Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) embryoner er ofte blevet brugt som model for at studere nyre udvikling og polycystisk nyresygdom. Der er mange fordele ved at bruge zebrafisk som en dyremodel: muligheden for at studere genetiske interaktioner, evnen til at anvende antisense morpholinos (MO) for protein knockdown, mulighed for hurtigt at analysere et stort antal embryoner, og den lethed visning orgel fænotyper i levende larver 1. De pronephros er den første nyre at udvikle sig i hvirveldyr og er funktionel i larvernes zebrafisk 2. Strukturen af zebrafisk pronephros er relativt simpel i forhold til de mammale metanephros, at den tredje og sidste nyre udvikles i pattedyr. Den nephron er arbejdsmiljøet enhed i nyrerne, med hvert menneske nyre indeholder mellem 500.000-1.000.000 nefroner 3,4 og hver mus nyre har cirka 13.000 nefroner 5, hvilket gør det vanskeligt at observere enkelt nephron struktur in humane eller muse nyrer. Zebrafisken har kun to nefroner, og hver zebrafisk nephron indeholder alle de vigtige komponenter fundet i glomerulus og tubuli i mus og mennesker 6 og lignende specialiserede renale celletyper. Sammenlignet med andre modeller hvirveldyr såsom Xenopus, zebrafisk nephron mere ligner pattedyrs nefron, fordi det har et lukket system 7.
I de seneste år har zebrafisk genom blevet sekventeret, så den brede introduktion af genetiske værktøjer, omfattende mutant ressourcer og samlinger af transgene reporter linier i zebrafisk modeller. Zebrafisken pronephros dannes mellem 12-72 timer efter befrugtning (HPF) og kan visualiseres let i de transparente embryoner. Den Wilms tumor protein WT1 er en væsentlig faktor for nyre udvikling. Transgene zebrafisk, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af den wt1b promotoren Tg (wt1b: GFP) viser GFP EXPREfission specifikt placeret i pronephric regioner i zebrafisk embryoner, startende fra 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), en autosomal recessiv cystisk nyresygdom, er forårsaget af mutationer i NPHP gener 9. NPHP4 knockdown af morpholino forårsagede cyste dannelse i Tg (wt1b: GFP). Fisk 10 Derfor er denne transgene fisk er en egnet model til at observere nyre strukturer og cyste dannelse under nyre udvikling. Vigtigere, kan indflydelsen af modulatorer af nyre udvikling undersøges ved hjælp af denne stamme i en tid og arbejdskraft effektiv måde.
Vores papir beskriver brugen af Tg (wt1b: GFP) fisk som en model til at visualisere nyre cyste dannelse efter gen graduering. Vi brugte start- og splejse-site anti-sense Mos at banke ned wnt5a genet i zebrafisk. Wnt5a er en ikke-kanoniske secerneret glycoprotein af Wnt familie, som spiller en vigtig rolle i udviklingen af forskellige organer og postnatal cellulærefunktion 11. Wnt5a virker gennem ikke-kanoniske Wnt veje, herunder plane cellepolaritet (PCP) pathway, som har vist sig at spille en rolle i orienteret celledeling under tubulær forlængelse. Wnt5a regulerer Wnt / PCP pathway ved at danne et kompleks med receptoren lignende tyrosinkinase (Ryk), hvilket yderligere transducerer Wnt5a signalering ved at danne et kompleks med VANGL plane cellepolaritet protein 2 (Vangl2) og derved fremme Vangl2 stabilitet 12. Defekter i PCP pathway kan resultere i tilfældig celledeling og forårsage nyrecyste formation. Vi brugte Tg (wt1b: GFP) zebrafisk linje at observere nyre cyste dannelse efter wnt5a knockdown. Tg (wt1b: GFP) zebrafisk model giver mulighed direkte billedvisning og rettidig observation af nyre struktur. Efter wnt5a knockdown blev nyre cyste dannelse fundet begyndende ved 24 HPF; ved 72 HPF kunne cyster findes i glomeruli og den proksimale tubuli. Denne metode kan også anvendes til at screen andre gener, der kan forårsage nyre cyste dannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Etik Statement: Alle zebrafisk eksperimenter blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på den østlige Virginia Medical School.
1. Morpholino Forberedelse
- Design og syntese af translation-blokering (AUG-) og splice-inhiberende (Splice-) anti-sense morpholino (MO) oligonucleotider for genet af interesse, som ifølge producentens instruktioner (figur 1A). Se fabrikantens oplysninger i tabel 1.
BEMÆRK: MOS sendes som frysetørrede bestande i glasflasker. - Tilføj high-grade sterilt vand til glasflasker til at re-suspendere MOS til en endelig koncentration på 25 pg / pl. Sørg for, at oligonukleotidet er helt opløst. Hvis nogle solide rester, varme hætteglasset med bestanden oligonukleotid opløsning ved 65 ° C i 5 til 10 minutter og vortex kortvarigt.
- Opbevar MO stamopløsning ved stuetemperatur. Må ikke gemme dem ved 4 ° C eller -20 °; C, fordi lavere temperaturer kan forårsage MO oligonukleotidet at binde til beholdervæggen. Måle koncentrationen af stamopløsningen med et spektrofotometer (se tabel 1), hver gang en ny MO stamopløsning er lavet.
- Forbered MO brugsopløsning på dagen for injektion ved at fortynde stamopløsningen med høj kvalitet sterilt vand til den ønskede dosis. Tilsæt 0,5% phenol-rød for at nå en koncentration på 0,05%. For eksempel, for at gøre 5 pi arbejder opløsning med en koncentration på 15 ng / nL, tilsættes 3 pi MO stamopløsning og 0,5 pi 0,5% phenol-rød til 1,5 pi vand.
BEMÆRK: Med denne arbejdsgruppe koncentration, hver dråbe (500 pl) af injektion indeholder 7,5 ng MO og to dråber indeholder 15 ng MO.
2. Forberedelse af injektionen Apparatur
- Køb glas pre-trukket nåle (se tabel 1 for nærmere oplysninger). Alternativt trække glasset kanyle with en nål aftrækker.
- Tænd luftkompressoren og justere trykket indstillingen til 50 psi. Tænd dissektionsmikroskop lyskilde og Pico mikro-indsprøjtningspumpen og justere indstillingerne på følgende måde: Hold pres 20 psi, skubbe pres 10 psi, periode værdi på 2,5 og 100 usek vifte af gating.
- Læg glasset forhånd trukket nål med 5 pi af injektionsopløsningen og placere kanylen i lodret position med spidsen pegende nedad. Vent indtil al opløsningen når nålespidsen uden synlige luftbobler. Placer nåleholderen i en passende position ved siden af mikroskopet og indsætte glas nålen ind i holderen. Juster injektion vinkel 45 grader.
- Bring nålespidsen til syne under mikroskop, høj fra scenen, og fokusere på det tyndeste region i spidsen. Bræk nålespidsen med fin spids pincet.
- Placer en lineal og et kapillarrør med indvendig diameter på 0,15 mm ved siden af hinanden under lup;injicere opløsningen i den ene ende af kapillarrøret for at gøre en væskesøjle. Juster eject tid til at nå hver 17 dråber pr 1 mm længde flydende kolonne, så mængden af hver eneste dråbe er 1 nl (drop volumen = π x radius 2 x længde (af flydende kolonne) / tæller (dråber).
BEMÆRK: En dråbe med en diameter på 0,1 mm giver en indsprøjtning volumen på ca. 500 pl (drop volumen = 4/3 x π x radius 3).
3. Forberedelse af befrugtede zebrafisk embryoner og Injektion med morpholinos
- Opsæt Tg (wt1b: GFP) transgene zebrafisk ynglepar ifølge offentliggjorte protokoller for standard zebrafisk dyrehold og vedligeholdelse. Saml embryoner efter naturlige gyde, og holde dem i en 10 cm petriskål fyldt med E3 vand (5 mM NaCl, 0,17 mm KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Start MO injektion med det samme 13. Overvåg embryo morfologi under lup og sørg MO injektion er på en-celle stadie, eller senest fire celle stadie.
- Overfør embryoner til en 10 cm petriskål med kileformet agar trug. Aspirer den ekstra E3 vand og tryk forsigtigt embryonerne i renderne.
- Manipulere embryoner med mikropipetten at visualisere 1-celle embryoer under dissektionsmikroskop. Trænge ind i chorion og derefter blommen at injicere en eller to dråber af MO i blommen (1 dråbe = 500 pl). Overfør de injicerede embryoner til en 10 cm petriskål med E3 vand og inkuberes ved 28,5 ° C.
- Efter injektionerne, fjerne de døde fostre og registrere antallet af injicerede embryoner. Udskift E3 vand i skålen hver 24 til 48 timer.
4. Fænotype Rescue Eksperimenter
- Vælg et ortholog fra en anden art, der har en anden primær basepar struktur (normalt 3-7 baseparmismatches), og er derfor resistent over for MO, til redning. For eksempel, i dette forsøg, vi valgtefordi mus musen Wnt5a mRNA-sekvensen er forskellig fra zebrafisk sekvens.
- Design et primersæt med den fremadrettede primer begyndende ved den translationelle stedet og den reverse primer på tæt ved enden af mRNA kodende region. Tilføj en T7-promotor-sekvensen i 5'-enden af den forreste primersekvens. I dette eksperiment brugte vi følgende primersekvenserne; fremad: 5'TAA tac GAC TCA CTA tag GGA CTA tga TGC TGC tga AGC tga a- 3 'og omvendt: 5'TCA CTT GCA GAC gta CTG gtc- 3'.
- Udfør en 50 pi Polymerase Chain Reaction (PCR) med primer sæt (0,5 uM af hver primer) designet ovenfor og 0,1 ug template-DNA indeholdende muse Wnt5a cDNA-sekvens med den følgende PCR-program: 1 cyklus ved 95 ° C i 5 minutter; 35 cykler af 95 ° C (30 sek), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); og endelig udvidelse ved 72 ° C i 7 min.
- Efter efterbehandling tHan cykler, løber 2 pi af PCR-produktet på 1% agarose gel for at sikre, at bandet er den rigtige størrelse. Oprens PCR produkt med et PCR-oprensningskit ifølge producentens anvisninger. Check DNA-koncentration med et spektrofotometer. Opbevar oprenset PCR-produkt ved -20 ° C eller direkte anvendelse i udjævnede RNA-transkription i det næste trin.
- Syntetisere in vitro udjævnede mRNA med en udjævnet RNA-syntese kit ifølge producentens anvisninger. Fortynd mRNA i 20 pi RNase-frit vand og bestemme koncentrationen. Alikvot RNA og opbevares ved -80 ° C.
- På dagen for injektion fremstilles en arbejdsopløsning af mRNA med RNase-frit sterilt vand. Bemærk, at 40 pg er generelt den højeste RNA dosis, hvor uspecifikke eller toksiske virkninger af RNA ikke opstår. Hold brugsopløsning på is. Sprøjt foster med MO og derefter redning mRNA, eller co-injicere begge sammen. For eksempel, hvis koncentrationen af mRNA prepared i trin 4.5 er 0,6 pg / pl, tilsættes 0,67 pi mRNA (0,4 ug) til 4,33 pi RNase-frit vand for at lave en endelig koncentration på 0,08 pg / pl, derefter en dråbe (500 pl) af hver injektion indeholder 40 pg af mRNA. Forbered MO som beskrevet i trin 3.
5. Fremstilling af injicerede embryoner til fluorescerende Imaging
- Efter inkubering ved 28,5 ° CO / N, tilsættes 0,003% N-phenylthiourinstof (PTU) til E3 vand for at forhindre melanin, som påvirker observation af pronephros struktur ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Du skal dog ikke tilføje PTU før gastrulation, fordi den påvirker tidlig fosterudvikling.
- Efter 48 HPF, manuelt dechorionate embryoner med fine pincet. Tag billeder af 48 og 72 HPF embryoner under en let dissektion mikroskop.
BEMÆRK: Disse billeder kan tages uden bedøvelse. - Ca. 10 minutter før billeddannelse under fluorescensmikroskop, bedøver embryoner ved at placere dem ien 10 cm petriskål indeholdende 160 pg / ml bufferet tricaine. Vent 5-10 min, og derefter rører zebrafisk at bekræfte, at de ikke bevæger sig, og derfor anæstesi fungerer.
- Efter embryonerne bedøvet, montere dem i 3% methylcellulose og orientere dem i en udsat position under et dissektionsmikroskop (se tabel 1).
- Overhold pronephros struktur under en fluorescens mikroskop (se tabel 1) og tage billeder på forskellige forstørrelser (10x og 20X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt5a vælte blev opnået ved at indføre translation blokering MO (AUG-MO) eller exon / intron grænse splejse MO (splejs-MO) til zebrafisk embryoner på én celle scenen. AUG-MO målretter startkodonen, og derfor hæmmer både moderens og zygotisk wnt5a besked. Splejsningen-MO målretter tredje splejsningsdonorsite og hæmmer kun zygotisk udskrift af wnt5a (figur 1A). Den AUG- og splice- morphants phenocopied hinanden med flere defekter, herunder krøllede hale ned krop akse og perikardial ødem (figur 1B). Mus Wnt5a mRNA delvist redder den morphant fænotype (figur 4B), hvilket viser, at fænotypen ikke skyldes off-target effekter. Tg (wt1b: GFP) transgene zebrafisk, der udtrykker GFP drevet af wt1b promotoren, således at GFP rekapitulerer endogen ekspression af wt1b, blev anvendt til at skitsere pronephric struktur. Tg (WT1b: GFP) fisk viste glomerulær cystedannelse efter wnt5a knockdown ved 48 HPF, mens kontrol embryoner injiceret med phenol-rødt alene viste normal pronephric udvikling, danner en kondenseret glomerulus i en "U" -form med tubuli, der strækker sig lateralt (figur 2). Ved 72 HPF, glomerulær struktur videreudviklet med let visualiseret vaskulære løkker med både AUG- og splejsnings-MOS udviklet cyster i glomeruli og proksimale tubuli (Figur 3). H & E-farvning af de tværgående histologiske snit af 72 HPF morphant embryoer afslørede cystedannelse, forstyrret glomerulære strukturer og forstørrede nyretubuli (figur 4A).
Figur 1: design morpholino og lysmikroskopisk udseende zebrafisk embryoer ved 72 timer efter befrugtning (HPF) efter injektionmed phenol-rød kontrol, august-MO, eller splejsning-MO. (A) Diagram zebrafisk wnt5a genet, den kodende region, og regionerne er omfattet af den AUG- og splice- MO. Den wnt5a Aug MO blev designet til at målrette ATG-startkodonen til at blokere protein translation; splejsningen-MO blev designet til at målrette grænsen af exonerne 3 og 4. Splice-MO oligo rettet mod forventes nogen splejsningsforbindelsen at generere enten en komplet eller delvis enkelt exon deletion eller en fuldstændig eller delvis enkelt intron insertion. Vi valgte at banke ned wnt5a med både en august-MO, hvilket påvirker mødres og zygotisk besked og en splejsning-MO, som kun berører den zygotisk afskrift, for at øge specificitet. (B) Den injicerede med phenol-røde embryo ( injektion kontrol) viste normal krop krumning, længde og pericardium. Den embryo injiceret med AUG-MO viste nedad krøllet hale struktur og pericardial ødem, og embryoet injiceret med splejs-MO phenocopied denudseendet af embryo injiceret med Aug-MO. Bar = 2mm.
Figur 2: Fluorescens mikroskopisk udseende Tg (wt1b: GFP). Zebrafisk embryoner ved 48 HPF efter injektion med phenol-rød kontrol, wnt5a august-MO eller wnt5a Splice-MO I phenol-røde injektion kontrol, pronephros udvikling var fuldstændig ved 48 HPF. To kondenserede glomeruli og den proksimale tubuli kan ses. Cystedannelse kan observeres i glomeruli i både AUG- og splejse-MO embryoner ved 48 HPF ved udgangen af zebrafisk pronephros udvikling (bar = 100 um).
Figur 3: Fluorescens mikroskopisk udseende Tg (wt1b: GFP) zebrafisk embryoner ved 72 HPF efter injektion med phenol-rødkontrol, wnt5a august-MO eller wnt5a splejse-MO. ved 72 HPF, glomerulær struktur klart kan visualiseres. I phenol-rød injektion kontrol, kan to kondenserede glomeruli og vaskulære løkker observeres. Wnt5a knockdown resulterede i cystedannelse i alle nephron strukturer, der kunne visualiseres, herunder glomeruli og proksimale rørformede område (bar = 100 um).
Figur 4: (A) H & E-farvning af de tværgående histologiske sektioner 72 HPF morphant embryoer afslørede cystedannelse, forstyrret glomerulære strukturer og dilated nyretubuli. Pil: pronephric glomeruli; pilespids: dilaterede renal tubulus. Bar = 20 um. (B) I august-MO fænotype kunne delvist reddet med musen Wnt5a, modstandsdygtig over for MO grundet en forskel i primær basepar struktur, Hvilket viser, at fænotype ikke skyldtes off-target effekter. Forskellen var statistisk signifikant ved p <0,05 (* P <0,05 vs phenol-rød gruppe; # P <0,05 vs Aug MO 15 ng gruppe).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polycystisk nyresygdom (PKD) er en af de førende årsager til end-stage renal sygdom hos mennesker og er kendetegnet ved progressiv cystedannelse, renal udvidelsen, og unormal tubulus udvikling 14. Autosomal dominant PKD (ADPKD) er en genetisk sygdom, hvor mutation af enten pKD1, der koder polycystin-1 (PC1) eller PKD2 kodende polycystin-2 (PC2), resulterer i polycystiske nyrerne. Mange andre gener, især dem, der koder for proteiner, der findes i den primære cilium, menes at være involveret i udviklingen af renale cyster, og indtil videre er der ikke noget ideelt værktøj til at screene disse gener. Vi beskriver en hurtig og nem måde at observere nyre cyste dannelse efter gen knockdown i zebrafisk. Denne metode kan sandsynligvis anvendes til at screene andre kandidat PKD gener.
En af styrkerne ved denne teknik er dets enkelhed. I Tg (wt1b: GFP) zebrafisk, ekspressionen af GFP i glomeruli tubuli og kanaler, hvilket gør det til en særligly passende model til at undersøge hele pronephric nyre struktur. Tg (wt1b: GFP) zebrafisk giver mulighed for direkte visualisering af pronephric struktur og nyre cyste dannelse efter gen vælte. Der var mistanke at Wnt5a knockdown kan forårsage PCP pathway fejl og nyre cyste dannelse i mus. Men global knockout af Wnt5a er postnatal dødelig hos mus og ikke kunne bruges til at observere nyre cystedannelse efter fødslen. Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her, i en kort periode metode blev det bestemt, wnt5a knockdown i zebrafisk resulterede i nyre cyste formation. Med dette resultat, vil det næste skridt være at generere nyre specifikke Wnt5a knockout-mus.
Denne teknik har også et par begrænsninger. Det er vanskeligt at estimere effektiviteten af MOS uden en god antistof og for at udelukke muligheden for, at MO kan hæmme funktionen af et irrelevant gen at forårsage fænotype. Omfattende kontrol experimeNTS er forpligtet til at overvinde disse problemer. To forskellige Mos, AUG-MO og splice- MO blev brugt til at evaluere wnt5a knockdown. Begge morphants phenocopied hinanden, og injektion af mus Wnt5a mRNA, modstandsdygtig over for MOS på grund af en forskel i primær basepar struktur, reddet den unormale fænotype, viser, at fænotype ikke var på grund af "off-target" virkninger af MO.
Vores model viser, at wnt5a knockdown forårsager nyre cyste dannelse i zebrafisk embryoner. Denne metode kan anvendes til at teste mange andre gener, som er mistænkt for at forårsage nyrecyste dannelse, som den er enkel og mindre tidskrævende. Når det er godtgjort, at genmutationer resulterer i nyre cyste dannelse i zebrafisk, kan yderligere forsøg udføres for at undersøge de nærmere mekanismer nyre cyste dannelse. I dette forsøg, da Wnt5a global knockout-mus er postnatal dødbringende og ikke kan anvendes til obtjene nyre cyste dannelse efter fødslen, vil næste skridt være at generere nyre-specifikke Wnt5a knockout-mus ved hjælp af Cre-lox-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH (DK093625 at LH og DK069909 og DK047757 til JHL) og VA (Merit Award I01BX000820 til JHL). Vi vil gerne takke Dr. Michael Pack og Dr. Jie Han ved University of Pennsylvania zebrafisk Core for at yde væsentlig støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
