ser empleados para reducir el movimiento y hacer más simple la formación de imágenes; estos incluyen anestesiar o paralizar los gusanos y la inmovilización a través de la presión, de aspiración, o el uso de una solución de alta viscosidad. Cada uno de estos métodos de immobilización tiene el inconveniente de que en sí mismo puede alterar la función neuromuscular. Por lo tanto, es esencial incluir controles no tratados apropiados en el análisis. También puede ser prudente para utilizar al menos dos métodos independientes de inmovilización para confirmar los resultados no se deben a problemas con el método de inmovilización, dependiendo de qué tan ampliamente utilizado el método elegido es la inmovilización de la cuestión en estudio. Aquí hemos utilizado una simple presión del cubreobjetos sobre el gusano para inducir movimiento reducida. Después de colocar el cubreobjetos, el líquido debajo del cubreobjetos se evaporará y el cubreobjetos en consecuencia comenzará a producir más presión sobre los gusanos, por lo general esto toma 2-5 min para producir suficiente movimiento reducido para permitir imágenes fácil.

Es esencial controlar los gusanos de cerca después de que el cubreobjetos se ha introducido como la presión con el tiempo aumentará lo suficiente para hacer que los gusanos a punto de estallar por la presión excesiva, por lo general 10 a 15 minutos después de la coAdemás verslip. Tampón adicional puede ser introducido con la ayuda de una punta de pipeta alrededor de los bordes del cubreobjetos para evitar la lesión por aplastamiento a los gusanos. Esmalte de uñas se puede utilizar para sellar los bordes de la hoja de la cubierta y evitar la evaporación, aunque esto impide la recuperación de los animales de debajo de la hoja de la cubierta, si se desea. Del mismo modo, el uso de perlas de silicona en la solución puede ayudar a reducir la cantidad de presión de los lugares cubreobjetos sobre los gusanos.

Al igual que con la evaluación para un defecto de movimiento, es importante considerar la penetrancia de efecto. La penetrancia puede considerarse alta si 80-100% los animales muestran un fenotipo en la placa de NGM, parcial si 21-79% y baja si ≤20% de la pantalla una población afecta. Para efectos muy penetrantes, tamaños de muestra más pequeños se pueden utilizar para producir datos cuantitativos significativos sobre los defectos del sarcómero. En los casos en que el efecto tiene una penetrancia baja, la selección de los animales que deben mostrarse un claro defecto de movimiento en respuesta a las drogaso tratamiento RNAi puede ser útil en el ensayo de defectos del sarcómero en los animales más afectados por el tratamiento. Sin embargo, no es necesariamente el caso de que la medida del efecto del tratamiento sobre el movimiento y la estructura subcelular es el mismo. Por lo tanto, puede ser deseable para examinar la extensión de los defectos presentes en una población grande, por ejemplo 100 animales. Esto permite la comprensión de la distribución de los defectos a lo largo de una población. También puede ser deseable para examinar el grado del defecto en los animales más gravemente afectados y / o examinar la correlación entre la medida de defecto sarcómero y el grado de defecto de movimiento. Dificultades potenciales a un lado, este método es más rápido y más fácil que otros métodos de evaluación de la estructura del sarcómero. Esta velocidad y la facilidad es, sin embargo, sujetas a una limitación fundamental, sarcómeros contienen proteínas de fusión GFP no son del todo normales 37 y por lo tanto la evaluación de sarcómeros interrumpidos debe confirmarse mediante métodos de trabajo intensivo más adicionales.Estos métodos incluyen el uso de luz polarizada 38, phalloidin tinción de 39 años, y de inmunofluorescencia indirecta 40. De estos métodos, sólo la luz polarizada es relativamente no invasivo; los otros métodos requieren la fijación y por lo tanto no se pueden utilizar en estudios prospectivos de los animales individuales, sino que sólo pueden utilizarse para confirmar, cruzar en sección, los resultados de tales estudios.

Imaging de mitocondriales Redes

La cepa de gusano utilizado para los experimentos de formación de imágenes mitocondrial se CB5600 7 que expresa una proteína de fusión GFP localizada en las mitocondrias y una proteína de fusión β-galactosidasa GFP localizada en los núcleos, tanto en los músculos de la pared corporal. Al igual que con el uso de PJ727 para sarcómeros de imágenes, el uso de esta cepa permite la visualización de la estructura de la red mitocondrial en los animales vivos. Por lo tanto, esta cepa se puede utilizar para evaluar los cambios dinámicos que se producen, por ejemplo reducida mitochondrial de fusión y / o el aumento de la fisión mitocondrial 41. También como para sarcómeros de imágenes, la mayor dificultad con este método es que los gusanos se toman imágenes todavía están vivos y en movimiento, por lo que es difícil de conseguir imágenes bien enfocadas. Mientras varios métodos, como se discute en mayor detalle anteriormente, se pueden emplear para reducir el movimiento, las mitocondrias parecen ser especialmente sensibles a las intervenciones que inducen movimiento reducida. Por ejemplo, se usa más comúnmente componentes de destino anestésicos de la cadena respiratoria mitocondrial y son, por tanto, debe ser utilizado con precaución en los estudios de estructura normal y la función mitocondrial. Del mismo modo, la mayoría de los agentes paralizantes se deben utilizar con precaución en los estudios de la estructura mitocondrial y la función normal, como la mayoría de los agentes paralizantes causan menos señal pase a través de la unión neuromuscular y denervación funcional del músculo es suficiente para inducir la fragmentación mitocondrial. Los experimentos en este estudio utilizan la presión para inmovilizar animaless, pero otros han utilizado con éxito levamisol 42, aunque es esencial para los animales imagen inmediatamente.

Por último, diversos contaminantes bacterianos en los cultivos, por ejemplo B. subtilis, pueden inducir la fragmentación mitocondrial; por lo tanto, es esencial incluir controles no tratados apropiados en el análisis. Para efectos muy penetrantes, tamaños de muestra más pequeños pueden ser utilizados para producir datos cuantitativos significativos sobre los defectos mitocondriales de red. Sin embargo, debido a la prevalencia de los defectos menores en la red mitocondrial, este pequeño número de animales es probable que sea el doble del número necesario para la evaluación de la estructura del sarcómero. En casos en que el efecto tiene una penetrancia baja, la selección de animales que presenten claramente un defecto de movimiento en respuesta a medicamento o tratamiento RNAi puede ser útil en el ensayo de defectos mitocondriales en los animales más afectados por el tratamiento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, no es necesariamente el caso que lamedida del efecto del tratamiento sobre el movimiento y la estructura subcelular es el mismo. Por lo tanto, puede ser deseable para examinar la extensión de los defectos presentes en una población grande, por ejemplo 150-200 animales, así como el grado de alteración en los animales más gravemente afectados y la presencia o ausencia de la extensión de la interrupción con la extensión de defecto de movimiento. Otras cepas con etiqueta fluorescente mitocondrias se pueden utilizar para confirmar los resultados obtenidos en CB5600, sin embargo, el uso de diferentes proteínas fluorescentes puede influir en la creación de redes de línea de base de las mitocondrias. Por ejemplo, el uso de una proteína de fusión TOMM-20 RFP para visualizar las mitocondrias parece causar aumento de la fragmentación mitocondrial línea de base frente a la utilización de GFP localizada mitocondrial 17. Mientras que otros métodos tales como la inmunofluorescencia y microscopía electrónica pueden utilizarse para evaluar la estructura mitocondrial, que no permiten la evaluación in vivo de la dinámica mitocondrial porque una etapa de fijación es requiered. Otros métodos tales como el uso de tintes mitochondrially localizadas pueden ser utilizados sin fijación y por lo tanto también se pueden utilizar en lugar del uso de GFP localizada mitocondrial. Como se explica en la siguiente sección, el uso de estos colorantes también permite la evaluación de crudo in vivo la función mitocondrial.

La evaluación de la membrana mitocondrial potencial in vivo en C. elegans

Una variedad de colorantes están disponibles para el etiquetado 28 mitocondrias. Estos colorantes proporcionan un método alternativo de visualizar la estructura de red mitocondrial en C. elegans vivos. Muchos de estos colorantes también permiten la evaluación de la funcionalidad mitocondrial crudo in vivo porque se acumulan en las mitocondrias basados ​​en el potencial de membrana mitocondrial. Aquí hemos utilizado C 32 H 32 Cl 2 N 2 O que se ingiere a través deel tracto digestivo, con la introducción de algunos adicionalmente el gusano a través de la cutícula debido a la permeabilización proporcionada por su disolución en 0,5% de DMSO. Tras la entrada en la célula C 32 H 32 Cl 2 N 2 O se oxida y secuestrado por las mitocondrias donde se une el azufre que contiene aminoácidos (por ejemplo, metionina y cisteína). La formación de estos complejos de colorante-péptido significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O permanece en la mitocondria una vez etiquetados 28. Una dificultad clave con el uso de tintes mitocondriales es que va a etiquetar todas las mitocondrias en el animal. Por lo tanto, hemos realizado etiquetado en CB5600, la misma cepa se ha descrito anteriormente para evaluar la estructura de la red mitocondrial muscular. Mediante el uso de un colorante rojo mitocondrial, una cepa de gusanos que expresan GFP en las mitocondrias del músculo, y un filtro de triple pase, es relativamente sencillo de imagen sólo las mitocondrias en el músculo mediante la búsqueda de las mitocondrias que son Orango por colocalización de colorante rojo y las mitocondrias GFP etiquetados. El paso más difícil en la realización de este enfoque es colocalización de imágenes debido a que el tinte es foto-blanqueado en cuestión de segundos bajo luz fluorescente de alta intensidad. Este efecto puede ser limitado por mantenimiento de la fluorescencia en baja potencia hasta que el experimentador está listo para la imagen y luego ajustando la intensidad de fluorescencia en consecuencia. Una vez que uno se experimenta con el uso de tintes otro enfoque es utilizar la microscopía confocal con Z-pilas a imagen sólo las mitocondrias en el tejido derecho; las redes mitocondrial en el músculo son muy diferentes en comparación con otros tejidos. Desafortunadamente, la incapacidad de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O dejar mitocondrias 28 significa que, a diferencia de las técnicas del sarcómero y de imagen mitocondrial discutidos anteriormente, no puede ser utilizado para el seguimiento prospectivo pérdida de la función mitocondrial con el tiempo, a menos que C 32 H 32 Cl 2 N 2 Ose añade en los puntos de tiempo discretos para separar las poblaciones de animales. Esta limitación se puede superar mediante el uso de colorantes tales como JC-10 que lo hacen salir de la mitocondria al colapso del potencial de membrana 43. Las mitocondrias también puede ser aislado de C. elegans 30 para los análisis bioquímicos subsiguientes. Dicha extracción permite la cuantificación del potencial de membrana mitocondrial mediante la cuantificación de la tasa de absorción de colorante lipofílico catiónico usando citometría de flujo o un lector de placas fluorescente 44. Habiendo establecido un deterioro potencial de la membrana mitocondrial, también es posible determinar si la pérdida de gradiente de protones se traduce en una pérdida de la producción de ATP usando un método basado en la luciferasa sensible bioluminometric 45.

La evaluación de la degradación de proteínas en C. elegans

La cepa de gusano utilizado aquí para evaluar la degradación de la proteína muscular fue PD55, que contiene una β específica musculargalactosidasa que se sintetiza de forma continua durante todo el desarrollo hasta que se alcanza la edad adulta y que permanece estable en el citosol para la próxima 72-96 hr 19. Por lo tanto, la medición de los niveles de β-galactosidasa durante el desarrollo predominantemente indica el impacto de las intervenciones sobre la síntesis a partir del promotor de miosina, mientras que la pérdida de β-galactosidasa durante la edad adulta indica una intervención ha provocado el aumento de la degradación de proteínas citosólicas 19. El paso clave en la evaluación de la actividad β-galactosidasa es asegurar la desecación efectiva. Si no se deseque efectivamente los animales resulta en pobres disposición del sustrato X-gal y el color azul, por tanto, pobre en los músculos de la pared corporal de los animales. Para garantizar una buena desecación del sello en el desecador se debe comprobar y la muestra debe ser revisado a intervalos a lo largo de 5-10 min desecación para evaluar el progreso (es decir, la muestra de 20 l debería haber secado en 10 minutos y el restante 20 mines asegurar la desecación completa). El ensayo de β-galactosidasa es un ensayo de actividad, por tanto, un control apropiado es esencial. Además, la disminución de la tinción de los adultos en una condición de tratamiento con respecto al control no demuestra que se está produciendo la degradación; sino que más bien indica disminución de la actividad enzimática en respuesta al tratamiento. Para confirmar la degradación, más análisis de transferencia Western de mano de obra debe ser completada en contra de β-galactosidasa 13 y esto permite que la degradación de proteínas cuantificación en pequeñas poblaciones de gusanos contados. Densidades banda de Western blot se pueden cuantificar usando ImageJ 46. Otra limitación de este método es que el uso de proteínas transgénicas no informa como a los objetivos fisiológicos de la degradación y para tales respuestas de hipótesis impulsada Western blots proteómicos y / o específicas, se debe emplear 13. Por último, como la síntesis de la proteína transgénica empleada en estos estudios se apaga en la edad adulta temprana 19 C. elegans muscular; por ejemplo, métodos de isótopos estables o radiactivos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

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Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em
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Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

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