Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Résumé

Les principaux types de cellules adhérentes dérivées du muscle humain sont les cellules myogéniques et les fibroblastes. Ici, les populations cellulaires sont enrichies à l’aide d’un tri cellulaire activé par magnétisme basé sur l’antigène CD56. L’immunomarquage ultérieur avec des anticorps spécifiques et l’utilisation de techniques d’analyse d’images permettent de quantifier les caractéristiques cytoplasmiques et nucléaires dans les cellules individuelles.

Résumé

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites, qui sont les cellules souches musculaires résident. Ceux-ci peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie de muscle humain en utilisant une digestion enzymatique et leurs propriétés myogéniques étudiés en culture. Quantitativement, les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues par digestion enzymatique sont les suivantes: (i) les cellules satellites (appelées cellules myogéniques ou de cellules précurseurs de muscle), identifié initialement comme CD56 ⁺ et par la suite en tant que CD56 ⁺ / desmine ⁺ cellules et (ii) muscle- fibroblastes dérivés, identifiés comme CD56 ^- et TE-7 ^+. Fibroblastes prolifèrent très efficacement dans la culture et dans les populations de cellules mixtes ces cellules peuvent dépassement cellules myogéniques de dominer la culture. L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné ou l'autre type de cellules en culture. Ici, nous DESCRBIE un système de tri basé sur la digestion enzymatique douce de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie magnétique tri cellulaire activé (MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et avec un bon rendement (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ cellules / g de tissu après 7 jours in vitro) pour les expériences de culture. Cette approche repose sur l'incubation de la population de cellules dérivées du muscle mixte avec des microbilles magnétiques des billes conjuguées à un anticorps dirigé contre CD56 et puis en faisant passer les cellules si un champ magnétique. CD56 ⁺ liés à microbilles sont conservés par le champ tandis CD56 ^- cellules passer sans entraves à travers la colonne. Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées et cultivées. Suite à une intervention donnée, la morphologie cellulaire et l'expression et la localisation des protéines, y compris des facteurs de transcription nucléaires peut être quantifiée en utilisant un marquage par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques et une image pe traitement et logiciel d'analyse.

Introduction

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites ^1, les cellules souches myogéniques ^2,3. In vivo ces cellules existent dans un état ​​réversible de repos située entre le sarcolemme et lame basale de chaque myofibre, mais se activent à proliférer, fusible et de différencier que le tissu musculaire est endommagé, réparer et régénérer ^3. Les cellules satellites peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie musculaire humaine jeunes et les personnes âgées en utilisant une digestion enzymatique ⁴ et leurs propriétés myogéniques peut ensuite être étudié ....

Protocole

NOTE: Pour les études réalisées dans notre laboratoire tous les sujets ont donné leur consentement écrit et éclairé à participer et à toutes les expériences ont été réalisées avec l'approbation du Comité d'éthique du National Health Service au Royaume-Uni (Comité éthique de la recherche de Londres; référence: 10 / H0718 / 10) et conformément aux la Loi sur les tissus humains et de la Déclaration d'Helsinki.

1. Préparation initiale Avant la biopsie musculaire (15 min)

1. Faire milieu de croissance de muscle squelettique humain. Pour un 50 ml tube conique stérile graduée ajouter 2,5 ml du mélange de supplément, 10 ml de ....

Résultats

Cellules fibroblastes et myogéniques purifiés peuvent être cultivées en milieu de différenciation adipocytaire pendant trois jours, suivie par du milieu de la nutrition adipogénique de ne importe où entre 7-30 jours pour évaluer leur potentiel de l'adipogenèse. Utilisation des populations cellulaires purifiées, Oil Red O en combinaison avec une coloration immuno-coloration pour les marqueurs de lignage adipogènes et myogéniques ont montré que seule la fraction de fibroblastes était capable de différenciation adipogène <.......

Discussion

Nous avons décrit un procédé de tri immunomagentic pour l'enrichissement sélectif de précurseurs musculaires humaines dérivées à partir de petits échantillons de matériau de biopsie musculaire. Cette technique a été inestimable dans notre laboratoire pour surmonter la perte de cultures dérivées du muscle de fibroblastes humains, mais également pour comprendre le comportement unique de populations distinctes de progéniteurs dérivées du muscle. Cellules myogéniques Une fois purifiés peuvent être étudiés pour des chang.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase  ; D	Roche  ;
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Doit être stérilisé par filtre avant utilisation
Trypsine/EDTA(	Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μ ; Passoire à cellules m	BD Biosciences	352360
Solution de collagène (3 mg/ml dans de l’acide acétique à 0,1 %)	Sigma, Dorset, Royaume-Uni	C8919  ;
Filtre seringue Minisart SRP15 (0,2 μ ; m)	Sartorius	17573ACK	Membrane en polytétrafluoréthylène (PTFE)
CD56 microbilles humaines	Miltenyi Biotech	130-050-401	Soyez conscient de la durée de conservation limitée des microbilles
Microbilles anti-fibroblastes, humaines	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 &mu ; m Filtres de pré-séparation	Miltenyi Biotech	130-041-407
Capteurs à grandes cellules	Miltenyi Biotech	130-042-202	Ces colonnes sont équipées d’une résistance d’écoulement. L’utilisation de la résistance d’écoulement n’est pas nécessaire pour obtenir les puretés myogéniques élevées décrites ici.
Colonnes LS  ;	Miltenyi Biotech	130-042-401
Séparateur MiniMacs	Miltenyi Biotech	130-042-102	Ce séparateur s’adapte à la colonne à grandes cellules mais pas à la colonne LS.  ;
MidiMACS	Miltenyi Biotech  ;	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Doit être stérilisé par filtre avant utilisation
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	N° 42, sans cendres. Pour préparer le filtre, pliez le papier filtre circulaire pour faire un demi-cercle, puis pliez à nouveau le demi-cercle en deux pour former un cône. Insérez le cône dans un entonnoir pour le filtrage.  ;
réactif anti-décoloration ProLong Gold	, Invitrogen	P36930	Cela peut être acheté avec ou sans DAPI et n’éteint pas la fluorescence initiale.
AxioVision	Carl Zeiss	Contacter Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (acheté auprès de Pugh Computers)	ADPH16982*  ;

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