Protocol
NOT: tarif Deneysel protokoller burada Ortabatı Üniversitesi'nde yapılan Ortabatı Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmıştır.
1. Oda Gereksinimleri
- Sıcak ve soğuk su çalışan bir prosedür odası ve katta, tanktan, tipik bir drenaj su çıkarmak için bir yol sabitleyin.
- Dalış tankı yerleştirmek için bir çalışma tablosu kullanın. Zemin drenaj ile Odalar genellikle drenajı için kontürlenerek yana, lastik Stoper kısmak ve tankında masa üstü ve dolayısıyla su yüzeyi, seviye olmasını sağlamak için masa ayakları altına koyun.
2. Dalış Tank
- Dalış Deposu İnşaatı
- Yan duvarların (Şekil 1) pleksiglastan imal alt ve 1/2 kalın Plexiglas 3/4 kullanılarak dikdörtgen tankı (100 x 60 x 15 cm) oluşturmak. Kalıcı birlikte siyanakrilat çimento veya Solvent kullanarak tankın dışında pleksiglas parçaları takmakBöyle triklormetan gibi ts.
- 85 x 15 cm parçalar halinde kesilmiştir çıkarılabilir 1/2 inç kalınlığında Pleksiglas kullanılarak 5 kanal uzunlukları yaklaşık olarak 100 cm içine tankı bölün. Kalıcı alt oluk ve bu kanal bölücü pozisyona oluklu olabilir içine, tankın kenarlarını yerleştirin.
- Bir sualtı dalış "tünel için bir" çatı "oluşturmak için kanal bölücüler yatay pleksiglas parçaları Askıya.
- Fareler için bir çıkarılabilir yükseltilmiş platform, "bitiş alanı", sudan dışarı çekmek ve yüzme ve dalış denemeleri arasında dinlenmek için tankı yer bir köşesinde. Sıçanlar genellikle kendilerini damat ve süre bitiş alanında kendi kürk su çıkarmak. Sıçanlar eğitim denemeleri arasındaki platformda kalması sigorta bitiş alanın kenarlarında uzun boylu tarafını yerleştirin.
- Bitiş alanından tankın ters köşesinde sadece labirent sualtından erişimi sağlayan bir odasına yerleştirin. Bu çıkarılabilir "bir başlangıçrea "sadece dalış denemeleri için kullanılır.
NOT: Başlangıç odasının içinde bir platform üzerinde otururken bir sıçan suya indirilir bir dalış davanın başında; dolayısıyla bu platformu "asansör" denir.
NOT: başlangıç alanı, bitiş alanı ve tüm kanallar bölücüler tanktan çıkarılabilir modüler bir tasarıma kullanın. 1) doldurma ve tüm kanal bölücüler çıkarıldıktan sonra su ile Boşalttıktan kolaylaştırmak için, ve bir sıçan şaşırmış alırsa özellikle sualtı iken 2), parçaları hızla gelen sıçan kurtarmak için demonte edilebilir: Bu iki nedenden dolayı yapılır su.
- Dolum ve suyla Boşalttıktan
- Su ile Tank Dolum
- Her eğitim oturumunun başında, yaklaşık 12 cm derinliğe taze 32 ° C musluk suyu ile doldurun. Sıcak veya soğuk cepler en aza indirmek için tankın içindeki su ilave edin.
NOT: Tipik 12 sıçan tren yaklaşık 2 saat sürer. Bu süre zarfındaSu sıcaklığı yaklaşık 4 ° C azalır. Eğitim oturumunun sonunda su yaklaşık 28 ° C soğur. 30 ° C su yerine oda sıcaklığında su yerine, bu sıcak su kullanarak, sıçanlara termonötral olduğundan, tekrarlayan eğitim sırasında ısı kaybını en aza indirecektir.
- Her eğitim oturumunun başında, yaklaşık 12 cm derinliğe taze 32 ° C musluk suyu ile doldurun. Sıcak veya soğuk cepler en aza indirmek için tankın içindeki su ilave edin.
- Su ile Tank boşaltma
- Her eğitim oturumunun sonunda, böyle 1 inç iç çapı boru 4 m uzunluğunda bir parça olarak, büyük bir hortum kullanarak tanktan suyu boşaltın. Tamamen hava cepleri, boru içindeki olmasının sağlanması, tank içindeki boru daldırın. Hızla zemin drenaj içine hortumun bir ucunu yerleştirin. Oluşan sifonlamakla etkisi tanktan suyu drenaj olacaktır.
- Su yüzeyinin altında, boru tank ucunu tutmak sifon korumak için birlikte, suyun tamamen drenajını kolaylaştırmak üzere kenarında tankı ucu.
NOT: Alternatif olarak, ve oldukça sifonlamakla daha tankın tabanına yakın bir musluk takmak ve bağlamaktanktan bir hortum zemin drenaj için dokunun.
- Su ile Tank Dolum
3. Rat Alerjen Hususlar
- Taşıma ve sıçanlar eğitim ne zaman atılabilir eldiven giyin. Eldivenler değişmez sıçan idrar içerir tank içindeki su ile temas sınırlayacaktır.
NOT: sıçanlar eğitim sırasında ıslak olacak, ve oda "ıslak-sıçan" koku ile dolu olacak. Sonuç olarak, anti-histamin profilaktik rejim önlemek veya sıçan alerji etkilerini sınırlayabilir. Onlar sıçan alerjenlere duyarlı hale gerekir Eğitmenler ayrıca, tek kullanımlık toz maskeleri, veya N95 maske takması gerekebilir.
4. Swim Eğitim
- Günlük yüzme eğitim
NOT: Kişisel deneyim genç sıçanlar daha iyi ve daha hızlı labirent öğrenmek ve böylece yetişkin fareler kullanarak tercih 35 gr yeni sütten sıçan ile eğitime başlamadan belirtir.- Su ile doldurun. 2.2.1 bakın.
- Ekle bitirmekalanı ve kanal bölücüler 5 yüzme kanalları oluşturmak için.
- İlk eğitim oturumu sırasında hafifçe bitiş alanında 3-5 cm'lik suya elle sıçan indirin.
NOT: ilk yüzen hissi karşılaşmak gibi su sıçanlarda katılımları kararsız belirecektir. Sonunda yakındaki bitirmek alana ulaşmadan, su çıkmak için bir yol bulmaya çalışırken sıçanlar bir koordinasyonsuzluk şekilde yaklaşık kürek olacaktır. Nedeniyle yüzmek onların doğuştan yeteneği, daha sonraki çalışmalarda fareler bitiş alanına doğru çok daha koordineli bir şekilde yüzeceğim.
NOT: kendi ayakları araştırmacılar ellerinde yüzden alttan fareleri destekleyin. Yavaşça suya sıçan düşürmek, ve bunları yerine su içine bırakarak daha elden uzak yüzmeye izin. - Denemeler arasında fareler en az 1 dakika için bitiş bölgesinde bırakınız. Bu da bir "güvenli" bir yer olarak bitirmek alanını kabul, böylece sıçan damat ve keşfetmek için izin vermektirdenemeler arasında gitmek için. Bu bir sonraki deneme başlatmak için geri suya konumlandırma hemen sadece bir araştırmayı tamamladıktan bir sıçan kapma ve aksine olduğunu.
NOT: beyinde ödül devrelerinin aktivasyonunu önlemek için, eğitim sırasında harici ödül (örneğin, gıda) kullanmayın. - Bitiş alanı bekleme döneminden sonra, yavaşça bir sonraki duruşma başlamadan önce 1 dakika boyunca sıçan tutun. Yavaşça çok ıslak almak fareler neden olacaktır suya tekrarlayan girişinden bu yana bu duruşma öncesi beklemeye sırasında bir havlu ile sıçan kurutun ve bunların kurutulması hipotermi önlemek olacaktır.
- 4.1.3 tekrarlayın. 4.1.5 aracılığıyla. Her sıçan günlük yüzme eğitim oturumu sırasında eğitim için 3-5 deneme tamamlamak için.
- Tüm kanal bölücüler çıkarın ve tank alanını bitirmek.
- Tanktan suyu boşaltın. 2.2.2 bakın.
- Haftalık yüzme eğitim programı
- Davranış günlük eğitim seansları (bakınız 4.1.) Haftada 5 gün, ideal olarak aynı andaHer gün.
- Başarıyla önceki gün müzakere mesafeden ilk deneme başlayacak. Artan bir mesafe ile ikinci ve üçüncü deneme başlar.
- Her sonraki günlük eğitim oturumu fareler su ve bitiş alanında nereye yerleştirileceğini arasındaki mesafeyi artırın. İlk birkaç eğitim oturumları için 5-10 cm, bu mesafeyi artırın. Sıçanlar yüzme ile daha rahat görünür sonra, 30-50 cm mesafeyi artırır.
- Sıçanlar yüzmek kanalının düz bir kısmını yüzmeyi öğrenirken bir yandan yüzme mesafelerde daha artırır kullanın. Buna karşılık, saç tokası yüzmeyi öğrenme 2-3 eğitimler alabilir kanallar arasında döner.
NOT: Genellikle, bitiş alanında beklerken, sıçanlar yüzmek için suya tekrar girecek, ve / veya hala bitiş alanı platformda otururken kendi kafa sualtı daldırın. - Tüm 5 kanallarının başarılı yüzme sağlamak için 3 hafta boyunca bu günlük eğitim protokolü tekrarlayın.Bu tekrarlayan eğitim protokolü labirent sol ve sağ saç tokası döner alternatif kapsadığı için, labirent başarılı tamamlanmasını sağlar.
5. Dalış Eğitimi
NOT: sıçan başarıyla labirent aracılığıyla yüzme müzakere öğrendikten sonra onlar dalış eğitimi başlatmak için hazırız.
- İlk dalış eğitimi (ilk gün)
- Başlangıç odasına yerleştirin. Suyla haznesini doldurun (2.2.1 bkz.). Emin olun su seviyesi başlangıç alana açılması altında 1 cm.
- Finiş alanına yerleştirin ve kanal bölücüler 5 yüzme kanalları oluşturmak için.
- İlk dalış oturumu sırasında fareler başlangıç odasının içinde suya Asansörde indirdi yetiştirmek. Labirent erişim başlangıç odasının altına kadardır. Sıçan kolayca labirentin içine başlangıç odasından yüzebilirsiniz böylece bu birinci oturumu sırasında su seviyesi yeterince düşük. Sıçan labirent aracılığıyla yüzmeye devam izinBitiş alanı.
- Denemeler arasında fareler en az 1 dakika için bitiş bölgesinde bırakınız.
NOT: beyinde ödül devrelerinin aktivasyonunu önlemek için, eğitim sırasında harici ödül (örneğin, gıda) kullanmayın. - Bitiş alanı bekleme döneminden sonra, yavaşça bir sonraki duruşma başlamadan önce 1 dakika boyunca sıçan tutun. Yavaşça bu duruşma öncesi beklemeye sırasında bir havlu ile sıçan kurulayın.
- 5.1.3 tekrarlayın. 5.1.5 aracılığıyla. Her sıçan bu ilk dalış eğitim oturumu sırasında eğitim için 3 deneme tamamlamak için.
- Tüm kanal bölücüler çıkarın odasını başlatmak ve tank alanını bitirmek.
- Tanktan suyu boşaltın. 2.2.2 bakın.
- İlk dalış eğitimi (ikinci gün)
- Başlangıç odasına yerleştirin. Suyla haznesini doldurun (2.2.1 bkz.). Su seviyesi biraz başlangıç alana açılması üzerinde olduğundan emin olun.
- Finiş alanına yerleştirin ve kanal bölücüler 5 yüzme kanalları oluşturmak için.
- İkinci dalış sırasındao sıçan labirente girmek başlangıç odasının kenarına altında başını daldırma vardır başlangıç odasına çıkmak için çok eğitim oturumu su seviyesi yükseltilmiştir. Sıçan ilk dalış olarak düşünün. Daha sonra sıçan bitiş alanına labirent aracılığıyla yüzmeye devam izin verin.
- Sıçanlar denemeleri arasında en az 1 dakika için bitiş bölgesinde bırakınız.
NOT: beyinde ödül devrelerinin aktivasyonunu önlemek için, eğitim sırasında harici ödül (örneğin, gıda) kullanmayın. - Bitiş alanı bekleme döneminden sonra, yavaşça bir sonraki duruşma başlamadan önce 1 dakika boyunca sıçan tutun. Yavaşça bu duruşma öncesi beklemeye sırasında bir havlu ile sıçan kurulayın.
- 5.2.3 tekrarlayın. 5.2.5 aracılığıyla. Her sıçan bu dalış eğitim oturumu sırasında eğitim için 3 deneme tamamlamak için.
- Tüm kanal bölücüler çıkarın odasını başlatmak ve tank alanını bitirmek.
- Tanktan suyu boşaltın. 2.2.2 bakın.
- İlk dalış eğitimi (tHird gün)
- Başlangıç odasına yerleştirin. Su seviyesi başlangıç alanına açıklığının üzerindeki sağlamak, su (2.2.1 bakınız.) Ile doldurun.
- Finiş alanına yerleştirin ve kanal bölücüler 5 yüzme kanalları oluşturmak için. Hemen 5 cm uzunluğunda dalış tüneli oluşturmak için başlangıç alanının dışında pleksiglas yatay parça yerleştirin.
- Üçüncü dalış, antrenman sırasında sıçan başlangıç odasının kenarına altında başını daldırma ve yüzmek kanalın açık su ulaşmak için sualtı 5 cm yüzmek zorunda. Daha sonra sıçan bitiş alanına labirent aracılığıyla yüzmeye devam izin verin.
NOT: Başlangıç alana yerleştirilen sonra, sıçanlar kendi sualtı batıklığı başlatmak ve böylece bu "gönüllü" dalışlar olarak kabul edilir. - Sıçanlar denemeleri arasında en az 1 dakika için bitiş bölgesinde bırakınız.
NOT: beyinde ödül devrelerinin aktivasyonunu önlemek için, eğitim sırasında harici ödül (örneğin, gıda) kullanmayın. - Bitiş alanı bekleme döneminden sonra, yavaşça bir sonraki duruşma başlamadan önce 1 dakika boyunca sıçan tutun. Yavaşça bu duruşma öncesi beklemeye sırasında bir havlu ile sıçan kurulayın.
- 5.3.3 tekrarlayın. 5.3.5 aracılığıyla. Her sıçan bu dalış eğitim oturumu sırasında eğitim için 3-5 deneme tamamlamak için.
- Tüm kanal bölücüler çıkarın odasını başlatmak ve tank alanını bitirmek.
- Tanktan suyu boşaltın. 2.2.2 bakın.
- Haftalık dalış eğitim programı
- Davranış günlük eğitim seansları (5.3 bakınız.) 5 gün, haftada ideal aynı zamanda her gün.
- Başarıyla önceki gün müzakere mesafeden ilk deneme başlayacak. Artan dalış mesafe ile ikinci ve üçüncü denemeler başlayın.
- Her sonraki günlük eğitim oturumu fareler sualtı yüzmek zorunda mesafeyi uzatmak için ek yatay bölücüler ekleyerek dalış tünelin uzunluğunu artırmak. Ilk birkaç eğitim oturumları artış thi için5-10 cm s mesafe. Sıçanlar dalış ile daha rahat görünür sonra, 30-50 cm mesafeyi artırır.
NOT: ardışık çalışmalar sırasında girişiminde dalış mesafe overextend etmeyin. Gerekirse, kısa dalış mesafeleri sağlamak için yatay kanal kapağının ucunu yukarı kaldırın. Bir dalış duruşma sırasında bir sıçan dalış tünelin sonuna ulaşmak ve hızlı bir şekilde, etrafında sualtı çevirmek kanal kapağının ucunu yukarı kaldırın ve sıçan yüzey ve onun yüzmek devam etmek için izin başlar vermez. Bu başarılı uzun bir dalış mesafe tamamlamak için sıçan sağlayacaktır. Bu pozitif takviye, her dalış deneme ile sualtı tünelden ilerlemeye sıçan devam edecektir. - Sıçanlar bir yüzme kanalın bir düz parçaya dalış öğrenme sırasında dalış mesafelerde daha fazla artış kullanın. Buna karşılık, firkete etrafında dalış öğrenme 2-3 eğitimler alabilir kanallar arasında döner.
NOT: bitiş alanında beklerken Genellikle, sıçanlar th yeniden girecekHala bitirmek alan platformda otururken e su yüzmek, ve / veya kafa sualtı batırmak için. - Tüm 5 kanallarının başarılı dalış sağlamak için 3 hafta boyunca bu günlük eğitim protokolü tekrarlayın. Bu tekrarlayan eğitim protokolü labirent sol ve sağ saç tokası döner alternatif kapsadığı için, labirent başarılı tamamlanmasını sağlar.
NOT: Tam 6 hafta yüzmek ve dalış eğitimi programı 300 g vücut ağırlığına ulaşmak için 35 g yeni sütten kesilen sıçanların büyüme ile çakışmaktadır. - Günlük eğitimler tamamlandı ve sıçanlar evlerine kafesine geri döndü sonra, sıçanlar hızlı tımar yoluyla kendi kürkünü kurutmak sağlamak, ya da gerekirse, onların kürk kuru oluncaya kadar sıcak sıçan tutmak için onların kafes altında bir ısıtma pedi yerleştirin.
6. Deneysel Varyasyonları
Not: temel deneysel kurulum ve hayvan eğitim yukarıda tarif edilmiştir. Ancak, davranışsal eğitim sadece prÇevrede bulunan veri toplamak için başka deney teknikleri ile kullanılmak üzere bir model ovides. Temel protokoller dalış tepkisinin belirli yönlerini araştırmak için modifiye edilir. Bu tadilatların örnekleri arasında, bu fizyolojik ve Nöroanatomik teknikleri kullanılarak verilerin toplanması için bazı değerlendirmeler, aşağıda verilmiştir.
- Implante edilebilir Telemetrik Vericiler
- Eğitimin tamamlanmasından sonra, yüzme ve dalış sıçanların pulsatil arteriyel kan basıncını iletmek için piyasada mevcut telemetrik vericileri kullanın. Cerrahi ve ameliyat sonrası iyileşmenin ilişkin prosedürler için yerel IACUC onay alın. Onların verici için şirket tarafından önerilen implantasyon prosedürleri uygulayın ve suya sıçan dönmeden önce cerrahi tam iyileşme sağlamak.
- Sıçan su olduğunda radyo sinyali alan anten yakın olduğundan emin olun.
Not: Su radyo sinyalleri zayıflatır ve böylece mesafe radyo sinyali neSu deposu boyutlarının sınırlayıcı bir faktör haline gelmektedir yoluyla ed seyahat etmek. - Bu labirent aracılığıyla ilerledikçe sıçan takip etmek, yerine sıçan-kafes büyüklüğünde anten yerine, el anten çubuk kullanın. Sıçan sualtı ise radyo sinyali kayıp değil emin olmak için sıçanın 30 cm içinde değnek anteni tutun.
- Firar Şırıngalar
- Dalış tünelin çatısını oluştururken kanal bölücüler ve yatay parçaları yeniden tasarlanması labirent aracılığıyla ilerlemesi sırasında sıçan arkasında boyunca kanül yollar böylece.
NOT: kanallarının modüler tasarımı büyük önem taşımaktadır ve aynı zamanda hızlı sualtı labirent sıçan kurtarmak izin vermelisiniz. Bir kanül kırılmaların ve fareden alınan çıkaaldığmda Eğer sualtı kanül hızla yatışma değilse iken, sıçan yakında kanamaya başladı. - Gönüllü dalış sıçanlarda arteriyel kan basıncını ve kalp hızını kaydetmek için sondaki arteriyel kanül kullanın. PE50 bir 90 cm parça olarak kullanınBir sondaki kanül.
NOT: Bu kanül uzunluğu hala sıçan labirent aracılığıyla ilerlemeye izin verirken basınç dönüştürücü için sıçan bağlamak için yeterince uzun, henüz kanül ölü alanı en aza indirmek için yeterli kısa ve yeterli sadakat izin basınç dönüştürücü yeterince yakın arteriyel basınç sinyali. - Böyle parasempatik ve sempatik agonistleri ve antagonistleri gibi farmasötik maddeler enjekte etmek sondaki venöz (veya arteriyel) kanüller kullanmak veya kalp debisi dağılımını belirlemek izleyiciler veya boya enjekte etmek.
- Sıçanlar sualtı katekolamin düzeylerine ve kan kimyasını belirlemek için sualtı iken venöz (veya arteriyel) kanüller kullanılarak sıçanların kan örneklerinin alınması.
NOT: firar kanül uzunluğu en aza indirin ve kan çizer sırasında kanül ölü alanı için hesap.
- Dalış tünelin çatısını oluştururken kanal bölücüler ve yatay parçaları yeniden tasarlanması labirent aracılığıyla ilerlemesi sırasında sıçan arkasında boyunca kanül yollar böylece.
- Aktif Beyin Nöronlar Algılama
- Olduklarını gösteren için Fos proteininin immünolojik tespiti kullanındalış tepkinin bir parçası olan beyin sapı fy belirli alanlarda.
NOT: kardiyorespiratorik refleksi tekrar başlatılması, aktif hale gelir ve fos adı verilen bir protein üretebilen refleks devresinin bir parçası olan beyin nöron sırasında. - Tekrarlanarak 24 dalış toplam 2 saat labirent aracılığıyla her 5 dakikada bir sıçan dalış.
Not: sinir hücresi Fos üretimini teşvik başka protokoller de kullanılabilir. Strese yanıt olarak katılan beyinsapı nöronların aktivasyonunu önlemek için, tekrarlanan davranış davranışsal eğitimin bir parçası olarak dahil edilmelidir.
- Olduklarını gösteren için Fos proteininin immünolojik tespiti kullanındalış tepkinin bir parçası olan beyin sapı fy belirli alanlarda.
- Dalış sırasında kan Kortikosteron Düzeyleri
- Yüzme ve dalış sırasında stres sıçanlar deneyim seviyesinin bir göstergesi olarak kortikosteronu kullanın.
- , Kortikosteron analizi için kan alma 15 dakika 3 gönüllü gezen ya dalış sonra farelerin kuyruk veninden 0.1 ml'lik bir kan örneklerini almak için.
NOT: Ön deneyler 15 dk su olduğunu belirttifficient zaman dolaşıma üretim ve kortikosteron salgılanmasına izin veren ve plazma kortikosteron seviyelerinde bir tepe neden olur. Kortikosteron düzeyleri sirkadiyen ritim olduğundan, tüm kan günün aynı anda çizer planlamak ve eğitim oturumları zamanlama ile geldi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan yüzme ve dalış eğitimi prosedürlerin başarıyla tamamlanması su altında dalış yaparken sıçanların yaşadığı stresi azaltabilir. Kan kortikosteron seviyeleri tekrarlanan günlük eğitim gönüllü dalış ile ilişkili stressfulness azaldığını göstermektedir, ve eğitilmiş fareler insan (Şekil 2; 17) tarafından günlük olarak işlenen daha dalış fazla stresli bulabilirsiniz. Tersine, dalış protokolde eğitimli sıçan gönüllü dalış stresli (Şekil 2; 17) bulabilirsiniz. Ayrıca, her ikisi de eğitimli ve eğitimsiz sıçanlar en stresli (; 17 Şekil 2) olması için dalış zorunda bulabilirsiniz.
Ve sondaki kanüller (Şekil 4; 21-23); yüzme, gönüllü dalış ve zorla dalış sıçanların kardiyovasküler tepkiler implante telemetri cihazları (8,17-20 Şekil 3) kullanılarak kaydedilmiştir. Hemen gönüllü üzerindebatma ve tek bir ritmi içinde, kalp atım hızı düşer% 78 oranında ve% 25 17 arteriyel kan basıncı azalır demek. Bu sonuçlar gönüllü dalış sıçanlar genellikle diğer dalış hayvanlarda görülen aynı kardiyorespiratori değişiklikleri sergilemek olduğunu göstermektedir. Ve gönüllü dalış sırasında serebral kan akımı 23 olmak üzere kardiyak debinin 22, dağılımını belirlemek için; Firar arteriyel kanül gönüllü dalış (21 Şekil 4) ile ilişkili bradikardi ortadan muskarinik antagonist atropin, enjekte etmek için kullanılmıştır. Firar kanüller ayrıca 18 batık ise sıçan arteriyel hipoksemi ve hiperkapni artan görmezden olduğunu göstermek için kullanılan ve edildiğini önceden varolan chemoreceptor sürücüyü gönüllü dalış 21 kardiyovasküler tepkiler üzerine herhangi bir etkisi yoktur.
Lamina I ve ventral medüller dorsal boynuz II (MDH) ifade Fos durin içinde Nöronlarg gönüllü dalış, ve bu nöronlar dalış yanıt (; 24 Şekil 5) ilk beyin sapı afferent rölesi teşkil edebilir. Böyle kaudal pressör alanı (CPA) gibi önemli beyin sapı kardiyorespiratuvar kontrol alanları, nükleus traktus solitaries (NTS), rostran ventrolateralinde medulla (RVLM) ve peribrachial bölgeler, tüm gösteri yüzme 25 ile karşılaştırıldığında gönüllü dalış sırasında Fos etiketleme arttı. Uzun süreli dalışlar 18 zorla sonra beyin sapı kemosensitif bölgelerinde Nöronlar Fos ifade eder.
Şekil 1:. Dalış Tank şematik bir pleksiglas tankı (100 x 60 x 15 cm), beş 1 m uzunluğunda kanallardan oluşan basit bir labirent oluşturmak için kullanılmıştır. Tank, 30 ° C musluk suyu ile doldurulmuş ve fareler ilk negotiat şekilde eğitildiFinish Area (sol üst) Başlat Area, su yüzeyinde yüzerek e labirenti (sağ alt). Farelere daha sonra labirent aracılığıyla dalış eğitilmiştir, su yüzeyinin altında 2-3 cm yerleştirilmiş yatay pleksiglas parçaları ile sualtı tuttu. [Bu rakam 26 dan modifiye edilmiştir]
Şekil 2: Kortikosteron ölçümleri. Kan sıçanlar 10 dakika / sıçan yüzmek ve dalış (eğitimli) için eğitilmiş gün (Kulplu), ve sıçanlar için ele, onların kafeslerinde (Naive) sol sıçanların corticosterone konsantrasyonlarını (ortalama ± SH) ölçmek için kullanılan sıçan kuyruğu damarlar berabere hiçbir yüzmek ya da dalış eğitimi (Eğitimsiz) aldı. Eğitimli fareler kendi yüzmeye eğitimi (Sol barlar set) tamamlandıktan sonra corticosterone ölçüldü, sonra eğitilmiş fareler kendi gönüllü div tamamlamıştıe eğitim (barlar Merkezi seti), ve eğitimli sonra, sıçanlar (Sağ barlar set) zorla dalış eğitimini tamamladı. 1 değeri Naïve anlamlı ölçüde daha büyük olduğunu gösterir; 2 değeri işlenmiş anlamlı ölçüde daha büyük olduğunu gösterir; 3 değeri Eğitimli anlamlı ölçüde daha büyük olduğunu gösterir; * Zorunlu dalış sırasında eğitimli fareler değer gönüllü dalış sırasında önemli ölçüde fazla olduğunu gösterir. [Bu rakam 17 ile modifiye edilmiştir]
Şekil 3: telemetrik vericilerinden gelen arteriyel kan basıncı izleri labirent aracılığıyla yüzmek için eğitilmiş fareler ve dalıştan (sol sütun), gönüllü dalış (orta sütun), ve zorunlu dalış (sağ sütun) yüzme sırasında pulsatil arteriyel kan basıncını gösteren Ham veri izleri. Öğ yoktu sıçanların (alt sıra) vening prosedür (üst satır). Su yüzeyinde yüzme böyle bir kardiyovasküler değişikliklere neden ise dalış sualtı (gönüllü ve zorla batıklık her ikisi de), acil bradikardi ve arteriyel basınçta yavaş başlangıçlı artış üretti. Izleri altında Barlar daldınlma dönemi işaret etmektedir. Telemetrik sinyalin kaybolduğu zaman iz tatili dönemi işaret etmektedir. [Bu rakam 17 ile modifiye edilmiştir]
Şekil 4: Antropin dalış bradikardi ortadan kaldırır. Atropin ön işlemden sonra, pulsatil kan önce gönüllü dalma sıçanlarda (A) basınç ve (B) 'nin orijinal kayıtları. İzler bir arka arteriyel kanül kullanılarak elde edilmiştir. Atropin ön tedaviden önce, tansiyon batma üzerine biraz azalmış, ama ttavuk dalış kalan dalış öncesi daha fazla yükselmiştir. Kalp hızı komşu nabız basıncı aralıklarla belirlendi. Suya batma üzerine dalış süresince devam etti acil ve önemli bradikardi oldu. Atropin tedavi öncesi ile parasempatik ablukasının sonra bradikardi elendi. Dalış sırasında arter basıncında bir artış oldu. Iz altındaki bar daldınlma süreyi gösterir. [McCulloch, yayınlanmamış]
Şekil 5: MDH içinde Fos etiketleme. Trigeminal medüller dorsal boynuz (MDH) ve sualtı dalış için eğitilmiş sıçanlarda spinal trigeminal sistem (sp5) fotomikrografları. Tekrarlanarak hiçbir Fos etiketleme yok değil dalış bir kontrol sıçan (A). (B) yüzme Sıçan çok yanar varSP5 içinde tle Fos MDH etiket (büyük ok) ya da paratrigeminal çekirdek (küçük ok). (C) dalış sıçan daha Fos etiketleme MDH (büyük ok) hem ventral var ve paratrigeminal nükleus (küçük oklar) olarak karşılaştırıldığında yüzme ve kontrol sıçan. Panel (a) olarak kaydedin panel ac rostral-kaudal konumunu gösterir. Panel C Ölçek çubuğu 100 mikron. [Bu rakam 24 değişiklikler yapılarak elde edilmiş]
Şekil 6: dalış sıçanların Aktif katekolaminerjik nöronlar. Fotomikrograflar olmayan bir dalış kontrol faresi (A, C, ve E) ve gönüllü dalış farede (B, D ve F) medullas göstermektedir. Beyin dokusu immunohistologically hem Fos An için işlendid tirozin hidroksilaz (TH), kahverengi TH somas ve siyah Fos çekirdekleri üreten. Oklar Fos + TH çift etiketli nöronlar tespit ederken Açık sıra, tek etiketli TH-pozitif nöronlar tespit. A1 nöronlar A ve B C1-nöronlarda tanımlanan C tanımlanır ve D A5 nöronlar E ve F Daha Fos ve A1, C1 görülen çift etiketli TH tespit edilir ve dalma sıçan daha A5 bölgeleri olmayan dalış kontrol sıçanlarda. E Kalibrasyon çubuğu paneller AF için, ve 250 mm. F içerlek Kalibrasyon çubuğu tüm ilavelerde için, ve 50 mm. [Bu rakam 26 dan modifiye edilmiştir]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onların vahşi formu can Sıçanlar ve yarı-sucul ortamlarda istismar yapmak ve yiyecek 6 aramak olurken olacak sık sık sualtı dalış. Böylece fareler çok kolay gönüllü sualtı dalış için eğitilmiş olabilir bu çok şaşırtıcı değildir. Tarif edilen eğitim prosedürler çoğu erişkin sıçan beyin atlaslarında kullanılan bir vücut büyüklüğü (~ 300 g) yeni sütten fareler getirecek 6 haftaya kadar sürebilir. Bu eğitimli hayvanların Böylece beyinleri daha kolay karşılaştırılabilir bu atlaslarında tanımlanan anatomik yapılara olacaktır.
Start alanında konulduktan sonra en ratlar 20 saniye içerisinde kendi sualtı yüzmek başlayacak. Ancak, bazen bir sıçan gönüllü dalışa başlamadan önce 5 dakika veya daha fazla sürecektir. Bu sualtı tüneli içine sıçan zorlamak için bu aşamada cazip olsa da, bu genelde olumsuz bir deneyim ile suyun ilişkilendirme gelen fareleri önlemek için kaçınılmalıdır. Kemirgenler, başlatılmış inatçı olabilir ve olabilir olabilirmüttefiki eğitim oturumları sırasında dalış reddediyorum, ama onlar su çıkmak için tek yolu labirent aracılığıyla dalış tamamlayarak tarafından fark bir kez, genellikle yakında start alanında yatırıldıktan sonra dalış başlatır.
Tekrarlayan ve metodik eğitim prosedürlerin kritik yönü onlar sıçan yaşadığı stresi azaltmak için böyle bir şekilde yürütülen olmasıdır. Sıçanlar özellikle denemeleri arasında bitirme alanında ise, çevrelerini keşfetmek izin, daha da stresi azaltmak gibi görünüyor. Sıçanlar sık sık yüzmek için suya tekrar girin ve / veya hala bitiş alanı platformda otururken kendi baş sualtı batığın olacaktır. Bu fareler doğal su caydırıcı olmadığını göstermektedir. Ayrıca, sıçanlar yüzme veya dalış, ya da daha az fekal pelet 17 bitiş alanında bekleyen, günlük eğitim sonuçlarına sırasında fekal pelet üretmek için nadir değildir iken. Genel olarak daha az fareler eğitim sırasında olduğu vurguladı, daha az pellets onlar üretecek. Üretilen herhangi pislikleri nispeten temiz su tutmaya kısa sürede su veya bitiş alanından kaldırılır.
Sıçanlar bazen kanlı burun alabilirsiniz burun pasajda suyun içine çekilmesinin bir sonucu olabilir yüzme ve dalış, süre. Kanın görünümü burun mukozasına olan ozmotik streslere bağlı olabilir. Çalışmalar arasında finiş alanında ise fareler kendilerini damat olacak. Burun bir sonucu kan gibi bir eğitim oturumu sırasında, özellikle göz çevresinde, sıçanlar hafif kırmızımsı bir renk vererek, fareler baş ve burun üzerinde dağıtılabilir alabilirsiniz. Ayrıca, arada bir sıçan dalış stresli olabilir ve / veya olumsuz dalış deneyimleri var (etrafında dönen ve dalış sualtı (5.4.3 sonra not görürken kaybolmadan tarafından, yani. On) oluşmasını engellemek için nasıl). Bu sıçanlarda porfirin bir stres RESPONS sinyalizasyon, onların gözlerinin köşelerinde görünebilirör.
Dalış tankın büyüklüğü belli bir dereceye kadar oda gereksinimlerini belirlemek olacaktır. Tarif tankı sıçanlar 5 m uzunluğunda pleksiglas sayesinde suyun yüzeyinin altında 2-3 cm yüzmek için tasarlanmıştır 10-15 sn 17,19,24,26,27 bir sualtı yüzme süresini vermek labirent. Bir deney daha uzun bir süre dalıştan tepkilerini ölçmek için tasarlanmış olmalıdır, ya da sualtı bir derin dalıştan, tankı yeniden dizayn edilmesi gerekebilir. Oda gereksinimleri sonra da yeniden tasarlanmış dalış tank boyutlarına sığacak şekilde değişebilir. Prosedür kullanılabilir odasında hiçbir zemin drenaj yoksa, tanktan su gibi, sonra uygun bir şekilde başka bir yerde boşaltılabilir bir 60 gal çöp can, gibi, büyük bir kap içinde toplanabilir.
Fos teknik, ayrıca, dalış tepkisinin beyin devresinin bir parçası olan nöronlar belirlemek ve karakterize etmek için, diğer sinir tespit yöntemleri ile kullanılabilir. Örneğin,Gönüllü sırasında aktive olan yan A7 alanı 26,27 mesafede olan ve globosa'nın nöronlar, tirozin hidroksilaz boyama ile bağlantılı Fos algılama A1, C1, A2, A5 katekolaminerjik nöronlar ve alt coeruleus alanlar (26 Şekil 6) belirlemiştir dalış. Ayrıca geriye iz Kolera toksini ile bağlantılı Fos algılama gönüllü dalış 20 sırasında aktive olan çekirdek kuşkulu dış oluşum içinde kardiyak vagus nörotoksinlerini burada hücre gövdelerini belirlemiştir.
Dalış kardiyorespiratorik tepkilerin merkezi sinir entegrasyonu incelenmesi nedenlerden 6,8,28 bir dizi için önemlidir. Dalış tepki uzun süre boyunca nefes almadan batık sualtı kalmaya hayvanlar dahil olmak üzere insanları, sağlar. Dalış yanıt beyin sapı homeostatik kontrol fonksiyonel bir yeniden temsil eder ve en güçlü pa birini gösterirHayvanlarda görülen otonomik refleksleri tterns. Dalış yanıt da trigemino-kardiyak refleks parçası, nazofarengeal refleksi ve / veya ani bebek ölümü sendromu gibi insanlarda önemli klinik olabilir. Son olarak, sıçanların beyin sapı içinde var nöronal devrenin bir anlayış afferent sinyalleri temel beyin sapı otonomik refleksler nasıl değiştirebileceğiniz kortikal belirlemenize yardımcı olacaktır. Bu düşünceler tüm memeli dalış tepkisinin merkezi yönlerini çalışma doğal olarak değerli ve ilginç olun. Açıklanan prosedürler kullanılarak gönüllü sualtı zorla daldı hayvanların kullanımı olacak daha memeli dalış tepkisinin merkezi yönlerini daha iyi soruşturma sağlayacak dalış fareleri yetiştirmektir. Tarif 1 olarak eğitim prosedürleri) MSS stres devre aktivasyonunu azaltan ve dış ödüller kullanılmaz çünkü 2) CNS ödül devreyi aktif değil çünkü bu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar Stoelting Company için bir danışman ve ticari amaçlar için kendilerine genel tasarım ve McCulloch Dalış Tank Maze özelliklerini sağladı.
Acknowledgments
Araştırma Araştırma ve Sponsorlu Programları Ortabatı Üniversitesi Ofisi tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Ayrıca Ortabatı Üniversitesi Hayvan Tesisi ve Erik Warren teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
References
- Butler, P. J., Jones, D. R. Advances in Comparative Physiology and Biochemistry. Lowenstein, O. 8, Academic Press. 179-364 (1982).
- Butler, P. J., Jones, D. R. Physiology of diving birds and mammals). Physiol. Rev. 77, 837-899 (1997).
- Butler, P. J. Metabolic regulation in diving birds and mammals. Resp. Physiol. Neurobiol. 141, 297-315 (2004).
- Foster, G. E., Sheel, A. W. The human diving response, its function, and its control. Scand. J. Med. Sci. Sports. 15, 3-12 (2005).
- Lindholm, P., Lundgren, C. E. G. The physiology and pathophysiology of human breath-hold diving. J. Appl. Physiol. 106, 284-292 (2009).
- McCulloch, P. F. Animal models for investigating the central control of the mammalian diving response. Front. Physiol. 3, 1-16 (2012).
- Krogh, A. The progress of physiology. Am. J. Physiol. 90, 243-251 (1929).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Juric, R. The rat: a laboratory model for studies of the diving response. J. Appl. Physiol. 108, 811-820 (2010).
- Lin, Y. C. Autonomic nervous control of cardiovascular responses during diving in the rat. Am. J. Physiol. 227, 601-605 (1974).
- Lin, Y. C., Baker, D. G. Cardiac output and its distribution during diving in the rat. Am. J. Physiol. 228, 733-737 (1975).
- Huang, T. F., Peng, Y. I. Role of the chemoreceptors in diving bradycardia in the rat. Jap. J. Physiol. 26, 395-401 (1976).
- Fahlman, A., Bostrom, B. L., Dillon, K. H., Jones, D. R. The genetic component of the forced diving bradycardia response in mammals. Front. Physiol. 2, 1-7 (2011).
- Blix, A. S., Folkow, B. Handbook of Physiology. Shepher, J. T., Abboud, F. M. , American Physiological Society. 917-944 (1984).
- Kooyman, G. L. Diverse Divers. 200, Springer-Verlag. (1989).
- MacArthur, R. A., Karpan, C. M. Heart rates of muskrats diving under simulated field conditions: persistence of the bradycardia response and factors modifying its expression. Can. J. Zool. 67, 1783-1792 (1989).
- McCulloch, P. F., Jones, D. R. Cortical influences on diving bradycardia in muskrats (Ondatra zibethicus). Physiol. Zool. 63, 1098-1117 (1990).
- McCulloch, P. F., Dinovo, K. M., Connolly, T. M. The cardiovascular and endocrine responses to voluntary and forced diving in trained and untrained rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298, 224-234 (2010).
- Panneton, W. M., Gan, Q., Dahms, T. E. Cardiorespiratory and neural consequences of rats brought past their aerobic dive limit. J. Appl. Physiol. 109, 1256-1269 (2010).
- Chotiyanonta, J. S., DiNovo, K. M., McCulloch, P. F. Bilateral sectioning of the anterior ethmoidal nerves does not eliminate the diving response in voluntarily diving rats. Physiol. Reports. 1, (2013).
- Panneton, W. M., Anch, A. M., Panneton, W. M., Gan, Q. Parasympathetic preganglionic cardiac motoneurons labeled after voluntary diving. Front. Physiol. 5, 1-10 (2014).
- McCulloch, P. F., Ollenberger, G. P., Bekar, L. K., West, N. H. Trigeminal and chemoreceptor contributions to bradycardia during voluntary dives in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 273, 814-822 (1997).
- Ollenberger, G. P., Matte, G., Wilkinson, A. A., West, N. H. Relative distribution of blood flow in rats during surface and submerged swimming. Comp. Biochem. Physiol. A. 119, 271-277 (1998).
- Ollenberger, G. P., West, N. H. Distribution of regional cerebral blood flow in voluntarily diving rats. J. Exp. Biol. 201, 549-558 (1998).
- McCulloch, P. F. Activation of the trigeminal medullary dorsal horn during voluntary diving in rats. Brain Res. 1051, 194-198 (2005).
- Panneton, W. M., et al. Activation of brainstem neurons by underwater diving in the rat. Front. Physiol. 3, 1-13 (2012).
- McCulloch, P. F., Panneton, W. M. Activation of brainstem catecholaminergic neurons during voluntary diving in rats. Brain Res. 984, 42-53 (2003).
- McCulloch, P. F. Globosa neurons: a distinct subgroup of noradrenergic neurons in the caudal pons of rats. Brain Res. 964, 164-167 (2003).
- Panneton, W. M. The mammalian diving response: an enigmatic reflex to preserve life. Physiology. 28, 284-297 (2013).
