High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

Zusammenfassung

Das Ziel der fluorometrischen Analyse ist es, als eine effiziente, kosteneffektive und qualitativ Durchsatzverfahren zur Analyse von Phagozytose und andere zelluläre Prozesse dienen. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen, sowohl adhärenten und nicht-adhärenten verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Eigenschaften zu untersuchen. Bei der Untersuchung von Phagozytose, fluorometrische Technik nutzt phagozytischen Zelltypen, wie Makrophagen und fluoreszenzmarkierten opsonierten Partikel, deren Fluoreszenz in Gegenwart von Trypanblau ausgelöscht werden. Nach Plattierung der adhärenten Makrophagen in 96-Well-Platten, fluoreszierenden Partikeln (grün oder rot) verwaltet und Zellen werden für unterschiedliche Zeitdauern zu phagozytieren. Nach Internalisierung von fluoreszierenden Teilchen, werden die Zellen mit Trypan-Blau, das Erlöschen des Fluoreszenzsignals von den Bakterien, die nicht internalisiert werden, oder lediglich an der Zelloberfläche anhaften erleichtert gewaschen. Nach dem Trypan Waschen werden die Zellen mit PBS gewaschen, fixiert, einnd mit DAPI (blau Atomfluoreszenzmarkierung), die Kerne von Zellen zu markieren dient gefärbt. Durch eine einfache fluorometrische Quantifizierung durch die Platte Lesen von Kern (blau) oder Partikel (rot / grün) Fluoreszenz können wir das Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grünen untersuchen: blau und bestimmen einen phagozytischen Index, der Menge an Fluoreszenz Bakterien verinnerlicht pro Zelle. Die Dauer des Assays unter Verwendung einer 96-Well-Verfahren und ein Mehrkanal-Pipetten zum Waschen, vom Ende der Phagozytose zu Ende der Datenerfassung, weniger als 45 min. Durchflußzytometrie könnte in ähnlicher Weise verwendet werden, aber der Vorteil der Fluorometrie ist seine hohe Durchsatz, schnelles Verfahren zur Beurteilung mit minimaler Manipulation von Proben und schnelle Quantifizierung der Fluoreszenzintensität pro Zelle. Ähnliche Strategien können zu nicht anhaftenden Zellen, Live-markierten Bakterien, Aktin-Polymerisation, und praktisch jedes Verfahren, bei dem Fluoreszenz angewendet werden. Daher ist Fluorometrie eine vielversprechende Methode wegen seiner geringen Kosten, hoher throughput-Fähigkeiten bei der Untersuchung von zellulären Prozessen.

Einleitung

Quantifizierung der Fluoreszenzsignal wurde in großem Umfang in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Methoden, die von PCR verwendet, Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie und FRET-Analyse ELISA multiplexen. Fluoreszenz-Bildgebung und Quantifizierung hat eine breite Anwendung und kann ein großes Werkzeug für die quantitative Analyse von verschiedenen zellulären Prozessen sein. Verwendung von fluoreszierenden Markierungen mit Signal in den letzten zehn Jahren revolutioniert worden, und das Auftreten von Fluoreszenzplattenleser hat den hohen Durchsatz Quantifizierung der Fluoreszenz während zellulären Prozessen emittierten erleichtert.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll kann für mehrere Anwendungen, wie die Quantifizierung der Phagozytose und Aktin-Polymerisation verwendet werden, wie in unserer früher veröffentlichten Arbeit ¹² verwendet. Das Protokoll eignet sich für eine Vielzahl von Modifikationen und Tabelle 1 listet Zelltypen und Teilchen erfolgreich in früheren Studien verwendet. Standard Verwendung dieses Protokolls für die Quantifizierung der Phagozytose oder der Aktin-Polymerisation ist in Abbildung 1 dargestellt.

Ergebnisse

Zwei wichtige Arten von Quantifizieren Phagozytose und die anschließende Aktin-Polymerisation durch die Verwendung dieses Protokolls ist es, kontinuierlich oder synchronisiert Phagozytose beobachten.

Die mikroskopische Analyse (1B) zeigt Fluoreszenzbilder vergleichbar, was das Fluorometer aufnimmt (siehe auch Abbildung 1). In 1B sind rote Fluoreszenz von Aktin, grün 268 Fluoreszenz von FITC-Etiketten HKOP E. coli, Kern DAPI-Färbung,.......

Diskussion

Hauptbeschränkungen der fluorometrischen Technik sind experimentelle Varianz sowie Zellverlust bei ausgiebigem Waschen und Verwendung von nicht-adhärenten Zellen assoziiert.

Varianz ist weitgehend durch die Variation der Fluoreszenzpartikeln als Wäge- und Pipettieren während der Herstellung der Stammlösung beobachtet keine genaue Möglichkeit der Beibehaltung identischer Teilchenzahlen von Experiment zu Experiment. Um das Problem der Abweichungen zwischen Experimenten befassen, können die Dat.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 μ m gelb-grün fluoreszierende Fluo-Kugeln;	Molekulare Sonden	F8852	kombinieren 50 μm L mit 50μ l Opsonisierungsreagenz für 30 min bei 37oC vor Gebrauch
Hitze abgetötet E. coli BioParticles Fluorescein-Konjugat	Molekulare Sonden	E2861	rekonstituieren (5 mg) in 50 μm; l von PBS und kombinieren Sie mit 50 μm; l Opsonisierendes Reagenz für 30 min bei 37 μg; C vor Gebrauch
Opsonisierendes Reagenz	Molekulare Sonden	E2870
Rhodamin Phalloidin	Molekulare Sonden	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypanblau	Gibco	15250-061<
RPMI Zellwachstumsmedien	Gibco		Ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Pennicillin/Streptomycin; warm in 37 μg; C vor Gebrauch
Fluoreszierender Plattenleser - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyd (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	vor Gebrauch auf 4% verdünnen
96-Well-Platten	Greiner	655097	klar oder schwarz oder klarer Boden - schwarze Platten
Mehrkanalpipette (8 - 12 Kanäle)
Reagenzreservoire
1x PBS
Microfuge Röhrchen (0,6 ml)
Konikel (10 ml)

td colspan="4">Die folgenden Artikel sind in vielen Marken erhältlich, aber die Artikel, die wir in dieser Studie verwendet haben, stammen von den folgenden Herstellern: