Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) embryoer har blitt mye brukt som modell for å studere nyre utvikling og polycystisk nyresykdom. Det er mange fordeler med å bruke sebrafisk som en dyremodell: muligheten for å studere genetiske interaksjoner, muligheten til å bruke antisense morpholinos (MO) for protein knockdown, muligheten til raskt å analysere et stort antall embryoer, og gleden over å vise organ fenotyper i levende larver en. De pronephros er den første nyre for å utvikle seg i virveldyr og er funksjonell i larvesebrafisk 2. Strukturen av sebrafisk pronephros er forholdsvis enkel sammenliknet med pattedyr metanephros, til den tredje og siste nyre utvikles i pattedyr. Den nevronet er arbeidsenhet i nyrene, med hver human nyre inneholdende mellom 3,4 og 500,000-1,000,000 nephrons hver mus nyre ha omtrent 13.000 nephrons 5, noe som gjør det vanskelig å observere enkelt nevronet struktur In menneskelige eller mus nyrer. Sebrafisk har bare to nephrons, og hver sebrafisk nephron inneholder alle de viktigste komponentene som finnes i glomerulus og tubuli av mus og mennesker 6 og lignende spesialiserte nyrecelletyper. Sammenlignet med andre vertebrate modeller som Xenopus, mer ligner sebrafisk nevronet pattedyr nevronet, fordi den har et lukket system 7.
I de senere årene har sebrafisk genom sekvensert, slik at den brede innføringen av genetiske verktøy, omfattende mutante ressurser og samlinger av transgene reporter linjer i sebrafisk modeller. Sebrafisk pronephros former mellom 12-72 timer etter befruktning (HPF) og kan visualiseres lett i de gjennomsiktige embryoer. Den Wilm tumor protein WT1 er en viktig faktor for nyre utvikling. Transgene sebrafisk linjer som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av promoteren wt1b Tg (wt1b: GFP) viser GFP EXPREssion spesifikt lokalisert i pronephric regioner i sebrafisk embryo, fra 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), en autosomal recessiv cystisk nyresykdom, er forårsaket av mutasjoner av NPHP gener 9. NPHP4 knockdown etter morfolino forårsaket cystedannelse i Tg (wt1b: GFP). Fisk 10 Derfor er denne transgene fisken en egnet modell for å observere nyrestrukturer og cystedannelse under nyre utvikling. Viktigere, kan påvirkning av modulatorer av nyre utvikling studeres ved hjelp av denne stamme i en tids- og arbeidseffektiv måte.
Vår papir beskriver bruken av Tg (wt1b: GFP) fisk som modell for å visualisere nyre cyste formasjon etter genet modulering. Vi brukte start- og spleise-site anti-sense Mos å slå ned wnt5a genet i sebrafisk. Wnt5a er en ikke-kanoniske utskilt glykoprotein av Wnt familien som spiller en viktig rolle i utviklingen av ulike organer og postnatal mobilnettetfunksjon 11. Wnt5a virker gjennom ikke-kanonisk wnt reaksjonsveier, inkludert den plane celle polaritet (PCP) veien, noe som har vist seg å spille en rolle i orientert celledeling under renal tubulær forlengelse. Wnt5a regulerer Wnt / PCP veien ved å danne et kompleks med reseptoren som tyrosin kinase (Ryk), noe som ytterligere transduces Wnt5a signalering ved å danne et kompleks med den VANGL plane celle polaritet protein 2 (Vangl2), for derved å fremme stabilitet Vangl2 12. Defekter i PCP pathway kan resultere i tilfeldig celledeling og forårsake nyre cyste formasjon. Vi brukte Tg (wt1b: GFP) sebrafisk linje å observere nyre cyste formasjon følgende wnt5a knockdown. Tg (wt1b: GFP) sebrafisk-modellen gjør levende avbildning og rettidig observasjon av nyre struktur. Etter wnt5a knockdown, ble nyre cyste formasjon funnet begynner ved 24 HPF; ved 72 HPF, kan cyster finnes i glomeruli og de proksimale tubuli. Denne metoden kunne også anvendes for å sCreen andre gener som kan forårsake nyre cyste formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Etikk Uttalelse: Alle sebrafisk eksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Eastern Virginia Medical School.
1. Morpholino Forberedelse
- Design og syntetisere oversettelse-blokkering (AUG-) og spleise-hemmer (Splice-) anti-sense morfolino- (MO) oligonukleotider for genet av interesse i henhold til produsentens instruksjoner (figur 1A). Vennligst se produsentens informasjon i tabell 1.
MERK: Mos sendes som frysetørrede aksjer i glassflasker. - Legg høy grad av sterilt vann til glassflasker for å resuspendere MOS til en sluttkonsentrasjon på 25 ug / ul. Kontroller at oligonukleotid er helt oppløst. Hvis noen solide restene, varme hetteglasset med lager oligonukleotid løsning ved 65 ° C i 5 til 10 minutter og vortex kort.
- Oppbevar MO stamløsning ved romtemperatur. Ikke oppbevar dem på 4 ° C eller -20 °; C, fordi lavere temperaturer kan forårsake at MO oligonukleotid til å binde seg til beholderveggen. Måle konsentrasjonen av stamløsningen ved hjelp av et spektrofotometer (se Tabell 1) hver gang en ny MO stamoppløsning blir fremstilt.
- Klargjør MO arbeidsløsning på dagen for injeksjon ved å fortynne stamløsningen med høy grad av sterilt vann til den ønskede dose. Tilsett 0,5% fenol-rødt for å nå en konsentrasjon på 0,05%. For eksempel, for å gjøre 5 mL arbeidsløsning med en konsentrasjon på 15 ng / nL, tilsett 3 ul MO stamoppløsning og 0,5 mL 0,5% fenol-rød til 1,5 pl vann.
MERK: Med denne arbeids konsentrasjon, inneholder hver dråpe (500 pl) injeksjons 7,5 ng av MO og to dråper inneholde 15 ng av MO.
2. Fremstilling av injeksjonsapparatet
- Kjøp glass ferdig trukket nåler (se tabell 1 for detaljert informasjon). Alternativt trekker glass kanyle with en nål avtrekker.
- Slå på luftkompressoren og justere trykkinnstillingen til 50 psi. Slå på disseksjonsmikroskop lyskilde og Pico mikro-injeksjon pumpe og justere innstillingene på følgende måte: hold trykket 20 psi, løse ut trykket 10 psi, periode verdi på 2,5 og 100 usek spekter av gating.
- Laste glass ferdig trakk nål med 5 mL av injeksjonsoppløsningen og plassere nålen i en vertikal stilling med spissen pekende ned. Vent til alle løsningen når nålespissen uten synlige luftbobler. Plasser nålholderen i en passende stilling ved siden av mikroskop og sett glasset nål inn i holderen. Juster sprøytevinkel på 45 grader.
- Bringe nålespissen til syne under mikroskopet, høy av scenen, og fokusere på det tynneste regionen i spissen. Bryt av nålespissen med fin spiss pinsett.
- Plasser en linjal og et kapillarrør med indre diameter på 0,15 mm ved siden av hverandre under mikroskopet;sprøyte oppløsningen inn i en ende av kapillarrøret til å gjøre en væskesøyle. Justere utløser tid å nå hver 17 dråper per 1 mm lengde væskesøyle, da volumet av hver dråpe er en nl (dråpe volum = π x radius 2 x lengde (av væskesøyle) / count (dråper).
MERK: En dråpe med en diameter på 0,1 mm gir et injeksjonsvolum på omtrent 500 pl (dråpe volum = 4/3 x π x radius 3).
3. Utarbeidelse av befruktet Sebrafisk embryoer og Injeksjon med Morpholinos
- Sett opp Tg (wt1b: GFP) transgene sebrafisk hekkende par ifølge publiserte protokoller for standard sebrafisk oppdrett og vedlikehold. Samle embryoer etter naturlig gyte, og holde dem i en 10 cm petriskål fylt med E3 vann (5mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4). Starte MO injeksjon med en gang 13. Overvåke embryo morfologi under mikroskopet og sørg MO injeksjon er på en-cellestadiet, eller senest fire-cellers scenen.
- Overfør embryoene til en 10 cm petriskål med kileformet agar trau. Aspirer ekstra E3 vann og trykk forsiktig embryoene til rennene.
- Manipulere embryoene med mikropipette å visualisere en-celle scenen embryoer under disseksjonsmikroskop. Penetrere chorion og deretter plommen for å injisere en eller to dråper av MO inn i eggeplomme (1 dråpe = 500 pl). Overfør de injiserte embryoene til en 10 cm petriskål med E3 vann og inkuberes ved 28,5 ° C.
- Etter injeksjoner, fjerne døde fostre og registrere antall injiserte embryoer. Sett på E3 vann i fatet hver 24 til 48 timer.
4. Fenotype Rednings Experiments
- Velg en orthologue fra en annen art som har en annen primær basepar struktur (vanligvis 3-7 basepar mismatch) og er derfor resistente til MO, for redning. For eksempel, i dette forsøket, valgtemus fordi musa Wnt5a mRNA sekvens er forskjellig fra sebrafisk sekvens.
- Utforme en primer satt med den fremre primer som starter på det translasjonelle området og revers primer i nærheten av den enden av mRNA-kodende område. Legg til en T7-promoter-sekvensen ved 5'-enden av forover-primer-sekvensen. I dette forsøk brukte vi følgende primersekvensene; fremover: 5'- taa tac GAC TCA cta tag GGA cta tga TGC TGC tga AGC tga a- 3 'og omvendt: 5'- TCA ctt GCA GAC gta CTG gtc- 3'.
- Utføre en 50 ul Polymerase Chain Reaction (PCR) med primersett (0,5 uM av hver primer) beregnet ovenfor, og 0,1 pg templat-DNA inneholdende muse Wnt5a cDNA-sekvens med følgende PCR-program: 1 syklus ved 95 ° C i 5 min; 35 sykluser med 95 ° C (30 sek), 58,5 ° C (30 sek), 72 ° C (1 min); og endelig forlengelsestrinn ved 72 ° C i 7 min.
- Etter endt than sykle, kjøre 2 mL av PCR-produktet på 1% agarosegel for å sørge for at bandet er riktig størrelse. Rense PCR produkt med en PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner. Sjekk DNA konsentrasjon med et spektrofotometer. Oppbevar renset PCR produkt ved -20 ° C eller direkte bruk i avkortet RNA transkripsjon i neste trinn.
- Syntetisere in vitro avkortet mRNA med en avkortet RNA syntese kit i henhold til produsentens instruksjoner. Fortynne mRNA i 20 ul RNase fritt vann og bestemme konsentrasjonen. Delmengde av RNA og oppbevares ved -80 ° C.
- På dagen for injeksjon, utarbeide en fungerende løsning av mRNA med RNase gratis sterilt vann. Legg merke til at 40 pg er generelt den høyeste RNA dose som ikke-spesifikke eller toksiske effekter av RNA ikke forekommer. Hold arbeidsløsning på is. Injisere embryo med MO og deretter rednings mRNA, eller co-injisere begge sammen. For eksempel, dersom konsentrasjonen av mRNA prepared i trinn 4.5 er 0,6 mikrogram / mikroliter, tilsett 0,67 mL av mRNA (0,4 ug) som 4,33 mL av RNase fritt vann til å lage en endelig konsentrasjon på 0,08 ug / ul, og deretter en dråpe (500 pl) av hver injeksjon inneholder 40 pg av mRNA. Forbered MO som beskrevet i trinn 3.
5. Utarbeidelse av Injisert embryoer for Fluorescent Imaging
- Etter inkubasjon ved 28.5 ° CO / N, legge til 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) til E3 vann for å hindre melanization, noe som påvirker observasjon av pronephros struktur ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Men ikke legg PTU før gastrulation, fordi det påvirker tidlig embryoutvikling.
- Ved 48 HPF, manuelt dechorionate embryoene med fin pinsett. Ta bilder av 48 og 72 HPF embryoer under et lys disseksjon mikroskop.
MERK: Disse bildene kan tas uten bedøvelse. - Ca 10 min før bildebehandling under fluorescens mikroskop, bedøve embryoene ved å plassere dem ien 10 cm petriskål som inneholder 160 mikrogram / ml bufret Tricaine. Vent i 5-10 min, og så vidt berører sebrafisk for å bekrefte at de ikke beveger seg og derfor bedøvelse fungerer.
- Etter embryoene blir bedøvet, montere dem i 3% metyl cellulose og orientere dem i en utsatt posisjon under et disseksjonsmikroskop (se tabell 1).
- Observere pronephros strukturen under en fluorescens mikroskop (se tabell 1) og ta bilder på forskjellige forstørrelser (10x og 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt5a slå ned ble oppnådd ved å innføre oversettelse blokkere MO (august-MO) eller ekson / intron grensen spleise MO (spleise-MO) til sebrafisk embryo på én celle stadiet. AUG-MO rettet startkodonet og derfor hemmer både mors og zygotiske wnt5a melding. Skjøten-MO retter seg mot det tredje spleise donor området og hemmer bare zygotiske transkripsjon av wnt5a (figur 1A). Den AUG- og splice- morphants phenocopied hverandre med flere defekter, inkludert krøllete hale ned kroppens akse og perikardvæske ødem (figur 1B). Mus Wnt5a mRNA delvis redder den morphant fenotype (4B), viser at fenotype er ikke på grunn av off-target effekter. Tg (wt1b: GFP) transgen sebrafisk, som uttrykker GFP drevet av wt1b promoteren slik at GFP sammenfatter endogen ekspresjon av wt1b, ble brukt til å skissere pronephric struktur. Tg (WT1b: GFP) fisk viste glomerulær cystedannelse etter wnt5a knockdown etter 48 HPF, mens kontroll embryoer injisert med fenol-rødt alene viste normal pronephric utvikling, danner en kondensert glomerulus i en "U" -form med rørelementer som strekker seg i sideretningen (figur 2). Ved 72 HPF, glomerulær struktur videreutviklet med lett å visualisere vaskulære sløyfer, med både AUG- og spleise-Mos utviklet cyster i glomeruli og proksimale tubuli (figur 3). H & E farging av de tverrgående histologiske snitt av 72 HPF morphant embryoer avslørte cyste formasjon, forstyrret glomerulær strukturer og utvidede nyretubuli (Figur 4A).
Figur 1: Morpholino design og lys mikroskopisk utseende av sebrafisk embryo på 72 timer etter befruktning (HPF) etter injeksjonmed fenol-rød kontroll, august-MO, eller spleise-MO. (A) Diagram som viser sebrafisk wnt5a genet, kodingsområdet, og regionene målrettet av AUG- og splice- MO. Den wnt5a august-MO er designet for å målrette ATG-startkodonet for å blokkere protein oversettelse; skjøten-MO er designet for å målrette grensen av eksoner 3 og 4. Splice-MO oligo rettet mot noen spleise forventes å generere enten en hel eller delvis enkelt ekson sletting eller en fullstendig eller delvis singel intron innsetting. Vi valgte å slå ned wnt5a med både en august-MO, noe som påvirker mors og zygotiske budskap, og et spleise-MO, som påvirker bare zygotiske avskrift, for å forbedre spesifisitet. (B) Embryoet injisert med fenol-red ( injeksjon kontroll) viste normal kropps kurvatur, lengde og hjerteposen. Embryoet injisert med august-MO viste nedover krøllete hale struktur og perikard ødem, og embryoet injisert med skjøten-MO phenocopied denutseendet av embryoet injisert med august-MO. Bar = 2mm.
Figur 2: fluorescens mikroskopisk utseende Tg (wt1b: GFP). Sebrafisk embryo ved 48 HPF etter injeksjon med fenol-rød kontroll, wnt5a august-MO eller wnt5a Splice-MO I fenol-rød injeksjon kontroll, pronephros var ferdig utviklet ved 48 HPF. To smeltet glomeruli og de proksimale tubuli kan sees. Cyste dannelse kan observeres i glomeruli i både AUG- og spleise-MO embryoer ved 48 HPF innen utgangen av sebrafisk pronephros utvikling (bar = 100 mikrometer).
Figur 3: fluorescens mikroskopisk utseende Tg (wt1b: GFP) sebrafisk embryo ved 72 HPF etter injeksjon med fenol-rødkontroll, wnt5a august-MO eller wnt5a spleise-MO. På 72 HPF, glomerulær struktur kan være tydelig visualisert. I fenol-rødt injeksjon kontroll, kan to sammensmeltede glomeruli og vaskulære løkker holdes. Wnt5a knockdown resulterte i cystedannelse i alle nevronet strukturer som kan bli visualisert, inkludert glomeruli og proksimal rørformet område (bar = 100 pm).
Figur 4: (A) H & E farging av de tverrgående histologiske seksjoner av 72 HPF morphant embryoer viste cystedannelse, forstyrret glomerulære strukturer og dilatert renale tubuli. Pil: pronephric glomeruli; pilspiss: dilatert nyretubuli. Bar = 20 mikrometer. (B) Den august MO-fenotype kan være delvis reddet med mus Wnt5a, bestandig overfor MO på grunn av en forskjell i primær basepar strukturOg derved beviste at fenotypen var ikke på grunn av target-effekter. Differansen var statistisk signifikant ved p <0,05 (* P <0,05 vs Fenol-rødt-gruppe; # P <0,05 vs august-MO 15 ng-gruppen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polycystisk nyresykdom (PKD) er en av de viktigste årsakene til end-stage renal sykdom hos mennesker og er preget av progressiv cyste formasjon, nedsatt utvidelse, og unormal tubule utvikling 14. Autosomal dominant PKD (ADPKD) er en genetisk sykdom som mutasjon av enten PKD1, koding polycystin-1 (PC1), eller PKD2, koding polycystin-2 (PC2), resulterer i polycystiske nyrer. Mange andre gener, spesielt de som koder proteiner som finnes i den primære cilium, antas å være involvert i utviklingen av nyrecyster, og så langt er det ingen ideelle verktøy for å skjerme disse genene. Vi beskriver en rask og enkel måte å observere nyre cyste formasjon etter genet knockdown i sebrafisk. Denne metoden kan trolig brukes til å screene andre kandidat PKD gener.
En av styrkene til denne teknikken er dens enkelhet. I Tg (wt1b: GFP) sebrafisk, er uttrykk for GFP i glomeruli, tubuli og kanaler, noe som gjør det til et bestemtly egnet modell for å studere hele pronephric nyre konstruksjon. Tg (wt1b: GFP) sebrafisk tillater direkte visualisering av pronephric struktur og nyre cyste formasjon etter genet slå ned. Det var mistanke om at Wnt5a knockdown kan føre PCP pathway defekter og nyre cyste dannelse hos mus. Imidlertid er global knockout av Wnt5a postnatal dødelig hos mus, og kan ikke brukes til å observere nyre cyste formasjon etter fødselen. Ved hjelp av metoden beskrevet her, i en kort periode ble det fastslått at wnt5a knockdown i sebrafisk resulterte i nyre cyste formasjon. Med dette resultatet, vil neste steg være å generere nyre spesifikke Wnt5a knockout mus.
Denne teknikken har også noen begrensninger. Det er vanskelig å anslå virkningen av MOS uten en god antistoff, og for å utelukke muligheten for at MO kan hemme funksjonen av et irrelevant gen til å forårsake fenotypen. Omfattende kontroll experiments er nødvendig for å overvinne disse problemene. To forskjellige Mos, AUG-MO og splice- MO ble brukt til å evaluere wnt5a knockdown. Begge morphants phenocopied hverandre, og injeksjon av mus Wnt5a mRNA, motstandsdyktig mot Mos grunn av en forskjell i primær basepar struktur, reddet unormal fenotype, som viser at fenotype var ikke på grunn av "off-target" effekter av MO.
Vår modell viser at wnt5a knockdown forårsaker nyre cyste dannelse i sebrafisk embryoer. Denne metoden kan bli anvendt for å teste mange andre gener som er mistenkt for å forårsake nyrecystedannelse, ettersom den er enkel og mindre tidkrevende. Når det er demonstrert at genmutasjon resultater i nyre cyste formasjonen i sebrafisk, kan ytterligere eksperimenter bli gjennomført for å undersøke de detaljerte mekanismer for nyre cyste formasjon. I dette forsøket, ettersom Wnt5a global knockout-mus er postnatal dødelig, og kan ikke brukes til å obtjene nyre cyste formasjon etter fødselen, vil neste steg være å generere nyre-spesifikk Wnt5a knockout mus ved hjelp av Cre-lox system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH (DK093625 til LH, og DK069909 og DK047757 til JHL) og VA (Merit Award I01BX000820 til JHL). Vi ønsker å takke Dr. Michael Pack og Dr. Jie Han ved University of Pennsylvania Sebrafisk Kjerne for å gi nødvendig støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
