Abstract
La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites, qui sont les cellules souches musculaires résident. Ceux-ci peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie de muscle humain en utilisant une digestion enzymatique et leurs propriétés myogéniques étudiés en culture. Quantitativement, les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues par digestion enzymatique sont les suivantes: (i) les cellules satellites (appelées cellules myogéniques ou de cellules précurseurs de muscle), identifié initialement comme CD56 + et par la suite en tant que CD56 + / desmine + cellules et (ii) muscle- fibroblastes dérivés, identifiés comme CD56 - et TE-7 +. Fibroblastes prolifèrent très efficacement dans la culture et dans les populations de cellules mixtes ces cellules peuvent dépassement cellules myogéniques de dominer la culture. L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné ou l'autre type de cellules en culture. Ici, nous DESCRBIE un système de tri basé sur la digestion enzymatique douce de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie magnétique tri cellulaire activé (MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et avec un bon rendement (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 cellules / g de tissu après 7 jours in vitro) pour les expériences de culture. Cette approche repose sur l'incubation de la population de cellules dérivées du muscle mixte avec des microbilles magnétiques des billes conjuguées à un anticorps dirigé contre CD56 et puis en faisant passer les cellules si un champ magnétique. CD56 + liés à microbilles sont conservés par le champ tandis CD56 - cellules passer sans entraves à travers la colonne. Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées et cultivées. Suite à une intervention donnée, la morphologie cellulaire et l'expression et la localisation des protéines, y compris des facteurs de transcription nucléaires peut être quantifiée en utilisant un marquage par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques et une image pe traitement et logiciel d'analyse.
Introduction
La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites 1, les cellules souches myogéniques 2,3. In vivo ces cellules existent dans un état réversible de repos située entre le sarcolemme et lame basale de chaque myofibre, mais se activent à proliférer, fusible et de différencier que le tissu musculaire est endommagé, réparer et régénérer 3. Les cellules satellites peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie musculaire humaine jeunes et les personnes âgées en utilisant une digestion enzymatique 4 et leurs propriétés myogéniques peut ensuite être étudié en culture primaire 5. L'efficacité de ce processus d'isolement en ce qui concerne à la fois le rendement et la pureté de la population de cellules dépend des méthodes utilisées et peut varier d'un échantillon à. Les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues à partir de la digestion enzymatique sont les cellules satellites (cellules myogéniques maintenant appelés ou des cellules précurseurs du muscle), identifiés initialement comme cellules CD56 + / desmine, et mufibroblastes SCLE dérivés, identifiés comme CD56 - et TE7 + 5 cellules. Fibroblastes ont un taux de prolifération rapide et ne subissent pas un arrêt de croissance irréversible et différenciation terminale lors d'un contact cellule-cellule comme les cellules myogéniques; Ainsi, dans des populations mixtes, les fibroblastes peuvent dépassement cellules myogéniques à dominer la culture.
Fibroblastes ont souvent été considérée comme une irritation pour les biologistes musculaires, cependant, il ya maintenant un intérêt croissant dans les fibroblastes en cellules dignes d'étude à part entière, d'autant plus qu'ils ont été montré pour avoir un rôle de coopération avec des cellules myogéniques pendant la réparation musculaire 6 . L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné de deux types de cellules en culture. Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) est un procédé par lequel les cellules peuvent être triés pour une étude plus poussée et / ou comptées etanalyser. FACS a été montré pour enrichir de manière fiable cellules myogéniques humaines, mais le rendement des cellules pour la culture subséquente a jusqu'à présent pas été élevé 7. Compte tenu du potentiel de réplication limitée des cellules somatiques telles que les cellules satellite dérivés de cellules myogéniques et les très pauvres prolifération et la différenciation associés à la sénescence 4, des approches plus douces sont nécessaires. Simples cultures de fibres musculaires offrent une autre, moins agressive, des moyens d'obtenir des cellules satellites murins résident encore dans leur niche sublaminal et après leur activation dans la culture 8,9. Cependant, ce ne est souvent pas possible à partir de matériel de biopsie musculaire humaine (parce que les fibres peuvent rarement être obtenus à partir de tendon tendon) ce qui signifie que cette technique peut ne pas être accessible à de nombreux laboratoires de recherche intéressés à l'étude des cellules musculaires humaines dérivées. De plus, la technique de fibre simple ne fournit que le nombre de cellules très limitées.
Ici, nous décrivons un système de tri en fonction de la gendigestion enzymatique tle de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie de deux cycles successifs de cellules activées magnétique de tri (de MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et le rendement (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 cellules / g de tissu) pour des expériences dans la culture. CD56 est considéré comme le marqueur de surface or standard pour l'identification des cellules satellites humaines in situ et in vitro 10 et 11 fournit la surface de marqueur candidat idéal pour la fixation de talon. Dans cette approche anticorps CD56 conjugués à l'oxyde de fer et des billes superparamagnétiques contenant des polysaccharides sont liés aux cellules et passé à travers une colonne de séparation cellulaire magnétique à gradient élevé placé dans un champ magnétique puissant 12,13. Les colonnes de séparation sont remplis avec une matrice de laine d'acier ou de fer sphères ferromagnétiques qui servent à concentrer les lignes de champ magnétique vers leur surface générer des gradients de champ magnétique intense (~ de 4tesla) 14. Dans ces colonnes cellules même légèrement magnétiques sont attirés et adsorbées à leur surface 14. Non consolidé (CD56 -), les cellules passent à travers la colonne alors que CD56 + des cellules marquées avec des microbilles magnétiques sont retenues jusqu'à ce que le retrait du champ magnétique 12,15.
Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées à la densité désirée pour de nouvelles expérimentations. Suite à une intervention donnée les constituants cellulaires peuvent être identifiés en utilisant immunocytochimie, imagé en utilisant grand champ ou la microscopie confocale à fluorescence et analysé quantitativement en utilisant une approche d'analyse d'image qui permet une mesure objective rapide de toutes les cellules marquées dans une image donnée. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé cette approche double tri immunomagnétique suivie par analyse d'image 16 pour démontrer que CD56 - fibroblastes humains transdifférencient facilement dans les adipocytes, tandis que la cellule myogéniques d'origine par satellite sont très résistants à cette conversion adipogénique 5.
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Protocol
NOTE: Pour les études réalisées dans notre laboratoire tous les sujets ont donné leur consentement écrit et éclairé à participer et à toutes les expériences ont été réalisées avec l'approbation du Comité d'éthique du National Health Service au Royaume-Uni (Comité éthique de la recherche de Londres; référence: 10 / H0718 / 10) et conformément aux la Loi sur les tissus humains et de la Déclaration d'Helsinki.
1. Préparation initiale Avant la biopsie musculaire (15 min)
- Faire milieu de croissance de muscle squelettique humain. Pour un 50 ml tube conique stérile graduée ajouter 2,5 ml du mélange de supplément, 10 ml de sérum de veau foetal, des antibiotiques (pénicilline / streptomycine) et glutamine aux concentrations finales correctes (tableau 1) puis remplir le tube de 50 ml avec squelette de base musculaire milieu.
- Placer 15 ml de milieu de base des muscles squelettiques dans un tube conique stérile de 20 ml et le peser. Une fois pesé lieu ce tube sur la glace. Utilisez cette option pour recevoir l'échantillon de muscle humain.
- Dans un autre tube de 20 ml préparer 10 ml d'une solution d'enzyme collagénase D et dispase II à une concentration finale de 2 mg / ml par dissolution de chaque licence aliquotes de ces enzymes dans le muscle squelettique milieu de base. Filtre-stériliser la solution par passage à travers un filtre de 0,22 um. Placez ce mélange d'enzymes stérile dans le bain de l'incubateur ou de l'eau à 37 ° C pendant 15 min pour se réchauffer.
NOTE: Ce mélange d'enzymes est légèrement plus doux que la trypsine et mieux maintient la viabilité des cellules 17. - Mettez de côté une boîte de Pétri et une paire de scalpels stériles.
2. Muscle procédure de biopsie (45 min-1 heure)
- Avant de recruter des participants, obtenir l'autorisation éthique complète et l'approbation de la procédure (y compris les vaccinations pertinentes pour expérimentateurs) de tous les organes directeurs compétents, les comités et les fournisseurs de soins de santé (par exemple, éthique, institutionnel, gouvernemental, etc.).
- Créer un champ stérile autour de la jambe du (par exemple, avec des draps chirurgicaux stériles) unD nettoyer la zone autour du site de la biopsie avec un agent antibactérien antiseptique (chlorhexidine).
- Anesthésier le site de biopsie proposée sur la jambe de l'volontaire par injection locale de lidocaïne à 2% dans la région sous-cutanée recouvrant le fascia du muscle vaste externe.
- Faire une large incision ~ 5 mm en utilisant une lame chirurgicale stérile à travers la peau et le fascia et effectuer la procédure de biopsie à l'aiguille Bergström 18 avec aspiration supplémentaire.
- En utilisant des pinces stériles supprimer le muscle de la lumière d'aiguilles et de plonger dans le milieu de base sur la glace. Transports le tissu au laboratoire pour traitement ultérieur dès que possible bien que les cellules myogéniques viables peuvent être obtenues après des périodes de 24 h ou plus.
- Compte rendu de l'objet, nettoyer et sceller le site d'incision avec plusieurs bandes adhésives peau fermeture stériles et robe de façon aseptique avec un revêtement imperméable externe.
3. Isoler Muscle dérivé précurseur CeLLS (1 h, 30 min)
- Retirer le tube contenant l'échantillon de muscle et le peser (assurez-vous que le tube est sec en essuyant avec le tissu). Calculer le poids de l'échantillon de muscle en soustrayant le poids du tube contenant du milieu et de l'échantillon à partir du tube contenant le milieu seul.
- Agiter la solution plusieurs fois pour laver l'échantillon de sang du muscle. Laissez les sédiments musculaire à la température ambiante pendant 30 à 60 sec.
- Retirer pratiquement tout le volume du milieu du tube, en utilisant un premier auxiliaire de pipetage électronique ou aspirateur mais laisser environ 2-3 ml dans le tube.
- Inverser le tube sur une boîte de Pétri stérile permettant au fluide restant pour transporter l'échantillon de muscle sur le plat; utiliser le scalpel stérile pour extraire ne importe quel muscle reste fragments.Rotate le plat de mobiliser le liquide restant et l'enlever avec un pipette.Remove des morceaux visibles de graisse ou de tissu conjonctif.
- Pour biopsies pesant de 100 à 400 mg, ajouter 3 ml de chaudsolution d'enzyme à l'aide de scalpels stériles et couper l'échantillon de muscle en très petits morceaux (<2.1 mm 3).
- Utiliser un large alésage 25 ml pipette établir le fragments musculaires et enzyme solution et le transfert à un tube de 10 ml conique stérile. Laver la boîte de Pétri avec un autre 3-5 ml de collagénase et solution enzymatique dispase et en utilisant une petite pipette de 10 ml recueillir des fragments musculaires restantes et les placer dans le tube. Le volume exact ne est pas critique.
- Placer le flacon dans un 37 ° C incubateur (ou bain d'eau) pendant 60 min avec la trituration (pipette de 10 ml) toutes les 15 min.
- Après 1 h mettre fin à la dissociation enzymatique par addition d'un volume équivalent de milieu de croissance préchauffé frais et passer la suspension de cellules à travers un filtre de 100 um pour enlever les débris de grande myofibre. Centrifuger la solution de cellules filtré à 657 g pendant 6 min à température ambiante (20-25 ° C).
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 7.5 ml de milieu de croissance et une plaque en T-25 non revêtuetissus flacon de culture. Transférer cette plaque dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 7 jours. Changer le support toutes les 48 heures. A ce stade, les cellules myogéniques sont très petites et arrondies et difficile de discerner à partir de cellules non myogéniques.
- Au premier changement de milieu, centrifuger le surnageant pour obtenir un culot des cellules non adhérentes. Re-suspendre ceux-ci dans un milieu frais et re-plaque.
- Après 7 jours de culture, veiller à ce que la plupart des cellules myogéniques (et fibroblastes) ont attaché mais les cellules ne ont pas encore atteint la confluence. Purifier les précurseurs myogéniques et effectuer MACS selon un protocole développé à l'origine par les laboratoires de Gherardi et Chazaud 19,20 et en outre modifié par 5 nous.
4. Immunomagnétique Perle tri de cellules CD56 Basé sur Expression (1,5 h)
- Après sept jours rinçage la monocouche cellulaire (qui contiendront typiquement 50-60% de cellules myogéniques 5) avec trois échangesde solution tampon de phosphate à température ambiante (PBS) pour éliminer toutes les cellules et les débris non adhérentes restantes de l'isolement.
- Trypinize les cellules (0,04% de trypsine dans du PBS exempt de Ca2 + à 0,73 mM d'EDTA) pendant 3 minutes. Une fois que les cellules ont enlevé, ajouter 5 à 10 ml de milieu de croissance du muscle squelettique pour éviter une sur-digestion. Pellet les cellules par centrifugation à 657 g pendant 6 min à température ambiante (20-25 ° C) et remettre en suspension dans un volume approprié de milieu complet pour le comptage.
- Compter un petit échantillon de la suspension cellulaire en utilisant la méthode désirée (par exemple, en utilisant un hémocytomètre ou un dispositif de comptage automatique) et calculer à partir du nombre de cellules et la viabilité.
- Plate quelques puits dans un (récipient ou plus si nécessaire) plaque de 96 puits pour immunocytochimique ou de débit caractérisation de la population sur la base de cytométrie en avant le tri (fibroblastes et les cellules myogéniques seront types de cellules les plus abondants).
- Pour la suspension de cellules annonced 15 ml de PBS stérile pour diluer cellules et le milieu. Centrifuger les cellules à nouveau et les remettre en suspension dans 170 ul de la température ambiante tri tampon (1% de BSA dans une solution de rinçage MACS, stérilisé par passage à travers un filtre de 0,22 um).
- Ajouter 35 ul de microbilles magnétiques bien mélangés conjugués à un anticorps primaire CD56 (clone AF12-7H3, 130-050-401) dans la solution cellulaire, pipette pour mélanger et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation douce à la mi-parcours.
- Après incubation, diluer la solution de cellules et billes avec 10 ml de tampon MACS tri et centrifuger à 657 g pendant 6 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de tri.
- Ajouter le séparateur MACS (aimant) pour les MACS détenant stand. Prenez soin lors de l'ajout aimant au stand en raison de la fort champ magnétique. Fente dans la colonne et adapter le filtre de pré-séparation. Pipette 1 ml de tampon de tri à travers le filtre de pré-séparation et de la colonne pour la lubrification.
- ImmédiatEly après cela, mélanger doucement la suspension de cellules et de se égoutter l'ensemble 1 ml à travers le filtre de pré-séparation et dans la colonne.
- Laver la colonne trois fois avec 1 ml (ou 500 pi) de tampon de tri. Recueillir les cellules non retenu qui passent à travers la colonne de la première sorte dans un tube conique de 50 ml stérile contenant une petite quantité de milieu de croissance. Ces cellules sont CD56 de la première sorte - fraction et seront hautement enrichies pour les fibroblastes du tissu conjonctif. Ne laissez pas la colonne sécher entre les lavages.
- Après des lavages de la retirer le filtre de pré-séparation et ajouter 2,5 ml de tampon MACS à la colonne. Ensuite, retirer immédiatement la colonne de l'aimant et recueillir le Tri CD56 + fraction dans un tube conique de 50 ml séparée en appuyant sur le piston dans le haut de la colonne.
REMARQUE: Le piston se intègre très bien dans le haut de la colonne et peut être assez difficile à utiliser; Toutefois, cela doit être fait tandis que la colonne est toujours full de tampon, afin vitesse est nécessaire. Évitez d'enfoncer le piston trop dur et rapide. - Avant le placage évaluer la viabilité des cellules en utilisant, par exemple, le dosage au bleu trypan. Déterminer le pourcentage de cellules viables à partir de champs de 8 x 1 mm 2 de comptage (deux chambres du hémocytomètre).
REMARQUE: Les cellules peut être simple ou double triés en fonction de la pureté requise. Si fait avec soin ces cellules tolèrent la procédure de double tri très bien et la viabilité est très élevé> 95%. Pour double tri, mettre en place une autre colonne, lubrifier avec 1 ml de tampon de tri et passez à l'étape 4.6.- Si l'imagerie doit être effectuée, les cellules de la plaque directement sur des lamelles de verre situées à 24 puits revêtues 21 et avec un choix de molécule d'ECM pour la fixation des cellules (par exemple du collagène ou de la laminine). Ici, utiliser 0,1 à 0,5 mg / ml de collagène I (tableau 3).
5. Tri des Humune fibroblastes musculaires dérivé immédiatement après l'isolement.
- Pour purifier progéniteurs fibroblastes immédiatement après l'isolement, employer le protocole que ci-dessus avec les modifications suivantes:
- Immédiatement après que les cellules d'isolement de remettre en suspension dans un milieu complet et filtre une fois si une passoire 100 um de la cellule, puis de nouveau si une passoire 40 um. Ajouter 5 ml de PBS et de spin à 657 g pendant 6 min.
- Remettre en suspension les cellules dans MACS tampon de tri et incuber dans des microbilles de fibroblastes anti-humaines pour 15-30 min à température ambiante.
- Utilisez la colonne de LS et le séparateur Midi-MACS (tableau 3) et installer le filtre 40 um de pré-séparation.
- Effectuez une ou deux sortes en fonction de la pureté requise, transférer les cellules dès que possible dans un milieu contenant du sérum, effectuer un comptage, et étaler à la densité désirée
6. immunocytochimique coloration (un jour et nuit).
- Fixercellules dans les puits par l'addition d'un volume égal de 8% de paraformaldehyde dans du PBS glacé pendant 10 min sous agitation douce. Après 10 min aspiration fixateur et laver deux fois avec PBS.
- Pour immunocoloration des antigènes de surface cellulaire, des cellules de bloc pendant au moins 1 h dans 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS et ensuite la sonde avec les anticorps primaires correspondants (tableau 4).
- Pour antigènes intracellulaires, perméabiliser les cellules après fixation par addition de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS avec 1% de BSA et de NaN3 (0,01%) pendant 10 min, puis bloquer et incuber avec des anticorps primaires. Effectuer toutes les incubations d'anticorps primaires pendant une nuit à la température ambiante (ou à 4 ° C) avec agitation douce sur un plateau à bascule.
- Retirer anticorps primaire non lié et laver les cellules trois fois avec du PBS froid. Incuber pendant 1 heure d'incubation avec des anticorps secondaires marquées par fluorescence spécifiques d'espèces (tableau 4) à la température ambiante.
- Après élimination duAnticorps secondaires non liés, laver les cellules avec trois échanges de PBS puis Counterstain avec l'ADN colorant fluorescent Hoechst 33342 (1 pg / ml) de la solution pendant 10 min sur une plate-forme à bascule.
- Pour la visualisation simultanée des deux antigènes de surface des cellules et des antigènes intracellulaires, les cellules de la sonde d'abord avec des anticorps primaires à des antigènes de surface cellulaire sont suivis par des anticorps secondaires appropriés. Ensuite, re-fixer les cellules dans le froid PFA, perméabilisent, bloc et incuber avec des anticorps primaires contre des antigènes cytoplasmiques ou nucléaires suivis par leurs anticorps secondaires appropriés.
- Après coloration, retirez lamelles de leurs puits à l'aide des pinces courbes et rincer à l'arrière de la lamelle avec de l'eau distillée. Posez la cellule de lamelle glisser vers le bas sur une goutte de milieu de montage 22 ensemble sur une lame de microscope en verre anti-fade.
7. Oil Red O coloration en combinaison avec immunofluorescence de cellules (2 h)
- Révélerla teneur en lipides des cellules plaquées dans 24 puits par coloration avec Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyle] azo) -2-naphtol) 5,23. Tout d'abord préparer une solution mère de 0,5% (p / v) de Oil Red O en dissolvant 500 mg de Oil Red O dans 60 ml de 99% de triéthyle-phosphate et 40 ml d'eau distillée. Maintenir cette solution à la température ambiante dans l'obscurité jusqu'à utilisation.
- Le jour d'utilisation, faire un 36% (p / v) de triéthyle-phosphate de travail, contenant 12 ml de solution stock Oil Red O et 8 ml d'eau distillée. Filtrer cette solution à travers le numéro de papier filtre 42 pour éliminer toute cristallisé Oil Red O (qui diminue la qualité de l'image).
- Réchauffer doucement cette solution de travail dans un bain d'eau pendant 1 heure, après quoi la solution est centrifugée à 1200 g pendant 6 min. Eliminer le surnageant et filtrer de nouveau à travers un papier filtre (n ° 42) et transférer dans un tube propre de 20 ml.
- Après que les cellules ont été fixées, perméabilisées et immunocolorées, retirez le PBS et ajouter 500 pi de Oil Red O / triéthyle-Phosphate solution dans les puits pendant 60 min. Triton-X à la concentration utilisée ici pour perméabilisation de la membrane cellulaire ne affecte pas le contenu cellulaire des lipides 23.
REMARQUE: Oil Red O est excitée par des longueurs d'onde entre 540 et 580 nm et par conséquent le filtre Texas-Red peuvent être utilisés pour détecter Oil Red O émission en 23 microscopie à fluorescence. Notez que l'émission de fluorescence du Oil Red O peut parfois se infiltrer dans le canal rouge lointain si les cellules sont très fortement colorées (ce est à dire le contenu, très riche en matières grasses). - Après incubation, éliminer l'excès de Oil Red O et rincer les cellules cinq fois avec 500 pi de PBS. Monter les lamelles comme pour immunomarquage comme décrit au chapitre 6. Détecter Oil Red O colorant à la fois par fond clair / microscopie à contraste de phase ou par microscopie à épifluorescence en utilisant le filtre rouge Texas (déplacer gratuitement, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).
8. Obtention micrographies de microscopie à fluorescence pour la suite Unealy
REMARQUE: Veiller à ce que glisse à comparer quantitativement sont colorées avec les mêmes solutions, photographié à des conditions identiques (par exemple, l'exposition, l'appareil photo et les paramètres d'acquisition, etc.) et capturé dans la même session de la microscopie. Tous post-acquisition formatage devrait également être identiques et être en stricte conformité avec les lignes directrices proposées pour les images numériques 24.
- Pour l'acquisition d'image (microscopie à champ large), mettez la source de lumière microscope et fluorescence et partir pour la quantité recommandée de temps pour permettre à la source de lumière de fluorescence se réchauffer et de se stabiliser.
- Réglez le courant d'obscurité pour la caméra en bloquant le chemin de lumière à la caméra; acquérir une image à la résolution maximale et l'utiliser pour corriger les images acquises ultérieurement.
- Illuminez sondes d'immunofluorescence par épifluorescence délivré par guides de lumière liquides (tube flexible fluoré rempli d'huile silicone phénylméthyl) unème signaux visualisés au rouge (jeu de filtres 45 HQ Texas décalage vers le rouge libre, vert (jeu de filtres 44 FITC postes spécial gratuit) et bleu (jeu de filtres 49 DAPI décalage filtres passe libre de bande) sur un microscope épi-fluorescence inversé (10X, 20X, 40X, planifier objectifs apochromatiques avec 0,25, 0,75, 0,95 ouvertures numériques respectivement).
- Pour éviter la saturation du pixel trouver l'exposition optimale dans la gamme linéaire du détecteur pour chaque marqueur fluorescent en utilisant la fonction «surexposition» du logiciel d'acquisition d'image. Prenez note de l'exposition standardisée pour chaque marqueur fluorescent.
- Capturez des canaux individuels et enregistrez niveaux de gris ou tiff pseudocolored (format de fichier d'image étiqueté) des dossiers d'images dans la profondeur la plus élevée de bits (de préférence 16 bits - 65 536 valeurs de gris) fourni par le dispositif d'enregistrement (par exemple refroidi CCD (dispositif à couplage de charge) monté sur le microscope) . Réglez la résolution de l'image pour 1388 x 1040 ou plus. Soyez sûr d'inclure une barre d'échelle ou l'objet de di connuemensions dans l'image.
- Lorsque ce est possible d'enregistrer des fichiers dans 16 format de fichier d'image binaires étiqueté (.tiff) et non au format .jpeg pour éviter la perte d'informations 25.
- Se il ya des préoccupations quant à la régularité de l'éclairage (logiciel livré avec microscope peut avoir pour cette correction automatique) prendre une image «flat-field» de lamelle sans cellules, mais teinté et monté de la même manière que des diapositives expérimentales; ceci peut être utilisé pour corriger les défauts d'éclairement post-acquisition dans le logiciel d'analyse d'image.
- Pour l'acquisition d'image (microscopie confocale), optimiser le gain de détecteur et de la puissance laser pour chaque expérience d'imagerie (éviter la saturation). En général, la fluorescence mesurée est proportionnelle au niveau de puissance de laser. Régler la taille sténopé à '1 aéré' pour atteindre meilleur rapport signal-bruit (meilleure résolution peut être obtenue à 0,5 aéré pour les signaux particulièrement forts). Prendre sections optiques à différents niveaux le long de l'axe z à travers la fourmicellules ibody marqué et enregistrer une projection maximale de 16 bits pour chaque canal pour l'analyse d'image.
9. Les mesures de la scène marqué par fluorescence facteurs de transcription nucléaires par traitement d'images et de logiciel d'analyse (5 min par champ de vision).
- Accès tiff individuelle des fichiers d'image et de superposition correspondant canaux en cliquant et en faisant glisser une image dans une autre. Chaque canal apparaîtra alors comme une couche séparée dans le panneau Calques.
- Sélectionnez Eclaircir à partir du menu de filtre pour permettre couches dessous pour être visualisées simultanément. Sinon, réglez l'opacité des couches supérieures à 50%.
REMARQUE: les images TIFF peuvent être enregistrés avec le Lempel-Ziv-Welch (LZW) compression de données "sans pertes" pour réduire la taille des fichiers sans perte d'information. - Dans la fenêtre d'analyse (Analyse> Sélectionner des points de données> Personnalisé), sélectionnez Analyse et choisir les mesures nécessaires (par exemple, la densité intégrée, Densité de signifiery, la circularité, histogramme, etc.). Jeter les mesures inutiles en décochant la case à côté d'eux. Si les mesures de surface sont nécessaires um cliquez sur Analyse> Définir l'échelle de mesure. L'outil de la règle apparaît automatiquement - tracer la longueur de la barre d'échelle et entrez sa longueur connue en micromètres. Le logiciel va alors convertir les mesures de la région en microns carrés.
NOTE: Si l'analyse de l'histogramme est sélectionné, lorsque les mesures sont enregistrées dans un dossier supplémentaire apparaît (dont l'emplacement peut être choisi) avec 8 histogrammes de bits pour chaque zone de sélection individuelle sur la micrographie ainsi que la somme de toutes les sélections individuelles (ce apparaît toujours comme l'histogramme-1 si plusieurs sélections sont faites). Cette analyse ne peut être effectuée par le logiciel dans un format de 16 bits, mais il est très utile pour examiner la distribution des intensités de pixels dans l'ensemble un objet d'intérêt. - Pour l'analyse de l'intensité de fluorescence nucléaire d'abord construire un reprérepré- 'Couleur Range Sélection Mask' (CRSM) pour Hoechst ou de l'ADN teinté de DAPI pour définir domaine nucléaire. Une fois les images de canaux souhaités sont superposées, seule la couche de canal Hoechst doit être laissé en vue en assurant la «icône de l'œil» à côté de lui dans l'onglet couches est sélectionnée, puis la couche est en surbrillance (devient bleu), tandis que toutes les autres couches doivent être désélectionné. Assurez-vous que la liste déroulante mélange est réglé sur 'Normal' dans l'onglet couches.
- Ouvrez la boîte de dialogue Color Range (Sélection> Plage de couleurs) et définir la sélection déroulant pour l'option «couleurs» échantillonnés. Avec l'aperçu de sélection mis à 'masque rapide »(fond rouge) sélectionner tous les tons de couleur bleue dans les noyaux en maintenant la touche Maj (signe« + »apparaît) et en cliquant dans les noyaux aide de l'outil pipette qui apparaît.
- Si des tonalités non désirées sont sélectionnées, retirez-les en appuyant sur la touche Alt ('─'sign apparaît) et en cliquant sursur eux. Maintenir l'échelle de flou à zéro afin que les tons de couleurs sélectionnées manuellement sont inclus dans l'évaluation et les «grappes de couleurs localisées» doit être laissée sans contrôle.
- Enregistrer cette CRSM sur le disque dur de l'ordinateur comme un spécifique au programme (fichier .AXT) du fichier extrait. Avec un autre champ aléatoire de noyaux, charge, mise à jour et enregistrez le CRSM (Select, Gamme de couleurs, Load). Faites cela pour au moins cinq champs aléatoires pour se assurer que les sélections nucléaires sont représentatifs.
- Utilisez une version de couleur d'une image en niveaux de gris pour la création d'un masque pour isoler caractéristiques parce que l'œil humain est mieux en mesure de faire la distinction entre les différentes nuances de couleur que les nuances de gris entre 26 variable.
- Utilisez le CRSM nucléaire régions nucléaires de segments pour la coloration. Une fois noyaux ont été sélectionnés, cliquez sur Image> Réglages> Seuil et déplacez le curseur tout le chemin vers la droite, de sorte que les noyaux deviennent noires. Alternativement,clic droit et sélectionnez «Remplir» puis choisissez «Remplissez à: noir». Ensuite, cliquez sur Select> Inverse et maintenant appuyez sur Suppr pour supprimer tous fond (si l'option apparaît choisissez 'à combler: Blanc'). Ce binarise essentiellement l'image en fonction de votre sélection. Puis charger le plugin du bassin versant de l'onglet filtres pour séparer les noyaux se chevauchent (Filter> image binaire> fonction séparation des bassins versants).
- Si de nombreux noyaux sont fortement chevauchement, retirez les noyaux de l'analyse en les désactivant (Maintenez la touche Alt et dessiner vaguement autour d'eux avec l'outil lasso).
- Sur la couche nucléaire maintenant binaire, aller à Sélection> Plage de couleurs et> Ombres, pour sélectionner noyaux individuels. Alternative changement de garde et clic dans une quelconque noyau noir. Tous les noyaux seront immédiatement être sélectionnés. Puis transférer cette sélection pour la couche contenant du facteur de transcription nucléaire coloration (par exemple myogénine) en sélectionnant cette couche et désélectionner tousd'autres couches. Marching lignes vont maintenant montrer la position des noyaux dans le canal de myogénine.
- Si vous travaillez avec des images pseudocolored seulement cliquer sur le palette Couches (à droite de l'onglet couches) et ne sélectionnez que le canal vert (l'image apparaît maintenant gris). Ensuite, cliquez sur Image> Mode> Niveaux de gris. Un avertissement apparaîtra 'aplatir les calques visibles et jetez couches cachées de cliquer sur Valider, puis un autre avertissement dire «jetez les autres chaînes de nouveau sur OK. Une seule couche de niveaux de gris sélectionnée noyaux sera désormais présente dans la palette des calques.
- Cliquez sur Enregistrer les mesures dans le journal des mesures pour obtenir des données pour les noyaux sélectionnés. Si la couche à analyser (par exemple myogénine coloration) est déjà une 16 bits image brute en niveaux de gris, puis appuyez simplement sur Enregistrer les mesures.
- Exportation mesures sélectionnées en fichier txt à l'emplacement de votre choix. Ceux-ci peuvent ensuite être traitées et analysées dans un autre logiciel de traitement de données packages
NOTE: L'Edition> étape commande vers l'arrière (de presse tous Alt, touches Ctrl et Z simultanément) restaure toutes les couches précédentes si nécessaire. - Correct pour non fond spécifique fluorescence 27 pour que les résultats soient comparables quantitative et que des mesures d'intensité de fluorescence sont toujours un mélange de signal et arrière-plan.
- Sélectionnez l'outil de sélection carrée et vérifier «taille fixe 'choisir 20 par 20 pixels (ou plus si désiré et en fonction de la confluence de cellules dans l'image). Tout en maintenant SHIFT sélectionner dix ou plusieurs zones de fond répartis dans tout le champ de vision. Mesures de presse Record 'dans le journal des mesures.
- Calculer la densité moyenne intégrée (somme de toutes les valeurs de gris de pixels) par pixel de l'ensemble des 10 régions socio-démographiques (étant donné que la «valeur moyenne grise» dans le journal de mesure). Multiplier la densité du fond moyenne par pixel par le nombre de pixels de l'objet cible (
- Soustraire fluorescence de fond à partir des objets de densité intégrée d'origine pour obtenir la valeur corrigée finale fond. Cette approche tient compte pour le champ potentiel de variation du champ de la fluorescence de fond non spécifique.
NOTE: Il est de la plus haute importance de ne sélectionner que les régions de fond de bonne foi que cette correction a un impact considérable sur les valeurs finales. Zoom utilisant la loupe est recommandée lorsque vous effectuez des sélections.- Il peut également être utile de diviser le fond valeur générale corrigé par la surface du noyau en pixels (même que la prise du niveau moyen de gris / intensité par noyau) afin de minimiser toute influence de potentiel de signal de fond localisée nucléaire qui contribuent davantage à la densité intégrée valeur avec l'augmentation de la taille nucléaire (figure 3C).
- Soustraire fluorescence de fond à partir des objets de densité intégrée d'origine pour obtenir la valeur corrigée finale fond. Cette approche tient compte pour le champ potentiel de variation du champ de la fluorescence de fond non spécifique.
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Representative Results
Cellules fibroblastes et myogéniques purifiés peuvent être cultivées en milieu de différenciation adipocytaire pendant trois jours, suivie par du milieu de la nutrition adipogénique de ne importe où entre 7-30 jours pour évaluer leur potentiel de l'adipogenèse. Utilisation des populations cellulaires purifiées, Oil Red O en combinaison avec une coloration immuno-coloration pour les marqueurs de lignage adipogènes et myogéniques ont montré que seule la fraction de fibroblastes était capable de différenciation adipogène (figure 2). L'accumulation massive de graisse par les fibroblastes est visible à l'œil nu (panneau A), et de leur transdifférenciation complète est représentée par la très forte expression de PPAR γ nucléaire (Figure 2 panneaux de B & C et la figure 3). En 15 jours de traitement, ces cellules ont publié toute restante TE-7 (un antigène du tissu conjonctif) sur leur substrat (panneau D). En revanche, les cellules myogéniques maintiennent leur phénotype normal y compris l'expression de la desmine et la myosine lourdechaîne (Figure 2 panneaux E & F) et ne pas réguler positivement PPARy nucléaires (figure 3C).
Un exemple de l'analyse quantitative d'un champ de cellules myogéniques (desmine de +) est illustré à la figure 3. Le panneau B montre le domaine analysé, et le panneau A montre l'intensité de fluorescence quantifiée (après correction de fond). Ce procédé montre clairement la variation de l'expression de la myogénine dans des noyaux individuels à cette densité et le temps d'ensemencement point spécifique. La figure 3C montre l'utilité de la méthode de comparer directement les niveaux de facteur de transcription dans différents types de cellules sur un niveau, cellule par cellule. Ici, nous montrons que CD56 - fibroblastes musculaires expriment un niveau élevé des PPARy de facteurs de transcription adipogéniques alors CD56 + triés cellules myogéniques maintiennent seulement des niveaux très bas après une exposition à adipocytes milieu inducteur.
Figure 1:. Populations purifiées de cellules myogéniques et des fibroblastes obtenus par immunomagnétique bourrelet tri (AB) Après une semaine en culture triés cellules myogéniques expriment la molécule d'adhésion cellulaire de surface cellulaire CD56 (N-CAM) et le muscle spécifique intermédiaire filament desmine. Nucléaire Ki-67 expression fournit la preuve que ces cellules se multiplient. La coloration de la membrane cytoplasmique et constituants nucléaires est décrit dans le protocole étape 6.5. (CD) cellules myogéniques ne expriment pas le marqueur de fibroblastes TE-7. (E) fibroblastes provenant de muscle humain expriment TE-7 et (F) le plaquettaire transmembranaire α -derived du facteur de croissance du récepteur (récepteur PDGFRa). Barres d'échelle sont: (A) = 20 um; (B, C et E) = 200 um; (D & F) 50 &# 181;. M Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: CD56 musculaire dérivé humain - / TE-7 + CD56 + fibroblastes et / desmine + cellules myogéniques cultivées en adipocytes milieu inducteur (AIM). (A) fibroblastes isolées par MACS se différencient en adipocytes lorsqu'elles sont cultivées dans des adipocytes milieu inducteur (AIM) et ceci peut être vu facilement à l'oeil nu suivante Oil Red O coloration. Cellules myogéniques ne montrent aucun signe de différenciation adipocytaire après la même période de temps dans AIM et montrent très limité coloration Oil Red O. (B & C) Hfibroblastes dérivées du muscle Uman très expresse PPARy et CEBPα (non représenté) après culture dans AIM. (C) Comme les fibroblastes se différencient en adipocytes ils libèrent restants intracellulaire des protéines ECM qui forme un réseau dense autour d'eux. (E) cellulaire Myogenic maintenir leur myogénique la morphologie et de l'expression des marqueurs de la lignée telles que la desmine et (F) la chaîne lourde de myosine (MHC), un marqueur de différenciation myogénique terminal, et ne parviennent pas à se accumuler lipidique. Barres d'échelle sont: (B, D) = 200 um (E, F) = 100 um; (C) = 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Exemples de données obtenues fr om immunomarquées cultures en utilisant la méthode d'analyse d'image décrit (Adobe Photoshop approche élargie). (A) Une parcelle cellule par cellule intensité de fluorescence pour le muscle spécifique facteur de transcription nucléaire myogénine après 24 h en milieu de différenciation sans sérum. (B) micrographies représentatifs de desmine + / + myogénine des précurseurs myogéniques humaines. Barres d'échelle sont: (B) = 50 um (C) PPARy intensité de fluorescence dans des noyaux individuels de tri CD56 + / desmine + populations myogéniques (CD56 +) et CD56 - / TE-7 + / récepteur PDGFRa + / collagène VI + cellules (CD56. -) après culture en adipocytes milieu inducteur pendant 15 jours. Les valeurs de fluorescence ont été normalisées à la zone nucléaire pour tenir compte des variations de la taille nucléaire entre les deux types de cellules. Barres noires horizontales dans (A) et (B) montrent la moyenne.52049 / 52049fig3large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Composants moyennes | Concentration | Catalogue no. | Source commerciale |
| Milieu de croissance de muscle squelettique humain: | C-23060 ("prêt à utiliser" contenant tous les facteurs énumérés) | ||
| Le muscle squelettique milieu de base | - | PromoCell | |
| Sérum de veau fœtal | 15% | PromoCell (5%) et FCS Or, PAA Laboratories (10%) - No de Cat. A15-151 | |
| Fetuin (bovin) | 50 ug / ml | PromoCell | |
| Facteur de croissance épidermique | 10 ng / ml | PromoCell | |
| Facteur de croissance des fibroblastes de base (humaine recombinante) | 1 ng / ml | PromoCell | |
| Dexaméthasone | 0,4 ug / ml | PromoCell | |
| L'insuline (humaine recombinante) | 10 ug / ml | PromoCell | |
| Pénicilline | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycine | 100 pg / ml | Sigma | |
| L-Glutamine | 292 pg / ml | Sigma | |
| Milieu de différenciation myogénique | C-23260 | ||
| Le muscle squelettique milieu de base | - | PromoCell | |
| Pénicilline | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycine | 100 pg / ml </ Td> | Sigma | |
| Remarque: PromoCell, Heidelberg, Allemagne; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Royaume-Uni | |||
Tableau 1: culture cellulaire composants et concentrations médias.
| Composition du milieu | Concentration | Catalogue no. | Société |
| Moyenne Préadipocytes croissance | C-27410 (prêt à l'emploi) | ||
| Sérum de veau fœtal | 0,05 ml / ml | PromoCell | |
| Supplément de croissance des cellules endothéliales | 0,004 ml / ml | PromoCell | |
| Facteur de croissance épidermique (de humaine recombinante) | 10 ng / ml | PromoCell | |
| Pénicilline | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycine | 100 pg / ml | Sigma | |
| Glutamine | 292 pg / ml | Sigma | |
| D-biotine | 8,0 ug / ml | PromoCell | |
| L'insuline (humaine recombinante) | 0,5 ug / ml | PromoCell | |
| Dexaméthasone | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 ug / ml | PromoCell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazone | 3 ug / ml | PromoCell | |
| Pénicilline | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 pg / ml | Sigma | |
| Glutamine | 292 pg / ml | Sigma | |
| Milieu de différenciation Préadipocytes | C-27436 (prêt à l'emploi) | ||
| D-biotine | 8,0 ug / ml | PromoCell | |
| L'insuline (humaine recombinante) | 0,5 ug / ml | PromoCell | |
| Dexaméthasone | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 ug / ml | PromoCell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazone | 3 ug / ml | PromoCell | |
| Pénicilline | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 pg / ml | Sigma | |
| Glutamine | 292 pg / ml | Sigma | |
| milieu de la nutrition des adipocytes | C-27438 (prêt à l'emploi) | ||
| D-biotine | 8,0 ug / ml | PromoCell | |
| L'insuline (humaine recombinante) | 0,5 ug / ml | PromoCell | |
| Dexaméthasone | 400 ng / ml | PromoCell | |
| Pénicilline | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycine | 100 pg / ml | Sigma | |
| Glutamine | 292 pg / ml | Sigma | |
| Remarque: PromoCell, Heidelberg, Allemagne; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Royaume-Uni | |||
Tableau 2: Composition des adipogénique milieux de culture cellulaire.
| Nom de l'équipement / réactif | Société | Catalogue no. | Commentaires / Description |
| La culture cellulaire | Collagénase D | Roche | 11088866001 |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Doit être stérilisé par filtration avant utilisation |
| La trypsine / EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 um cellule crépine | BD Biosciences | 352360 | |
| solution de collagène (3 mg / ml dans de l'acide acétique à 0,1%) | Sigma, Dorset, Royaume-Uni | C8919 | |
| Filtre seringue Minisart SRP15 (0,2 um) | Sartorius | 17573ACK | Polytétrafluoréthylène (PTFE) membrane |
| CD56 microbilles humains | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Magnétique tri cellulaire activé (MACS) Soyez conscient de la durée de vie limitée de microbilles |
| Microbilles anti-fibroblastes, humaine | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 um filtres de pré-séparation | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Grandes collumns cellulaires | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | Ces colonnes sont livrés avec une résistance à l'écoulement. Utilisation de la résistance à l'écoulement ne est pas nécessaire d'obtenir des puretés élevées myogéniques décrites ici. |
| LS colonnes | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | Ce séparateur est compatible avec la colonne à grandes cellules mais pas la colonne de LS. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Doit être stérilisé par filtration avant utilisation | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Lipid coloration |
| Phosphate de triéthyle | Sigma | 538728 | |
| Papier Whatman | Sigma | Z241121-1PAK | N ° 42, sans cendre. Pour préparer le filtre plier le papier filtre circulaire pour faire un demi-cercle, puis pliez le demi-cercle dans la moitié encore pour former une forme de cône. Monter le cône dans un entonnoir pour le filtrage. |
| Montage | |||
| Or prolonger Antifade réactif | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | Cela peut être acheté avec ou sans DAPI et ne éteint pas fluorescence initiale. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contactez Zeiss | Logiciel Image aquisition |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (acheté chez Pugh Ordinateurs) | ADPH16982 * | un logiciel d'analyse d'image |
Tableau 3: Équipement et réactifs.
| Nom / antigène | Les espèces d'anticorps isotype et | Nom Clone | Dilution pour l'utilisation | Catalogue no. | |
| Marqueurs myogéniques: | |||||
| CD56 (N-CAM) | Souris IgG 1 mc | MON-31 | (1: 100) | 347740 | BD |
| Desmin | Lapin IgG 1 mc | D93F5 (XP) | (1: 250) | 5332S | ONÉ |
| Myogenin | Souris IgG 1 mc | F5D | (01:50) | F5D | DSHB |
| Chaîne myosine lourd | Souris mc IgG2b, chaîne légère kappa | MF20 | (1: 200) | MF20 | DSHB |
| Fibroblastes / conjonctif | |||||
| timarqueurs uestion: | |||||
| Anti-fibroblastes humains | Souris IgG 1 mc | TE-7 | (1: 100) | CBL271 | Millipore |
| PDGFRa | Lapin IgG mc | D13C6 | (1: 500) | 5241 | ONÉ |
| Marqueurs de prolifération: | |||||
| Ki67 | Lapin IgG mc | SP6 | (1: 200) | MP-325-CRM1 | MD |
| Adipogenic | |||||
| facteurs de transcription: | |||||
| PPARy | Souris IgG 1 mc | E8 | (01:20) | Sc-7273 | Santa Cruz Biotechnology |
| Key: mc: monoclonal,pc: polyclonaux, DSHB: études sur le développement Hybridoma Banque, Iowa Etats-Unis; | |||||
| ONÉ: New England BioLabs, au Royaume-Uni; MD: A. Menarini Diagnostics, au Royaume-Uni; BD: BD Bioscience, Royaume-Uni. | |||||
Tableau 4: Anticorps primaires.
| Antigène | Les espèces d'anticorps isotype et | Dilution | Catalogue no. | Société |
| Alexafluor488 | De chèvre anti-souris IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11001 | MP |
| AlexaFluor 594 | De chèvre anti-souris IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11005 | MP |
| AlexaFluor 594 | De chèvre anti-lapin IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11012 | MP | </ Tr>
| Key: H + L = chaînes lourdes et légères; MP: Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Paisley Royaume-Uni | ||||
Tableau 5: Les anticorps secondaires.
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Discussion
Nous avons décrit un procédé de tri immunomagentic pour l'enrichissement sélectif de précurseurs musculaires humaines dérivées à partir de petits échantillons de matériau de biopsie musculaire. Cette technique a été inestimable dans notre laboratoire pour surmonter la perte de cultures dérivées du muscle de fibroblastes humains, mais également pour comprendre le comportement unique de populations distinctes de progéniteurs dérivées du muscle. Cellules myogéniques Une fois purifiés peuvent être étudiés pour des changements dans les protéines et / ou l'expression du gène, ou utilisés pour des expériences en aval.
En plus de la purification de cellules, nous avons également en détail un procédé rapide et simple de l'analyse des régions spécifiques d'intérêt dans des micrographies de microscopie de fluorescence. Images numériques de microscopie par fluorescence contiennent une mine d'informations pour les biologistes cellulaires pour extraire; en effet pixels contiennent des données qui ne est pas discernable nécessairement à l'oeil humain. Avec cette technique, les données quantitatives peuvent être obtenus sur une grand nombre des cellules individuelles dans une population. Une caractéristique unique de l'analyse d'image par rapport à la cytométrie en flux est de pouvoir établir une corrélation entre les changements dans l'expression de protéines à des changements dans les interactions cellulaires orcell-forme de la cellule. En outre, la capacité de créer et d'enregistrer des masques de sélection optimisés et représentatives permet des mesures rapides, précises et reproductibles à faire dans de nombreux domaines de vue, réduisant ainsi le risque de biais de l'utilisateur.
La purification de cellules basée MACS-
Un avantage de cette méthode est que les cellules peuvent être purifiées avec succès, soit immédiatement après isolement ou après quelques jours de culture (quand le rendement sera élevé).
Fondamentalement, les cellules myogéniques ne devraient pas être autorisés à devenir confluentes avant le tri parce que cette entrave leur passage à travers la colonne, et permettra de réduire la proportion de cellules prolifératives obtenus pour l'expansion et l'expérimentation.
t "> En fonction de l'échantillon de tissu initial obtenu, il peut y avoir un nombre élevé de globules rouges non-adhérentes de la culture à ce stade. Des méthodes existent pour sélectivement érythrocytes lysent toutefois à éviter tout stress chimique nécessaire pour les cellules de cette dérivées du muscle étape est évitée. Nous ne avons pas observé d'impact négatif notable des érythrocytes sur le début de la culture des cellules musculaires humaines dérivées, et ces érythrocytes sont éliminés par les changements de supports fois cellules myogéniques attachent.D'autres procédés de détachement des cellules juste avant le tri (par exemple, d'autres proteases douces ou les méthodes basées EDTA) peuvent être utilisés pour des cellules dans lesquelles l'expression de l'antigène de surface cellulaire est faible ou particulièrement sensibles à une digestion tryptique. L'expression de CD56 sur les cellules myogéniques humaines est solide et résistant à un court trypsinsation (lors de l'analyse avec les anticorps décrits ici).
Il est important que le tampon de tri contient de l'EDTA pour inhiber calcium dépendant adhésion cellule-cellule; ce qui est crucial pour l'obtention (et maintenir) une suspension à cellule unique pour le tri. En fonction du nombre de cellules, la forme et les dimensions à trier, il ya un choix à faire en ce qui concerne la colonne de séparation (voir tableau 3).
Retrait de la colonne du champ magnétique pour libérer les cellules retenues peut être difficile alors se assurer que le tube de collecte (même si jupe) est placé dans un support positionné très près de la colonne pour éviter la perte de cellules en transit.
Bien que nous avons décrit cette technique pour une utilisation avec des cellules primaires humaines de muscle squelettique, ce protocole peut être facilement adapté à d'autres types de cellules pour lesquels un marqueur de surface cellulaire spécifique / unique est connu. D'autres avantages comprennent le fait que l'ensemble de la procédure peut être effectuée dans l'environnement de travail de la hotte à flux laminaire. En outre, la procédure est plus doux MACS sur les cellules de tri FACS par rapport à cause de la faibleforces de cisaillement et peuvent être un avantage particulier pour des cellules plus grandes. Les billes magnétiques utilisées sont de petite taille, non-toxique et biodégradable en culture. En effet, MACS a été appliquée avec succès pour la purification et l'étude d'un certain nombre d'autres types de cellules.
Une limitation de cette technique est que MACS peut pas facilement être réalisée simultanément pour plusieurs marqueurs. En outre, la quantité de marqueur et la taille des cellules ne peut être déterminée au cours du processus de tri, seulement par la suite.
Considérations pour l'optimisation de l'acquisition et analyse d'images
Procédé d'analyse d'image démontré ici fournit un outil puissant pour élucider les changements dans le niveau d'expression de protéines sur une base cellule par cellule dans de grandes populations de cellules. En exploitant les couches installations et de sélection des masques dans un logiciel largement disponibles, l'expérimentateur peut objectivement sélectionner les signaux fluorescents différents sur plusieurs images, pour permettrela quantification de caractéristiques individuelles, et un nombre quelconque de composants en leur sein. Nous avons utilisé avec succès ce procédé pour quantifier et comparer directement l'intervalle de facteur de transcription expression dans différentes populations de cellules exposées à un défi adipogénique.
Chaque canal de fluorescence (représentant un marqueur spécifique) peut être séparée des autres et activé ou désactivé selon les besoins, ce qui est utile pour le multi-couleur des expériences de Immunomarquage.
Un certain nombre de facteurs doivent être pris en considération lorsque l'on tente d'extraire des données quantitatives ou semi-quantitatives de la microscopie de fluorescence 28. Attention à ces mesures permettra de semi-quantitatives de base à faire. Souvent les chercheurs souhaitent utiliser un certain nombre de fluorochromes pour étiqueter différentes protéines d'intérêt; primordial est la possibilité de pouvoir faire la distinction entre les spectres d'émission individuelle. Dans la plupart des cas, cela est réalisé par excitat sélectifion d'un seul fluorochrome à la fois. Toutefois, si spectres d'émission et / ou excitation se chevauchent de manière significative ou sont insuffisamment filtrées puis saignent-travers ou diaphonie peuvent compromettre l'exactitude des données d'image obtenues. Saigner à travers est le passage de l'émission de fluorescence dans un canal de détection inappropriée et est causée par un chevauchement des spectres d'émission 29,30.
Quelques points à considérer sont: le choix fluorochromes qui ont excitation bien séparées et les spectres d'émission, en utilisant des longueurs d'onde d'excitation très sélectifs (comme est réalisé par des lasers en microscopie confocale), se assurer que les jeux de filtres d'émission sont suffisamment rigoureuse pour exclure les longueurs d'onde non désirées, et effectuer une imagerie multicolore sur la plus longue (ce est à dire, le «plus rouge ') de longueur d'onde de pic d'émission colorant premier à tenir compte du fait que les spectres d'absorption sont généralement biaisée en faveur des longueurs d'onde plus courtes (lumière bleue), tandis que les spectres d'émission sont biaisés vers plus Wavelengths (lumière rouge). Les spectres des marqueurs fluorescents sont disponibles dans "Fluorescence Spectraviewer 'fournies par Invitrogen.
L'utilisation d'objectifs de qualité est crucial pour les images destinées à l'analyse. Une ouverture numérique élevée (> 1,3) est la meilleure et grossissement doit être adaptée à l'appareil photo en microscopie à champ large. Dans les deux grand champ et la microscopie confocale, la NA est essentielle, comme z améliore la résolution en fonction de l'ouverture numérique au carré 29. Lorsque ce est possible de faire usage de lentilles plan-apochromatique qui sont corrigées pour les aberrations sphériques et chromatiques 29. Utilisation de guides de lumière liquides est fortement recommandé, car ils réduisent éclairage inégal en brouillant l'éclairage de source afin de réduire la cohérence spatiale et temporelle avant son entrée dans l'objectif de microscope 29.
Il est important d'éviter la saturation de l'image, sous forme de pixels saturés peuvent pas être correctement quantified due à l'écrêtage de l'information au niveau de gris plus intense valeurs 26.
Divers 'plugins' peuvent être disponibles pour permettre des procédures de correction de champ plat pour effectué avec une relative facilité; par exemple le Dr John C. Russ a fait beaucoup de ces disponible gratuitement en ligne (http://www.drjohnruss.com/download.html). En utilisant ce plugin le rapport de la luminosité de chaque pixel dans la micrographie expérimental à celui correspondant à l'image de référence est calculé et remplace l'original. Les résultats sont ensuite mis à l'échelle pour remplir la gamme de luminosité de l'image. Alternativement, le calculateur de l'image de ImageJ est un autre moyen de correction pour l'éclairage inégal.
Pour une analyse d'image, la microscopie confocale peut être la méthode de choix car elle empêche fluorescence hors de mise au point d'atteindre le détecteur 29. Cependant, cette approche peut prendre beaucoup plus longtemps que la microscopie de fluorescence à champ large, limitant la engourdieer de champs de vue individuels qui peuvent être obtenus en une seule séance.
Récemment d'autres méthodes ont été rapportés pour l'enrichissement de cellules myogéniques de tissu musculaire humaine. Bareja 31 utilisé une combinaison de l'épuisement MACS (pour: CD11b, CD31, CD34 et CD45) suivie par FACS pour la sélection positive de CXCR4 + / CD56 + cellules myogéniques. Cependant, bien que cette procédure a été capable de générer une population myogénique hautement enrichi, il est considérablement plus long que le procédé détaillé ici, contient beaucoup plus d'étapes consécutives et conduit à un rendement plus faible de cellules myogéniques purifiés inférieurs par gramme de tissu.
Dans une autre étude récente, Castiglioni 32 cellules myofibres associée isolées de muscle fœtal humain par FACS en utilisant des marqueurs multiples et ont montré que CD34 - / CD56 + / Pax7 + (cellules satellites archétypales) peuvent présenter ostéogénique ainsi que la lignée myogénique potential, mais en général d'accord avec notre travail ne présentent pas de potentiel adipogénique. Ces auteurs ont également montré que CD34 + / Pax7 - cellules étaient non myogénique, mais étaient capables de différenciation adipocytaire et ostéogénique. L'enrichissement de l'expression de CD90 (un marqueur de fibroblastes musculaires 33) dans la CD34 + fraction non myogéniques suggère qu'une grande partie de ces cellules peuvent avoir été fibroblastes, qui se sont révélés être la principale source d'adipocytes dans le muscle squelettique humain adulte cultures (référence 5 et Figure 2). Que fibroblastes musculaires dérivés ont aussi ostéogéniques bons de potentiels de différenciation plus d'enquête.
Contrairement à la méthode de Castiglioni 32, notre méthode ne nécessite qu'un seul anticorps (par opposition à 7) pour obtenir de façon reproductible avec des rendements élevés des cultures de cellules myogéniques pur et peut être réalisée rapidement dans les conditions d'asepsie d'une hotte à flux laminaire. Un autre methodological différence est que ces auteurs isolés directement à partir de cellules musculaires dissociée puis suivi ces dans la culture, alors que nous avons le plus souvent des cellules de culture pour 1 semaine avant le tri et de cultiver. Dans nos mains cette approche est mieux toléré par les cellules. Fait important, la durée totale de la culture est essentiellement équivalente entre les deux approches. En outre, étant donné que le muscle squelettique du fœtus subit hyperplasique et hypertrophique musculaire croissance de 34 il ne est pas surprenant que le rendement des précurseurs myogéniques est supérieure à partir de tissu musculaire du fœtus par rapport au muscle adulte
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
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References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
