Summary
Die molekularen Mechanismen, die während der Ontogenese koordinieren die Bildung von inhibitorischen GABAergen Synapsen sind weitgehend unbekannt. Um diese Prozesse zu untersuchen, haben wir eine Co-Kultur-Modellsystem, das embryonale mittelgroßen Projektions GABAergen Neuronen zusammen mit stabil transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293-Zellen) exprimieren funktionellen GABA-A-Rezeptoren enthält, kultiviert entwickelt.
Introduction
GABA ist einer der frühesten embryonalen Neurotransmitter im Gehirn, vor der am häufigsten vorkommende exzitatorische Neurotransmitter Glutamat 1. Während der Entwicklung depolarisiert GABA und regt unreifen Neuronen, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Zellproliferation, Migration und Bildung von neuronalen Netzwerken ohne eine Exzitotoxizität. Im erwachsenen Gehirn wird das Umkehrpotential für GABA A Rezeptorkanäle zu negativeren Potentialen aufgrund einer Abnahme der intrazellulären Konzentration von Chlor verschoben. Diese Verschiebung wird durch die Hochregulation des Kaliumchlorid-Co-Transporter (KCC2), das Chlorid aus der Zelle transportiert verursacht wird, und, parallel dazu, die Herunterregulierung der Natrium-Kalium-Chlorid-Transporter (NKCC1), die aufweist der gegenteilige Effekt 2.
Im Gehirn GABA bindet primär entweder GABA A oder GABA B Rezeptoren, die schnell oder langsam synaptische Hemmung vermitteln jeweiligely. GABA A Rs sind eine Klasse von Rezeptoren auch als heteropentameren ionotrope oder Liganden-gesteuerte Cys-Loop-Ionenkanäle bekannt. Zwei Moleküle GABA zur Aktivierung des Rezeptors, die durchlässig für Chlorid-Ionen und in geringerem Ausmaß, Bicarbonat-Ionen erforderlich. Der Anstieg der Chloridleitfähigkeit verringert die Wirksamkeit der depolarisierenden, exzitatorischen Ereignisse in der Aktivierung der postsynaptischen Neuron 3.
Strukturvielfalt der GABA A Rs ist seit langem als ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung ihrer breiten Palette von funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften erkannt worden. Nativen GABA A Rs sind hetero-Pentamere von Untereinheiten mit mehreren Isoformen klassifiziert zusammensetzt: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, θ π und 3, mit einem gemeinsamen Transmembrantopologie mit einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne, vier Transmembrandomänen (TMS) und eine intrazelluläre Hauptdomäne zwischen TMs 3 und 4 4. Dasβ3 und γ2 Untereinheiten sind für die synaptische Inhibition und Organismus überleben, weil Mäusen mit genetischen Löschung dieser Untereinheiten sterben nach der Geburt 5,6. Im Gegensatz dazu sind einzelnen Isoformen von α-Untereinheit für die Funktion des spezifischen synaptischen Verbindungen im Gehirn mit unterschiedlichen Verhaltensweisen wie Angst, Sedierung, Erregung und andere verbunden sind, sind nicht einzeln für das Leben wesentlich 7-9 aber. GABA A Rs sind die Hauptwirkorte für eine Vielzahl von Medikamenten mit starken Beruhigungsmittel, hypnotisch, angstlösende und krampflösende Wirkungen, wie Benzodiazepine, Barbiturate, Neuro und Anästhetika 7,10,11.
Synaptic GABA A Rs enthalten typischerweise eine γ2-Untereinheit, zwei β-Untereinheiten (am häufigsten β2 oder β3) und zwei α-Untereinheiten (α1, α2, α3 oder α5) 12,13. Die vorherrschende Klasse von extra synaptischen Rezeptoren die δ-Untereinheit in Kombination enthältmit zwei α-Untereinheiten (α4 oder α6) und zwei β-Untereinheiten (β2 oder β3) 14. Subzelluläre Lokalisierung von GABA A Rs Axone, Dendriten oder Soma und Insertion in die Plasmamembran sind abhängig von der Gegenwart von β-Untereinheiten 15,16. Jedoch selektiven Einbau von verschiedenen GABA A R Subtypen in verschiedene Arten von Synapsen korreliert gut mit der Anwesenheit von spezifischen α-Untereinheiten (α1, α2, α3 oder α5) 7,17,18. Wichtig ist, dass das Löschen von α1 oder α2-Untereinheit in Mäusen bewirkt ultrastrukturelle Veränderungen bei hemmende Synapsen 19. Dies deutet darauf hin, dass GABA A Rs selbst können bei der Regulierung der Synapsenbildung eine direkte Rolle spielen.
Beweise zeigen, dass GABAerge Synapsen Entwicklung ist eine präzise koordinierten Abfolge der Ereignisse, bei denen sowohl die neuronalen Ziele durch verschiedene Arten von Inhibitor Axonen und den Rezeptoren, die auf Cluster kontaktiertjede Klasse von hemmenden Synapsen sind selektive und funktional abgestimmt 17,20-22. Dieses Grundprinzip der Spezifität bei GABAergen Synapsen stellt sich die Frage, wie die prä- und postsynaptischen Partnern während der Einleitung der synaptischen Kontakte gegenseitig erkennen.
In-vitro-Co-Kultur-Assays wurden erfolgreich eingesetzt, um einige der Mechanismen der Synapsenbildung zu untersuchen und die Rolle der einzelnen synaptischen Spalt überspannende Proteine in diesem Verfahren getestet werden. Eines der gemeinsamen trans synaptischen interacting protein-Kombinationen, die bidirektional mit Synapsenbildung und Reifung vermitteln funktionieren, sind die Neurexine (Nrxns) und Neuroligine (NLS). Nrxns sind präsynaptischen Proteine, die das alternative Spleißen innerhalb ihrer Laminin-neurexin-Sexualhormon-bindendes Protein-Domänen aufweisen, was zu vielen unterschiedlichen Isoformen 23. Während die Nrxns auch mit anderen Proteinen interagieren, sind NLs dachte ihrer ubiquitären postsynaptischen partner 24. Zusammen bilden diese Proteine tragen zur Aufnahme der präsynaptischen und postsynaptischen Membranen in enger und starrer Apposition 25. Die beiden am häufigsten vorkommenden Isoformen sind NL-1 und NL-2, die an erregenden und hemmenden Synapsen, jeweils 26 vorhanden sind. Eines der frühesten Cokulturmodell Systeme designt trans synaptische Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, verwendeten verschiedene Arten von nicht-neuronalen Zellen, am häufigsten unsterbliche Zelllinien, wie menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293-Zellen, zu über-express NL- 2. Wenn diese Zellen mit pontis Neuronen kultiviert wurde eine Akkumulation von präsynaptischen Proteinen in der Nähe der Oberfläche der HEK-Zellen beobachtet, was die Bildung von Synapsen artigen Kontakten. Zugabe von löslichem β-neurexin diesen Co-Kulturen hemmte die Bildung von Kontakten, was darauf hindeutet, dass trans-synaptischen Interaktionen zwischen Nrxns und NLs für synaptische Kontaktbildung 27 notwendig sind. Außerdem transiente Expressionvon β-neurexin in COS (C V-1 (Simian) in O Rigin und Tragen des S V40 Erbgut) Zellen co-kultiviert mit dissoziierten hippocampalen glutamatergen und GABAergen Neuronen induziert die Expression des postsynaptischen Protein gephryin und der GABA A R-Untereinheiten γ2 und α2 an Kontaktpunkten zwischen diesen beiden Zelltypen 28. Ein weiteres Beispiel einer Co-Kultur-Modell zur Synapsenbildung Studie beteiligten HEK293-Zellen, die transient mit GABA A R transfizierten Untereinheiten α2 / β3 / γ2 und NL-2 und eine Mischpopulation von Hypothalamus Neuronen 29. Diese Studie ergab, dass die Expression von NL-2 ist eine absolute Voraussetzung für die Bildung von inhibitorischen Synapsen.
Doch in der letzten Co-Kultur-Studie stabil transfizierten α1 / β2 / γ2 GABA A Rs in HEK293-Zellen wurden als ausreichend funktionelle Synapsen zu veranlassen, wenn co-kultiviert mit GABAergen medium Projektionsneuronen, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche trans-synaptische oder postsynaptischen Adhäsionsproteine. Allerdings wurde ein prominenter Anstieg Synapsenbildung und Festigkeit beobachtet, wenn NL-2 wurde mit GABA A Rs 30 koexprimiert. Dies deutet darauf hin, dass diese Co-Kultur-Modell-System hat Vorteile gegenüber zuvor beschriebenen Modellsysteme, die meisten offenbar eine erhöhte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der synaptischen Kontakterkennung. Zwei wichtige Faktoren für die Verbesserung der Gesamterfassungs der synaptischen Kontakte sind: i) Die Verwendung von stabil transfizierten HEK293-Zelllinien mit hoher und konstanter Ausdruck GABA A R-Untereinheiten an der Oberfläche der einzelnen Zellen. Diese Konsistenz erleichtert quantitative Vergleiche zwischen verschiedenen Co-Kulturbedingungen. ii) Die Verwendung einer reinen Population von GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums embryonalen 31 kultiviert entfernt Komplikationen und Unklarheiten bei der Verwendung von gemischten neuronalen Populationen und resultierende allows, beispielsweise die Auswahl der am besten geeigneten postsynaptischen GABA A R-Typen, die bei der Synapsenbildung miteinander verglichen werden können.
Bildung von Synapsen wird gedacht, um viele trans-synaptischen Signale innerhalb prä- und postsynaptischen Zelladhäsion Komplexe beinhalten. Aufgrund der bidirektionalen Natur des synaptischen Signalisierung und die bloße Anzahl von Zelladhäsionsmolekülen, ist es schwierig, die Schlüsselkomponenten in der Synapsenbildung beteiligt sind. Somit Transfektion einer einzigen Zelladhäsionsprotein in eine nicht-neuronalen Zelle (in diesem Fall sind die beiden am häufigsten postsynaptischen Ziele für GABAerge mittelgroßen Projektionsneuronen in vivo, α1 / β2 / γ2 oder α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) erheblich reduziert die Komplexität der trans-synaptische Signale an postsynaptischen Oberfläche und ermöglicht eine genaue quantitative Analyse der Wirksamkeit dieses Proteins bei der Förderung der Synapsenbildung.
Protocol
Sprague-Dawley Ratten oder BAB / c Inzuchtmäusen (Harlan, UK; die Zahl der schwangeren Frauen verwendet wurde 30) wurden nach britischen Innenministeriums [und der Richtlinie vom 24. November 1986 Europäischen Gemeinschaften Rat untergebracht und opferte (86/609 / EWG) ] Richtlinien. Das Projekt wurde offiziell von der UCL School of Pharmacy Ethikkommission genehmigt.
1. Herstellung der Instrumente, Kulturmedium und Geschirr
- Schalten Sie und reinigen Sie den Laminarströmungshaube mit 70% Ethanol, um unter sterilen Bedingungen zu jeder Zeit zu arbeiten.
- Vorbereitung HEK293-Zellkulturmedium, enthaltend Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-Glutamin (2 mM), Penicillin (50 Einheiten / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und fötalem Rinderserum (10 %).
HINWEIS: Penicillin und Streptomycin sind Reizstoffe. - Bereiten Sie die Serum-freien neuronalen Kulturmedium, Neurobasalmedium pH 7,4 (500 ml), B27 Supplement (25 ml), L-Glutamin (2 mM), Penicillin enthalten(50 Units / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und Glucose (6 mM).
- Bereiten Sie 500 ml HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS), enthaltend HBSS 10x Lager (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) und Wasser (445 ml), pH-Wert 7,4.
- Autoklav phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4, 1 l), Wasser (1 L), Glasdeckgläschen (13 mm Durchmesser) und Glaspasteurpipetten, um sie zu sterilisieren.
2. Herstellung von HEK293 Stabile Zelllinie, α1 / β3 / γ2-GABA A Rs
- Platte 2x10 6 HEK293-Zellen in einer 10 cm sterile Gewebekulturplatte und bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid (CO 2) Atmosphäre (CO 2 -Inkubator) um 70-90% Konfluenz über Nacht zu erreichen.
- Am folgenden Tag transfizieren HEK293 Zellen, die mit GABA A R cDNA α1-Untereinheit in der PCDN 3.1 (+) Expressionsvektor Einbeziehung der G418-Disulfat (Tabelle 1) Resistenz-Gen,und die cDNA GABA A R β3-Untereinheit in den Expressionsvektor Einbeziehung der Phleomycin D1 (Tabelle 1) Resistenzgen (beide unter der Regulation eines humanen Cytomegalovirus immediate-early (CMV) Promotor), unter Verwendung eines kationischen Liposomenformulierung, die mit negativ-Komplexe geladenen Nukleinsäure-Moleküle (Tabelle 1) nach dem Protokoll des Herstellers.
- Kurz gesagt, 500 & mgr; l reduziert Serum-Medium (pH 7,4; Tabelle 1) und 7,5 & mgr; g von jedem cDNA-Konstrukt in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen, gefolgt von 15 ul liposomalen Transfektion Puffer Reagenz und vorsichtig mischen, bevor sie bei Raumtemperatur 5 min.
- Zu dieser Mischung, fügen 8,75 ul liposomalen Transfektionsreagenz und vorsichtig mischen, bevor sie bei Raumtemperatur für 30 min. Danach werden 3 ml HEK293 Zellkulturmedium (ohne Antibiotika), Pipette den Inhalt des Zentrifugenröhrchen nach oben und unten zwei Mal, transfer tropfenweise auf die Zellen wachsen in einer 10 cm Gewebekulturschale, und Inkubation für 48 h bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Mit sterilem PBS, pH 7,4 waschen HEK293 Zellen vorsichtig und verdünnte die transfizierten HEK293-Zellen in neue 10 cm-Gewebekulturschalen, in den folgenden Verhältnissen: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1.15 und 01.20. Dies stellt sicher, dass die Zellen nicht übermäßig zusammenfließen.
- Auswahl der HEK293-Zellen, die sowohl GABA A R Einheiten gestartet durch Zugabe von 800 & mgr; g / ml von jedem antibiotischen Selektionsmarker, G418 und Phleomycin D1, zu dem Kulturmedium. Die Zellen bei 37 ° С Inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator) und setzen das Antibiotikum enthaltenden Medium (10 ml) alle 2 Tage.
- Wenn kleine weiße Kolonien beginnen sich zu bilden (in der Regel nach ca. 7 Tage), sorgfältig wählen Sie eine Einzelkolonie von jedem der Gerichte und holen sie mit einem sterilen P1000Pipettenspitze. Übertragen, um eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte, die 500 ul Medium und vorsichtig durch Pipettieren des Mediums nach oben und unten zu resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass genau eine Kolonie wird in jede Vertiefung überführt (insgesamt 5-20 Kolonien wird empfohlen). Die Zellen bei 37 ° С Inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator) und setzen das Antibiotikum enthaltenden Medium alle 2 Tage.
- Sobald die Kolonien geworden 70-80% konfluent vorsichtig pipettieren das Medium nach oben und unten, um die Zellen vom Boden der 24-Well-Gewebekulturplatte zu entfernen. Übertragen und verteilen die Suspension von Zellen zwischen 2 Vertiefungen einer 6-Loch-Gewebekulturplatte. Die Zellen bei 37 ° С Inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator) und setzen das Antibiotikum enthaltenden Medium alle 2 Tage.
- Sobald 70-80% konfluent, sammeln die Zellen aus 1 der 2 Brunnen der Zellen aus dem gleichen einzigen Doppelpunkt Ursprung enthälty und bereiten Proteinlysaten. Kurz gesagt, waschen die Zellen 2x mit PBS, pH 7,4, und mit 200 ul 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) in PBS, pH 7,4. Sammeln des Lysats und übertragen sie an die Mikrozentrifugenröhrchen. Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung von BCA-Protein-Reagens (siehe Tabelle 1) nach dem Protokoll des Herstellers. Analyse der Expression von α1 und β3 Untereinheiten des GABA A -Rezeptoren durch SDS / PAGE und Immunoblotting unter Verwendung von Untereinheit-spezifischen Antikörper (Kaninchen anti-α1-spezifischen und Kaninchen-anti-β3-spezifischen GABA A R-Antikörper, siehe Tabelle 1 für die auf diese Antikörper).
- Verdrängen und übertragen nur positive Klone aus den übrigen Vertiefungen zu größeren 6 cm-Gewebekulturschalen. Die Zellen bei 37 ° С Inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator) und setzen das Antibiotikum enthaltenden Medium alle 2 Tage.
- Nach und nach erweitern die Kolonien von Zellen unter dem Antibiotika-Selektion durch ihre Übertragung auf 10 cm Gewebekulturschalen und schließlich zum Zellkulturflaschen (T-75-Flaschen). Die Zellen bei 37 ° С Inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator) und setzen das Antibiotikum enthaltenden Medium alle 2 Tage.
- Teller 70.000 Zellen aus jeder Kolonie auf Deckgläser (13 mm Durchmesser) und fixieren Sie die Zellen, die Zelloberflächenexpression und Co-Lokalisierung von GABA A R-Untereinheiten durch Immunfluoreszenz analysiert.
- Wählen Sie die positive Klon von HEK293 Zellen, die hohe Niveaus beider α1 und β3-Untereinheiten der GABA A -Rezeptoren, Platte 2 x 10 6 Zellen in eine 10 cm sterile Gewebekulturschale und bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre ( CO 2 Inkubator) über Nacht. Sicherzustellen, dass die Zellen in antibiotikahaltigen (G418 und Phleomycin D1) Medium zu allen Zeiten inkubiert.
- Am folgenden Tag, transfizieren HEK293 Zellen, die mit GABA A R γ2s cDNA-Untereinheit in den pcDNA 3.1 ™ (+) Expressionsvektor Einbeziehung Hygromycin B-Resistenz-Gen unter Verwendung eines nicht-liposomalen Lipid-Transfektionsreagenz (Tabelle 1).
HINWEIS: Diese Transfektion Methode ermöglicht bessere Überlebenschancen und höhere Expressionseffizienz von Fremdproteinen in langsam wachsenden stabilen Zelllinien, die unter ständiger Selektion mit Antibiotika. - In einem sterilen 15 ml Zentrifugenglas 250 ul Enhancer und DNA Kondensationspuffer (Tabelle 1) und 1,4 ug γ2s GABA A -Rezeptor-Untereinheit-cDNA. In 11,2 ul Enhancer und Vortex für 1 Sekunde, bevor er bei Raumtemperatur für 5 min.
- In 35 ul nicht-liposomale Lipid Transfektionsreagenz und Vortex für 10 Sekunden, bevor er bei Raumtemperatur für 10 min. 3 ml G418 / Phleomycin D1 enthaltenden Medium und Pipetten den Inhalt des Zentrifugenrohrs nach oben und unten zweimal befErz Übertragung tropfenweises auf die Zellen wachsen in einem 10 cm-Gewebekulturplatte. Die Zellen für 48 Stunden bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Die Zellen werden vorsichtig mit sterilem PBS und verdünnt in neue 10 cm-Gewebekulturschalen, in den folgenden Verhältnissen: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 1:20 beträgt.
- Starten Auswahl α1 / β3-HEK293-Zellen, die γ2s Einheit exprimieren durch Zugabe von 800 ug / ml Antibiotikum Hygromycin B Selektionsmarker zum G418 / Phleomycin D1 enthaltenden Medium. Ersetzen Sie das alte Medium mit dem frischen G418 / Phleomycin D1 / Hygromycin B-haltigem Medium (10 ml) alle 2 Tage.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,12, unter kontinuierlicher Selektion in G418 / Phleomycin D1 / Hygromycin B-haltigen Zellkulturmedium.
- Speichern die positive Klone bei -140 ° C in Antibiotika-freien Zellkulturmedium und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) für die zukünftige Verwendung.
- Testen Sie die Ebeneder Expression von α1, β3 und γ2s GABA A R-Untereinheiten durch Immunoblotting und Immunfluoreszenz in jedem Klon folgenden Auftauen, weil der Ausdruck kann aufgrund der reduzierten Überleben der Zellen unter Antibiotika-Selektion ändern.
3. Wartung von HEK293 Zelllinien
- Tauen Sie ein Fläschchen mit Steuer HEK293 Zellen oder solche, die entweder α1 / β2 / γ2-GABA A Rs (Tabelle 1) oder α1 / β3 / γ2-GABA A Rs (oben beschrieben) in 10 ml Zellkulturmedium in einem 15 ml steriler Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 440 × g für 5 min, um überschüssiges DMSO zu entfernen.
- Überstand entfernen und Zellen in 1 ml frischem Zellkulturmedium.
- Erste hinzuzufügen 9 ml frisches Zellkulturmedium auf eine 10 cm-Gewebekulturschale mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml) und dann 1 ml der resuspendierten Zellen beschichtet. Leicht bewegen, von Seite zu Seite, um die Zellen zu verteilen und bei 37 ° С in einem befeuchteten5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Am folgenden Tag absaugen Löschmittels in einen Zelltrümmer zu entfernen und ersetzen mit 10 ml frischem HEK293 Zellkulturmedium.
- Wählen stabilen Zelllinien mit Antibiotika, um alle Zellen, die nicht GABA A R-Untereinheiten exprimieren und somit auch nicht über die Expression von Antibiotikaresistenzmarkern entfernen. Für die α1 / β2 / γ2 stabile Zelllinie, ersetzen normalen Medium durch frisches Zellkulturmedium mit G418 (800 ug / ml). Für die α1 / β3 / γ2-Zelllinie, ersetzen Sie mit frischem Zellkulturmedium G418 enthält (800 ug / ml), Phleomycin D1 (800 ug / ml) und Hygromycin B (800 pg / ml). VORSICHT! G418 ist ein Reiz und Hygromycin B ist ätzend, giftig und reizend.
- Passage die Zellen in eine neue Gewebekulturschale durch Impfen mit einer niedrigeren Dichte, sobald sie erreicht> 70% Konfluenz. Saugen Sie 10 ml Zellkulturmedium und waschen zweimal kurzPBS, pH 7,4. 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung, einer Lösung der Protease Trypsin (0,05% Trypsin) und einem Ca 2+ Chelator EDTA (0,02%) in PBS, pH 7,4, um die Zellen von der Schale abzulösen. Trypsin-EDTA VORSICHT! Lösung ist reizend.
- 10 ml Zellkulturmedium, das die richtigen Antibiotika, um die Schüssel und saugen die Zellen. Zentrifugieren der Zellen bei 440 g für 5 min und resuspendieren sie in 5 ml des Zellkulturmediums.
- Passage der Zellen mit einer Verdünnung von 1:10 in eine neue Zellkulturflasche (T-75 Kolben) mit frischem Zellkulturmedium und die richtige Antibiotika. Die Zellen bei 37 ° С inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre (CO 2 Inkubator) und ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage. Passage die Zellen, wenn> 70% konfluent (siehe Schritt 2.8).
4. Herstellung von GABAergen mittelgroßen Projektions Neuron Kultur
- Unter sterilen Bedingungen bereiten ein 24-wirll Platte mit Poly-L-Lysin (0,1 mg / ml) beschichteten Deckgläschen (13 mm Durchmesser) und bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Am folgenden Tag absaugen mit einer Pipette die überschüssige Poly-L-Lysin und waschen Deckgläser mit zwei kurzen 10 Sekunden und zwei 5 min lang Waschungen mit sterilem Wasser. Hinzufügen Laminin (0,01 mg / ml) über Nacht bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Desinfizieren die Dissektion Bereich mit 70% Ethanol und sammeln eine Reihe von Sezieren Tools wie gebogenen und geraden Gewebe Pinzette, Schere und Pinzette, aufnehmen und in 70% Ethanol vollständig zu sterilisieren Seziersaal Instrumenten.
- Legen Sie die schwangere Ratte / Maus mit CO 2 auf dem Rücken getötet und reinigen Sie die Haut auf seinem Bauch mit 70% Ethanol. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette und um den Bauch geschnitten durch die Haut, Muskeln und Bauchfell, um die inneren Organe und der Gebärmutter zu offenbarenmit Embryonen deutlich. Extrahieren Sie die Embryonen (E16-17) aus der Gebärmutter und legen Sie sie in einer Petrischale mit gekühltem PBS.
- Legen Sie die Embryonen in der Sterilbank und enthaupten sie, sammeln die Köpfe in einer neuen Petrischale mit gekühltem HBSS.
- Unter einem Binokular, sezieren die Gehirne mit den gebogenen und geraden Pinzette. Legen Sie die Gehirne in eine neue Petrischale mit gekühltem HBSS.
- Trennen Sie die beiden Gehirnhälften und entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute. Schneiden Sie entlang der Linie des Hippocampus und schälen die Rinde zum Striatum offenbaren. Beachten Sie die Striatum als quergestreifte weiße Struktur an der vorderen der Halbkugel.
- Sezieren Striatum und schneiden sie in sehr kleine Stücke (1 - 2 mm im Durchmesser) und mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, um das Material in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 1 ml gesammelt. Feuerpolier sorgt das Material ohne Beschädigung gesammelt werden.
- Mit dem feuerpolierte tip des Pasteur-Pipette absaugen die Zellen und geben sie 8 - 10 mal. Einen neuen Pipette mit einer Feuerpolitur Spitze von etwa 30% seines ursprünglichen Durchmesser (1 mm), verreiben die Lösung eine weitere 4 - 6 mal, bis sie homogen erscheint.
- Filtern Sie die Zellen unter Verwendung eines 100 & mgr; m Nylon Zellsieb in ein frisches steriles Zentrifugenröhrchen.
- Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und Platte 70.000 Zellen in 500 ul neuronalen Kulturmedium pro Vertiefung in einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Rühren die Wells von links nach rechts und bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO & sub2; -Inkubator) für 14 Tage in vitro (DIV).
- Nach 7 Tagen, überprüfen die Reinheit des neuronalen Kulturen und, falls Gliazellen vorhanden sind, fügen Sie Cytosin β-D-Arabinosid (Ara-C, 5 uM) zu den Vertiefungen, um ihre Verbreitung zu stoppen. Um dies zu tun, nehmen Sie 250 ul neuronalen Kulturmedium (pH 7,4) aus jeder Vertiefung und fügen 250 ul frisches Medium enthaltening Ara-C. VORSICHT! Ara-C ist reizend.
5. Co-Kultur Vorbereitung
- An Tag 11 der Kultur neuronalen fällt einer 6-Well-Platte mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml) unter sterilen Bedingungen und Inkubation über Nacht bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Am folgenden Tag (Tag 12 der neuronalen Kultur), saugen Sie den überschüssigen Poly-D-Lysin und waschen Brunnen 2x kurz und 2x 5 min mit sterilem Wasser vor Zugabe von frischem Zellkulturmedium (ohne Antibiotika) zur Beschichtung der Vertiefungen mit einer kleinen Menge Serum aus dem Medium.
- Absaugen Kulturmedium aus der Gewebekulturflasche (T-75). Die Zellen zweimal mit PBS gespült, bevor die Zugabe von 1 ml der Ca 2+ / Mg 2+ -chelatisierenden EDTA (0,48 mM), die leicht und nicht-enzymatisch dissoziiert Zellen. Man schüttelt die Zellen, um sie von der Unterseite des Gewebekolben lösen.
- 10 ml Zellkulturmedium (ohne Antibiotika, da diese die Transfektion stören), aspirieren die Zellen und in ein steriles Zentrifugenröhrchen. Pellet-Zellen bei 440 g für 5 min unter Verwendung eines Niedergeschwindigkeits-Tischzentrifuge.
- Entfernen Sie den Überstand und die Zellen resuspendieren in 1 ml frischem Zellkulturmedium. Mit einer Zählkammer, zähle die Zellen und die Platte bei einer Dichte von 3 x 10 5 Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte. Leicht bewegen und Inkubation für 24 h bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre (CO 2 Inkubator).
- Am folgenden Tag (Tag 13 der neuronalen Kultur) transient transfizieren die HEK293-Zellen mit mCherry cDNA in pcDNA3-Expressionskonstrukt mit liposomalen Transfektionsreagenz. Kurz gesagt, in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen, 500 & mgr; l der reduzierten Serummedium und 5 ug mCherry cDNA. In 5 ul liposomalen Pufferung Reagenz und vorsichtig mischen, bevor sie bei Raumtemperatur für 5 min.
- In 8,75 ul liposomale Transfektion REAGent und sanft, bevor er bei Raumtemperatur für 30 min mischen. Pipettieren Sie die Inhalte der Mikrozentrifugenröhrchen nach oben und unten zwei Mal, Transfertropfenweise in jede Vertiefung auf dem 6-Loch-Gewebekulturplatte und bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre (CO 2 Inkubator).
- Am folgenden Tag (Tag 14 der neuronalen Kultur), saugen Sie den HEK293 Zellkulturmedium aus jedem der 6-Brunnen und waschen Sie jedes Well zweimal kurz mit PBS (pH 7,4). Hinzufügen von 300 & mgr; l Ca 2+ / Mg 2+ -chelatisierenden EDTA (0,48 mM) und 200 & mgr; l Trypsin-EDTA (0,02-0,48 mM) in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° С für 5 min.
- 1 ml frisches HEK293 Zellkulturmedium pro Well (dies löscht den Trypsin) und saugen Sie den abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 440 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und Überstand. Resuspendieren des Pellets in 500 ul neuronalen Kulturmedium (pH 7,4). </ Li>
- Mit einer Zählkammer, zähle die Zellen und Samen bei einer Dichte von 30.000 Zellen pro Well in einer 24-Well-Gewebekulturplatte, die Neuronen. Rühren der Platte, um die Zellen für 24 h inkubiert dispergieren und Co-Kulturen bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
6. Analyse der synaptischen Kontakte und deren Aktivität
- Nach 23 Stunden in Co-Kultur, untersuchen die Bildung von "aktiven" Kontakte zwischen GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen mit aktivitätsabhängigen Aufnahme von Anti-Synaptotagmin luminale Domäne-spezifischen Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert (Cy5, siehe Tabelle 1) .
HINWEIS: Der Antikörper wird nur Zugriff zu erhalten auf die luminale Domäne von Synaptotagmin, auf die sie sich bindet, wenn es eine Kontinuität zwischen den synaptischen Vesikel Lumen und extrazellulären Raum. Dies tritt insbesondere bei Neurotransmitter-Freisetzung, so dass diese ANTIBOdy eine hervorragende Markierung der aktiven präsynaptischen Enden. - Und fügen Cy5-markierten Maus-anti-Synaptotagmin Antikörper, 1:50 in neuronalen Medium (Neurobasal eines Mediums, pH 7,4), um die, die Co-Kulturen mit neuronaler Medium (siehe Tabelle 1 Neurobasal Ein Medium, pH 7,4) Erstens spülen Kulturen, für 30 min. Inkubieren der Zellen während dieser Zeit bei 37 ° С in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre (CO 2 -Inkubator).
- Um den Zugang der Antikörper zu entfernen, die Co-Kulturen Waschen dreimal kurz: zunächst mit kaltem normalen PBS (pH 7,4), der zweite mit kaltem PBS (pH 7,4), enthaltend 200 mM NaCl, und die dritte mit kaltem normalen PBS (pH 7,4)
- Fixierung der Zellen mit 300 ul 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose in PBS (PFA, pH 7,4) für 10 min unter Rühren. Mit zwei längeren 10 min Wäschen Waschen Sie die Zellen zweimal kurz mit PBS (pH 7,4), dann.
- Glycin (0,3 M) zu jeder Vertiefung für 10 Minuten unter Rühren auf PFA stillen.
- Die Zellen waschen briefly zweimal mit PBS (pH 7,4), dann mit zwei längeren 10 min Waschungen vor der Zugabe von 300 & mgr; l Blockierlösung (1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, pH 7,4), um die nicht-spezifische Bindung zu reduzieren Antikörper.
- Saugen Sie das Blockierungslösung und fügen Sie die Meerschweinchen anti-GABA A R-γ2 Antikörper gegen das γ2 N-terminale Domäne 33 gerichtet (1: 3000 in PBS, pH 7,4) über Nacht bei 4 ° С.
- Am folgenden Tag absaugen primären Antikörper aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen zweimal kurz mit PBS dann mit zwei längeren 10 min Wäschen.
- Permeabilisierung der Zellen mit Triton X-100 (0,1%) in Blocking-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen zweimal kurz mit PBS (pH 7,4), dann mit zwei mehr 10 Minuten wäscht, bevor Sie entweder die Maus-Anti-Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) 65-Antikörper (1: 4000, Tabelle 1) oder der Maus-anti-Synapsin I-Antikörper ( 1: 1000, Tabelle 1) für 120 min bei Raum temperatur.
- Waschen Sie die Zellen zweimal kurz mit PBS (pH 7,4), dann mit zwei mehr 10 Minuten wäscht und dann fügen Blockierungslösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Zentrifugen die entsprechenden Sekundärantikörper (Ziege typischerweise anti-Meerschweinchen-IgG, konjugiert Cy5, Ziegen-Anti-Maus-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor 488 oder Ziege-anti-Maus-IgG-Alexa Fluor 405, die alle auf 2 ug / ml), um Aggregate von Antikörpern zu entfernen, 21.910 × g für 10 min und Antikörper (1: 750) in den Blockierungslösung. Übernehmen, um Brunnen für 1 Stunde anzueignen und mit Alufolie abdecken, um die Fluorophore von Belichtung und konsequente Ausbleichen zu schützen.
- Schließlich, waschen Sie die Zellen zweimal kurz mit PBS (pH 7,4), dann mit zwei mehr 10 Minuten wäscht, um alles ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen und montieren Sie die Deckgläser mit Montage Reagenz (Prolong Gold, Tabelle 1) etwa 10 & mgr; l pro Deckglas. Lassen Sie 24 h bei Raumtemperatur eingestellt werden, während vor Licht vor der Übertragung auf 4 geschützt° С zur Langzeitlagerung.
- Probenanalyse unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 63X Ölimmersionsobjektiv. Stellen Sie sicher, die Lichtverhältnisse und Detektorverstärkung wird angepasst, um die Sättigung zu vermeiden.
- Beachten Potential Synapse artigen Kontakte als Regionen der Co-Lokalisation zwischen den präsynaptischen Enden positiv für GAD65, Synapsin I oder Cy5-markierten Anti-Synaptotagmin und den postsynaptischen HEK293 Zellen durch DIC oder vom mCherry Fluoreszenz indictor visualisiert.
- Zählen Potential Synapsenförmigen Kontakte mit Z-Stapel Reihe von optischen Abschnitte (8 - 10) über eine Tiefe von 4 - 5 & mgr; m pro Zelle unter Verwendung der Bildbearbeitungssoftware.
Representative Results
Das Protokoll für diese Neuron-HEK293 Zell Cokulturmodell System wurde fein abgestimmt, um eine optimale Zellüberleben zu ermöglichen. In diesem System Synapsenbildung förmigen Kontakte und deren Analyse beruht auf stabile und konsistente Expression aller drei GABA A R-Untereinheiten, die in einen funktionellen Rezeptor zu montieren. Es ist daher wichtig, immunzytochemische Analyse von Testeinheit für die Expression an der Oberfläche der HEK293-Zelle, bevor sie auf neuronale Kulturen verwenden. In diesen Experimenten wurde die Zelloberflächenexpression von α1, β2 und γ2-Untereinheiten (1A), oder α1, β3 und γ2-Untereinheiten (1B), unter Verwendung von Untereinheit-spezifischen Antikörpern, die an die extrazelluläre Epitope dieser Untereinheiten zu binden, nachgewiesen. Ein hoher Grad der Co-Lokalisierung zwischen den Untereinheiten im HEK293 Oberfläche nachgewiesen.
Nach der Bestätigung der Oberflächenexpression und Co-Lokalisierung von GABA AR-Untereinheiten in HEK293-Zellen, Co-Kulturen wurden mit HEK293-Zellen, die α1 / β2 / γ2 GABA A R-Untereinheiten und mittelgroßen Projektionsneuronen für 14 Tage (14 Tage in vitro (DIV)) kultiviert vorbereitet. Zellen in Co-Kultur wurden für 24 h inkubiert, fixiert und mittels Immunzytochemie und konfokale Mikroskopie analysiert. Analyse zeigte, daß Kontakte GAD65-positiven GABAergen Axonterminalen gebildet nur sporadische Kontakte mit den Steuer HEK293-Zellen (2A, 2B). Die Zahl der Kontakte bei 4 h nachgewiesen betrug 7,3 ± 0,9 pro HEK293 Zell, und diese Zahl wurde auf 5,5 ± 0,5 Anschlüsse (Mittelwert ± SEM) pro HEK293-Zelle bei 24 Stunden nach Zugabe von HEK293-Zellen zu den kultivierten Neuronen reduziert. Im Gegensatz dazu gebildet GAD65-positiven GABAergen Axonterminalen zahlreiche Synapsen-ähnliche Kontakte mit HEK293-Zellen, die GABA A Rs. Die Anzahl der Kontakte in 4 h nach der Zugabe von HEK293-Zellen erhalten wurde, betrug 28,3 ± 4,7 HEK293-Zelle, und diese Zahl wurde weitere Steigerungd auf 52,1 ± 6,3 (Mittelwert ± SEM) pro HEK293-Zelle bei 24 h in Co-Kultur (2A, 2B).
Um festzustellen, ob diese Synapse artigen Kontakte waren "aktiv", dh unterstützt vesikulären Transmitterfreisetzung wurde ein Vesikel-luminale Domäne-spezifischen Anti-Synaptotagmin Cy5-konjugierten Antikörpers an die Co-Kulturmedium nach 23 Stunden Inkubation zugegeben. Dieser Antikörper wird nur in präsynaptischen Nervenenden eingearbeitet, wenn eine Pore bildet sich zwischen den synaptischen Vesikel Lumen und der extrazellulären Flüssigkeit in dem synaptischen Spalt in die Neurotransmitter-Freisetzung. Nach der Freigabe, schließt sich das Poren, so dass die Synaptotagmin Cy5-konjugierten fluoreszierenden Antikörper gegen Synaptotagmin angebracht innerhalb der Vesikel. Auf diese Weise werden nur die Vesikel aktiv an Neurotransmitterfreisetzung in Eingriff mit dem Antikörper markiert. In diesen Experimenten wenige oder gar keine Kontakte zwischen dem Steuer HEK293-Zellen und die mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals waren "aktiv & #8217; wie durch das Fehlen der Co-Lokalisierung von präsynaptischen GAD65 / synaptotagmin Fluoreszenz und Fluoreszenz mCherry in HEK293-Zellen (3A) dargestellt. Im Gegensatz dazu wurden viele "aktive" Kontakte zwischen den mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals und α1 / β2 / γ2-exprimierenden HEK293-Zellen, wie durch einen hohen Grad an Co-Lokalisation zwischen GAD65 / Synaptotagmin und mCherry ergab, ausgedrückt speziell in HEK293-Zellen (gebildet 3B).
Um zu testen, ob ein anderer Subtyp des GABAA-R kann auch Synapse artige Ausbildung in vitro zu fördern, haben wir co-kultiviert α1 / β3 / γ2 exprimierenden HEK293 Zellen mit mittelgroßen Projektionsneuronen. Auch Steuer HEK293-Zellen nur selten empfangen Kontakte mit Synapsin-positive präsynaptischen Enden erreicht 10,8 ± 0,48 (Mittelwert ± SEM) Kontakte pro HEK293 Zell nach 24 h in Co-Kultur (4A links, 4B). Jedoch HEK293-Zellen,α1 / β3 / γ2 GABA A Rs Form deutlich mehr Synapsen-ähnliche Kontakte mit Synapsin-positive präsynaptischen Enden von mittelgroßen Projektionsneuronen erreicht 25,3 ± 0,27 (Mittelwert ± SEM) Kontakte pro HEK293 Zell nach 24 h in Co-Kultur (4A rechts, 4B). Dies zeigt, dass α1 / β3 / γ2 GABA A Rs in HEK293-Zellen exprimiert sind ebenfalls in der Lage, synaptische Kontaktbildung zu fördern, wenn auch ihre Potenz niedriger als die Potenz α1 / β2 / γ2 enthaltenden GABA A Rs ist.
Diese Experimente zeigen, dass die Co-Kultur-Modellsystem in unserem Labor entwickelt ermöglicht quantitative Analyse der synaptischen Kontaktbildung in vitro sowie die Bewertung der Wirksamkeit der verschiedenen Subtypen von GABA A Rs in diesem Prozess. Diese Experimente zeigen weiter, dass die GABA A Rs, zusätzlich zu der kritischen Funktionskomponenten GABAergen Synapsen, kann eine wichtige Rolle spielenbei der Erkennung und der Bildung von synaptischen Kontakten zwischen inhibitorischen Neuronen und den entsprechenden neuronalen Zielzellen, die unabhängig von anderen Synapsen Adhäsionsproteine.
Abbildung 1 Immuncytochemische Analyse der Expression von GABA A R α1 / β2 / γ2 oder α1 / β3 / γ2 in stabiler HEK293-Zelllinien. Antikörper, die die extrazellulären Domänen von GABA A R-Untereinheiten wurden auf Label-Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgedrückt wird. ( A) HEK293 Zelllinie, α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) und γ2 (Cy5) auf hohem Niveau. (B) HEK293 Zelllinie, α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) und γ2 (Cy5)Untereinheiten auf einem hohen Niveau. Maßstab:. 10 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen bilden Synapsenartige Kontakte mit α1 / β2 / γ2- exprimierenden HEK293-Zellen in Co-Kultur. (A) Die Fluoreszenzmarkierung der präsynaptischen Enden mit Anti-GAD65-Antikörper (grün) und HEK293-Zellen mit mCherry (rot, links) oder die GABA A R γ2-Untereinheit (in blau, rechts), ergab Punkte Kolokalisation zwischen diesen Markierungen, die Synapsenbildung förmigen Kontakte nach 4 bzw. 24 h in Co-Kultur. Maßstab:. 10 um (B) Quantitative Analyse der Synapsenartigen Co ntacts. HEK293-Zellen wurden identifiziert auf der Basis ihrer Form, wie von der DIC-Bildgebung und / oder mCherry Expression, und die Anzahl der Kontakte zwischen den GAD 65-positive Pünktchen (grün) und der Oberfläche der HEK293-Zellen offenbart wurde, mit dem Auge in jedem optischen Abschnitt eine gezählte Z-Stapelreihe (8 - 10) pro Zelle unter Verwendung der Bildbearbeitungssoftware und ausgedrückt als die Zahl der Kontakte / Zelle. Die Grafik zeigt die Anzahl der Kontakte zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen und Kontrolle HEK293-Zellen (hellgrau) oder α1 / β2 / γ2-HEK293-Zellen (schwarz) nach 4 und 24 h in Co-Kultur (Mittelwert ± SEM, n = 8 in jedem Zustand aus zwei unabhängigen Experimenten). Diese Zahl wurde von Fuchs et al modifiziert. (2013) 30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. GABA A Rs fördern Bildung aktiver synaptischer Kontakte. Immunmarkierung von Synapse artigen Kontakte nach 24 Stunden in Co-Kultur zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals positiv für GAD65 gebildet (Alexa Fluor 405 cyan) und (A) Steuer HEK293-Zellen oder (B) HEK293-α1 / β2 / γ2-Zellen, die transient mit beiden mCherry Konstrukt (rot). Aktive Kontakte werden durch Co-Lokalisation zwischen der Vesikel Lumendomänenspezifische Anti Synaptotagmin Antikörper (Cy5) und GAD65-spezifischen Antikörpers sowohl in präsynaptischen Enden identifiziert und mCherry in HEK293-Zellen exprimiert. Maßstab:. 10 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4. GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen bilden Synapsenartige Kontakte mit α1 / β3 / γ2- Einheit exprimierenden HEK293-Zellen in Co-Kultur. (A) Fluoreszenzmarkierung von präsynaptischen Enden mit Anti-Synapsin I-Antikörper (in grün) und Steuer HEK293-Zellen (links), oder α1 / β3 / γ2 exprimierenden HEK293-Zellen, sowohl transient mit mCherry transfiziert (in rot), offenbarte Punkte Co-Lokalisation zwischen diesen Markierungen, die die Bildung von Synapsen förmigen Kontakte nach 24 h in Co-Kultur. Maßstab: 10 & mgr; m (B). Die quantitative Analyse der Synapsenartigen Kontakten. HEK293-Zellen wurden durch mCherry Expression identifiziert, und die Anzahl der Kontakte zwischen Synapsin I-positive Pünktchen (grün) und der Oberfläche der HEK293-Zellen wurde mit dem Auge in jedem optischen Abschnitt einer Z-Stapelreihe gezählt (8 - 10) pro Zelle mit Imaging-Software, und als die Anzahl der Kontakte / Zelle. Die Grafik zeigt die Anzahl der Kontakte zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen und Kontrolle HEK293-Zellen (hellgrau) oder α1 / β3 / γ2-HEK293-Zellen (schwarz) nach 24 h in Co-Kultur (Mittelwert ± SEM, n = 8-12 Zellen in jede Bedingung, aus zwei unabhängigen Experimenten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Obwohl dieses Protokoll ist technisch schwierig durchzuführen, gibt es mehrere wichtige Schritte, die befolgt werden müssen, um die genaue und reproduzierbare Co-Kultur-Assays erreicht werden. Erstens muss kultiviert mittelgroßen Projektionsneuronen bei einer optimalen Dichte ausgesät werden. Wenn ausgesät zu dünn, neigen Neuronen sehr langsam entwickeln und Überleben stark reduziert. Auf der anderen Seite, wenn zu dicht ausgesät, neigen Neuronen zu aggregieren, die die Analyse der Kontakte mit HEK293-Zellen beeinträchtigt. Zweitens ist es empfehlenswert, transient exprimieren ein fluoreszierendes Reporter, GFP oder mCherry in HEK293-Zellen, die GABA A Rs vor platting sie in dem Co-Kultur. Dies ermöglicht die zuverlässige Erkennung von HEK293-Zellen, die durch die Ähnlichkeit in der Form und Größe zwischen diesen Zellen und seltene Hinter Gliazellen in neuronalen Kulturen beeinträchtigt werden kann. Die effiziente Transfektion mit GFP oder mCherry cDNA zu erreichen, müssen in der exponentiellen Wachstumsphase werden HEK293-Zelllinien undin der geeigneten Dichte in 6-well Platten ausgesät. Sparse Aussaat gefolgt von Transfektion verursacht Zellen schlecht wachsen, während Über Aussaat werden die Zellen aus der Aufnahme der cDNA zu verhindern. Idealerweise sollten die Zellen ausgesät werden, dass sie zwischen 70 - 90% konfluent waren am Tag der Transfektion. Drittens muss der Transfektion für jede Zelllinie optimiert werden, da einige Zelllinien sind empfindlicher als andere. Dies ist, weil eine konstitutive GABA A R-Expression in HEK293-Zellen reduziert das Überleben der Zelle und die Fähigkeit der Zellen nach Transfektion erholen. Außerdem hängt das Überleben von der Art des GABA A Rs in HEK293-Zellen exprimiert, wobei einige Zelllinien deutlich empfindlicher als die anderen. Transfektion mit liposomalen Reagenz ist eine optimale Verfahren zur Expression von Fremdproteinen in schnell wachsenden Zelllinien, die sowohl die hohe Transfektionseffizienz und Expressionsniveau. Führt dies jedoch zu viel Reagenz Beschädigung langsam wachsende Zelllinien, beispielsmit denen wir regelmäßig eine nicht-liposomale Transfektionsreagenz. Dies funktioniert in einer ähnlichen Weise zu der liposomalen Reagenz aber die Menge an DNA für die effiziente Transfektion benötigt wird deutlich reduziert. Dies ermöglicht eine größere Zellüberlebensrate (etwa 80 bis 90% gegenüber 60% mit Liposomen Reagenz), jedoch mit geringer Transfektionseffizienz (60%). Schließlich / β2 / γ2 HEK293-exprimierenden Zellen zu neuronalen Kulturen zugesetzt muss die Anzahl der Steuer HEK293 oder α1 optimiert werden. Hinzufügen zu wenige Zellen beeinträchtigt die erfolgreiche Analyse der Kontakte zwischen HEK293-Zellen und Neuronen, weil sie sehr selten geworden. Umgekehrt Zu viele HEK293-Zellen verursacht neuronalen Zelltod innerhalb von wenigen Stunden.
Embryonale mittelgroßen Projektionsneuronenkulturen sollte idealerweise mit striatalen Gewebe aus embryonalen Alter von 15 Jahren seziert hergestellt werden - 17. Allerdings kommt es oft vor, dass Embryonen sind etwas jünger oder älter als die optimale Alter. In diesem Fall ist die Anzahl der Neuronen in Kultur angeimpft wirdmüssen verändert werden. Gewebe, die jünger als E15 müssen möglicherweise bei einer etwas niedrigeren Dichte ausgesät werden, während Gewebe, das älter als E17 müssen möglicherweise mit einer höheren Dichte ausgesät werden, um ein optimales Zellüberleben zu ermöglichen. Weiterhin müssen Cytosinarabinosid (Ara-C), um älteren Kulturen zugesetzt werden, um das Wachstum von Gliazellen, die häufiger bei älteren Gewebe verhindern.
Beim Erstellen Co-Kulturen, ist es wichtig, die optimierte Anzahl von transfizierten HEK293 oder α1 / β2 / γ2 HEK293 Zellen exprimiert Platte, wie oben erwähnt. Jedoch kann es notwendig sein, das für jede einzelne Zelllinie aufgrund von Unterschieden in ihren Lebensrate zu bestimmen. Typischerweise 30.000 Zellen in einem Volumen von 50 ul zu jedem Well einer 24-Well-Platte, das bereits 500 ul neuronalen Kulturmedium gegeben werden, da dies sicherstellt, dass das konditionierte Medium neuronalen nicht zu stark verdünnt, und dass die Bedingungen innerhalb jeder Vertiefung weitgehend konstant bleiben, zB
Einer der Hauptnachteile der Co-Kultur-Technik ist, daß die neuronalen Kulturen von dissoziierten Zellen als Monoschicht, was bedeutet, dass die Neuronen von ihren normalen Mikro entfernt und können ihre normale anatomische Organisation zu etablieren gewachsen erstellt. Daher fehlt ihnen die entsprechenden Verbindungen, Ein- und sekretierte Moleküle von anderen Zellen, die die Anfangsstadien der Synapsenentwicklung beeinflussen. Beispielsweise in vivo mittelgroßen Projektionsneuronen sind dicht von glutamatergen Eingaben von dem Cortex, Thalamus und anderen Hirnregionen 34 innerviert, jedoch in unserer neuronalen Kulturen glutamatergen Synapsen nicht bilden, da diese Eingänge werden bei der Präparation des striatalen Gewebe beschädigt. Wie das Fehlen von funktionellen glutamatergen Synapsen in kultivierten mittelgroßen Projektionsneuronen affECTS ihre Fähigkeit, GABAergen Synapsen untereinander und / oder HEK293-Zellen, die GABA A Rs bilden, bleibt eine offene Frage. Diese Frage könnte leicht durch Züchten zusammen mittelgroßen Projektionsneuronen mit kortikalen glutamatergen Neuronen damit sie in funktionelle Synapsen 35 vor der Zugabe von HEK293 Zellen bilden adressiert werden. Ein alternativer Ansatz wäre, eine Co-Kultur-Modell System zu entwerfen, basierend auf organotypischen Schnittkulturen, die einige der Zellarchitektur, die wichtig für die Reifung und Synapsenbildung sein kann halten. Allerdings haben organotypischen Schnittkulturen dichten und heterogenen Neuropil, das die Analyse hier geführt gefährden können. Ein weiterer wichtiger Nachteil der Verwendung von Co-Kultur-Assays ist, dass GABA A Rs ausgedrückt auf der Oberfläche der HEK293-Zellen werden nicht gruppiert, wie sie in Neuronen, obwohl dies scheint nicht Synapsenbildung gegeben eine ausreichend hohe Oberflächenexpressions 30 notwendig. Zum Beispiel wird in der r-Odent Gehirn und in Hippocampus-Kulturen, die α1 GABA A R-Untereinheit ist in den meisten GABAergen Synapsen auf allen postsynaptischen Domänen von Pyramidenzellen gefunden. Jedoch ist die α2 und zwar in einer Untergruppe von Synapsen auf der Zellkörper und Dendriten sind, aber ist sehr im Axon Anfangssegment angereichert durch Immunofluoreszenz und Elektronenmikroskopie 36 offenbart. Da die Synapsenbildung in den Co-Kulturen immer noch zuverlässig erkannt und analysiert werden 30 legt dies nahe, dass die Dichte des GABA A Rs auf der Zelloberfläche von HEK293-Zellen kann ähnlich oder sogar höher als die Dichte dieser Rezeptoren im synaptischen sein Clustern in Neuronen. Dies kann erklären, zumindest teilweise, warum synaptischen Adhäsionsproteine wie neuroligin und postsynaptischen Dichte Proteine wie Gephyrin, sind nicht für die Synapsenbildung in den Co-Kulturen notwendig, wenn man die entsprechend montiert GABA A Rs vorhanden sind bei ausreichender Dichte.
Es ist gut dokumentiert, dass GABA A Rs sind strukturell und funktionell heterogen, dass die Rezeptor-Untereinheit-Zusammensetzung bestimmt ihre subzelluläre Lokalisierung und pharmakologischen Eigenschaften. Beispielsweise wird der Einbau von 2-Untereinheiten bekannt, die Voraussetzung für die synaptische Lokalisation des GABA A Rs, während die Untereinheit ist fast ausschließlich in Gegenwart extrasynaptischen GABA A Rs. Die Rezeptoren, die nur αβ Kombinationen einzubeziehen sind auch gedacht, um in erster Linie zu den extrasynaptischen Domains 12- 14 lokalisiert werden. Ob diese Spezifität wird in unserer co-Kultursystem aufrechterhalten kann leicht durch transiente Transfektion von cDNAs Einheit 2 oder in HEK293-Zelllinien, die stabil α und β-Untereinheiten, bevor sie auf neuronale Kulturen getestet werden. Unsere Vorversuche unter Verwendung dieses Ansatzes haben vorgeschlagen, dass die synaptische Kontakte werden einfach nur in Gegenwart der 2-Untereinheit gebildet wird, anzeigt, daß das spezifischeficity in vivo beobachtet wurde, ist wahrscheinlich in vitro erhalten werden (Daten nicht gezeigt).
Weiterhin sind GABA A Rs Einbeziehung verschiedener α-Untereinheiten selektiv an synaptischen Kontakte mit bestimmten Arten von präsynaptischen Neuronen gebildet lokalisiert. Zum Beispiel im Globus pallidus, die α1-GABA A Rs werden im allgemeinen bei striatopallidalen (str-GP) und palliopallidal (GP-GP) Synapsen, die auf Dendriten und somatischen Bereiche der mittelgroßen Projektionsneuronen befinden, jeweils zu finden. Die α3-GABA A Rs werden in perisomatische Regionen mittelgroßen Projektionsneuronen und werden von lokalen GP Axonkollateralen kontaktiert, während die α2-GABA A Rs beruhen auf distalen Dendriten dieser Nervenzellen und in erster Linie durch die Eingänge aus dem Striatum 32 kontaktiert. Expression von spezifischen α-Untereinheiten in verschiedenen Arten von Synapsen und Neuronen in verschiedenen Kompartimenten wurde auch in anderen Hirngebieten wie Hipp nachgewiesenocampus 21 und Neocortex 18,20. Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, wie die spezifische inhibitorische Synapsen im Gehirn gebildet wird. Ist die Haftung von einer bestimmten Art von präsynaptischen Terminal induzieren die Einfügung spezifischer GABA A R-Subtypen in die Berührungspunkte? Werden die Rezeptoren spezifischen subzellulären Orten Handel nach ihrer Zusammensetzung Einheit, wobei die Plasmamembran Insertion ist eine Voraussetzung für die Haftung der axonalen Klemmen bestimmter Herkunft? Bis heute bleiben diese Fragen unbeantwortet. Die Verwendung von reduzierten Modellsystemen, wie die Co-Kultur-Modell-System, ermöglichen es uns, beginnen Beantwortung dieser komplexen Fragen, da das System leicht zugänglich Transfektion von DNA-Konstrukten und Anwendung von Reagenzien und, besonders wichtig, geeignet für Live Cell Imaging-Analyse ist es 30. Somit ist die Verwendung dieses Modellsystem können wir beginnen die Prüfung der Rolle der einzelnen Moleküle, darunter verschiedene Arten von GABA A Rs, weißn auf synaptische Kontakte vorhanden sein. Ein weiterer Vorteil ist, dass Synapsen in diesem Modellsystem Form schnell, innerhalb von Minuten bis Stunden, Verkürzung der Dauer der Experimente. Ähnliche Cokulturmodell Systeme wurden in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um für die neuen synaptogenic Moleküle 27,37,38 screenen.
Verstehen, wie das zentrale Nervensystem entwickelt, reift und Formen Verbindungen zwischen Nervenzellen, so kunstvoll zu kontrollieren, zum Beispiel Verhalten oder Kognition, ist von grundlegender Bedeutung. Dieser entfernte Ziel wird nur durch Abgrenzung der molekularen Mechanismen, die die einzelnen Schritte der Anerkennung und von Zelle zu Zelle Kommunikation während der Entwicklung regieren erreicht werden. Durch schiere Komplexität, die molekularen Details dieser vielfältigen zellulären Interaktionen können derzeit mit Präzision nur in reduzierter Systeme untersucht werden. Allerdings ist die Fähigkeit, die Komplexität dieser Systeme durch Ausdrücken mehrere Kombinationen von Proteinen und untersucht, wie erhöhensie interagieren hat einige Vorteile im Vergleich zu beispielsweise genetische Deletion Ansätze. Denn die genaue Interpretation der Auswirkungen eines einzelnen Gens Deletion wird oft durch Veränderungen mit Kompensationsmechanismen Maskierung der Wirkung der ursprünglichen Läsionen, insbesondere bei der Entwicklung des Gehirns assoziiert beeinträchtigt. Die hier beschriebene einfache, aber informative Co-Kultur-Technik hat eine Entdeckung der strukturellen Rolle der GABA A Rs in Synapsenbildung erlaubt und eröffnete eine Möglichkeit zu untersuchen, wie GABA A Rs und andere Zelladhäsionsmoleküle und / oder synaptische Matrixproteine miteinander interagieren während Synaptogenese. Synaptic Matrixproteine sind von besonderem Interesse, da sie vor kurzem nachgewiesen, dass sie eine Schlüsselrolle in glutamatergen Synapse Formation 39 zu spielen. Weiterentwicklung der Co-Kultur-Modelle ist wichtig, weil sie das Potenzial haben, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die zu führen der "normale & voran# 8217; Entwicklung des Gehirns und damit unser Verständnis, wie diese Mechanismen werden in vielen der Entwicklung des Nervenerkrankungen, wie Epilepsie, Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen und viele andere verändert.
Acknowledgments
Wir möchten die finanzielle Unterstützung aus dem MRC UK (G0800498) quittieren. Wir möchte auch danken Professor JM Fritschy, Universität Zürich, für die Bereitstellung der GABA A -R-Untereinheit-spezifischen γ2 Antikörper und Professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, für die Bereitstellung der pcDNA 3.1 (+) Expressionsvektoren, die Antibiotika-Resistenz Gene für die Herstellung von stabil transfizierten HEK293-Zelllinien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Life Technologies | 11960-044 | Warm in water bath at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Danger: irritant |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10106-169 | |
| Neuralbasal | Life Technologies | 21103-049 | Warm in water bath at 37 °C before use |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| HBSS (10X) | Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) | Life Technologies | V790-20 | |
| pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) | Life Technologies | V860-20 | |
| pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) | Life Technologies | V870-20 | |
| Stable HEKα1β2γ2 line | Sanofi-Synthelabo, Paris | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| G418 disulfate salt (Geneticin) | Sigma-Aldrich | G5013 | Danger: irritant |
| Phleomycin D1 (Zeocin) | Life Technologies | R25001 | |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | Danger: toxic, irritant and corrosive |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Warm in water bath at 37 °C before use. Danger: irritant. |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 100 μm Nylon Cell Strainer | VWR | 734-0004 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C1768 | Danger: Irritant |
| Chelating agent (Versene) | Life Technologies | 15040-033 | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). | Life Technologies | 15338-100 | Alternative transfection method: Effectene Reagent |
| Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) | Qiagen | 301425 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 11058-021 | |
| Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 | Synaptic Systems | 105311C5 | |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | VWR | 27810.364 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G1726 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody | Prof. Jean Marc Fritschy | N/A | (Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995). |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody | Merck Millipore | MAB351 | |
| Mouse anti-synapsin antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) | Merck Millipore | MAB341 | |
| Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody | Professor Anne Stephenson | N/A | (UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172 |
| Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody | Merck Millipore | AP1085 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Merck Millipore | AP124S | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody | Life Technologies | A31553 | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody | Life Technologies | A21422 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies | A11008 | |
| Mounting reagent (Prolong Gold) | Life Technologies | P36930 | Use at room temperature |
References
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- Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
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