كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Introduction

حمض الدوري شيف (PAS) تلطيخ هو أسلوب المناعى التي يتم استخدامها على نطاق واسع في مجال البحوث العضلات والتشخيص. ويستخدم أيضا كأداة تشخيصية على عينات الدم. هذه التقنية تعمل من خلال تطبيق محلول حمض الدوري للعينة، والذي يتأكسد وحدات داخل السكاريد إنشاء مجموعات ألدهيد التي تتفاعل مع كاشف وعديم اللون شيف وبالتالي إنتاج منتج أرجواني عميق. وتظهر الخطوات من هذا الإجراء في الشكل 1. وصمة عار تتحول أي شيء مع السكريات أرجواني، بما في ذلك الجليكوجين، البروتينات السكرية، السكرية، mucins، أو جزيئات أخرى مع الأنصاف السكاريد.

وكثيرا ما يستخدم تلطيخ PAS لقياس مستويات الجليكوجين في الألياف العضلية. أقسام الأنسجة العضلات هي مثالية للتقنية كما نعلق بحزم إلى الشريحة وتحمل متعددة الغسيل وتلطيخ الخطوات. الجليكوجين هو الأكثر حضورا في نشل سريع من النوع الثاني ألياف العضلات، والتي تعاني من ارتفاع الطلبلإنتاج ATP السريع تتطلب الجليكوجين لأقصى قدر من الأداء ^1،2. الجليكوجين هو بوليمر أفرع الجلوكوز التي يمكن تقسيمها إلى الجلوكوز مجانا من خلال عمل انزيمات الجليكوجين فسفوريلاز. في أوقات الراحة والتغذية الاكتفاء، وتجديد الجليكوجين خلال عملية تكون الغليكوجين، بينما في أوقات التغذية قصور أو ذات الطاقة العالية الطلب. يتم تقسيم الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق تحلل الغليكوجين. في وقت مبكر من واستكشفت عام 1950 العلماء الطبيب تلطيخ PAS على عينات الدم لتحليل المحتوى الجليكوجين في الأمراض المختلفة ^3-7. على سبيل المثال، في بومب مرض تخزين الجليكوجين المخلصين خلايا الدم البيضاء بأمراض تتراكم كميات كبيرة من الجليكوجين الذي يختلف كثيرا عن الاصحاء ^8.

توضح هذه المقالة الفيديو-نسخة معدلة من PAS تلطيخ للاستخدام على خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) عينات من الدم الوريدي من الموضوعات البشرية السليمة. PBMCS احتواء معظمها الخلايا الليمفاوية من الخلايا اللمفاوية T و B الأسر الخلايا اللمفاوية، وكذلك الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا القاتلة الطبيعية وحيدات. الخطوة الأولى تنقية يزيل الكريات الحمراء، العدلات، والمحببة الأخرى. توفر هذه التقنية البيانات على نسبة مركزة من الخلايا الليمفاوية مما يسمح للتعداد أكثر قوة من خلايا PAS إيجابي مقارنة باستخدام مسحات الدم الكامل.

الشكل 1: خطوة منهجية خطوة من PAS تلطيخ على PBMC (A) أولا، ويتحقق عزل PBMC من خلال ficoll الانحدار، وتظهر اللوحة اليسرى إعداد قبل الطرد المركزي، وتظهر اللوحة اليمنى بعد الطرد المركزي حيث معطف الشهباء التي تحتوي على PBMC لوحظ في وسط الأنبوب. ثابتة (B) PBMCs المعزولة على الشريحة باستخدام الفورمالين الإيثانول المحاليل تثبيتينشوئها. يتم شطف الشريحة بلطف بالماء المقطر من زجاجة غسل البلاستيكية. ثم يتم وضع (C) الشريحة في 100 مل دورق منتصف الطريق مليئة حل الأميليز، والتي سوف تذوب الجليكوجين. وتشطف الشريحة بلطف. يتم التعامل مع (D) الشريحة بمحلول حامض الدوري، حيث أكسدة ساتشاريديس تأخذ مكان. يتم شطف بلطف الشرائح. هذا سوف إزالة حمض الدوري الزائد ووقف الخطوة الأكسدة. (E) عند إضافة كاشف شيف على الشرائح، وسوف تتفاعل مع الألدهيدات إنشاؤها أثناء الخطوة الأكسدة. وهذا كاشف عديم اللون ثم يؤدي إلى منتج أرجواني أحمر عميق. وتشطف الشرائح برفق لإزالة شيف كاشف الزائد.

Protocol

وتمت الموافقة بحث مع عينات الدم البشري من جامعة كونكورديا أخلاقيات مراجعة المجلس، وشهادة عدد 10000618. العمل على العضلات الماوس وافقت عليه جامعة كونكورديا أخلاقيات مراجعة المجلس وعدد شهادة 2010BERG.

1. PBMC العزلة من الدم الكامل

ملاحظة: إجراء هذا الإجراء في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام تقنية معقمة وأجهزة تعقيم الشركة المصنعة.

1. صب بعناية 10-15 مل من الدم الكامل من heparinized أنابيب (مكافحة تجلط الدم) جمع الدم إلى 50 مل العقيمة أنبوب مخروطي. لانسكاب الدم طفيفة، يمسح بقطعة ده ₂ O و 70٪ ETOH باستخدام الأنسجة التنظيف.
2. تمييع الدم في أنبوب مخروطي لنسبة 1: 1 مع الفوسفات عازلة المالحة (PBS 1X) ودرجة الحموضة 7.4. ضمان أن الحد الأقصى لإجمالي حجم لا يتجاوز 30 مل.
3. المزيج بلطف باستخدام بندقية ماصة المصلية تجنب الفقاعات.
   ملاحظة: لا تخلط بواسطة قلب الأنبوب لتجنب دمccumulation في الحد الأقصى وتسرب لاحقا خلال الطرد المركزي.
4. إضافة 13 مل من Ficoll-paque (انظر المواد والجدول المعدات)، إلى 50 مل قدرة جديد أنبوب مخروطي. الحفاظ على أنبوب تستقيم في رف.
5. باستخدام ماصة نقل، واتخاذ الدم المخفف، المس طرف ماصة نقل إلى الجدار الداخلي للأنبوب بالقرب من أعلى. مع ضغط بطيء وثابت، ونقل الدم على طول الجدار الداخلي للأنبوب تشكيل طبقة الدم على أعلى طبقة السكروز. هل هذه الخطوة عدة مرات حتى تم تحويل كل الدم.
6. غطاء الأنبوب بإحكام وأجهزة الطرد المركزي أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في 700 x ج في الدوار سوينغ مع متوسط ​​مجموعة تسارع إلى 5، والتباطؤ تعيين إلى ZERO.
7. اتخاذ ببطء الأنبوب ودون إزعاج طبقات، إعادته إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
8. جمع بعناية معطف الشهباء (رقيقة طبقة بيضاء غائم)، حيث توجد PBMCs، وضعت بين PBS / البلازماالثانية طبقات ficoll باستخدام ماصة نقل. تجنب جمع طبقة السكروز وعدم الإزعاج طبقة خلايا الدم الحمراء.
9. نقل معطف الشهباء إلى 50 مل جديد العقيمة أنبوب مخروطي. قد يستغرق عدة مرات من تكرار الخطوة 1.8 لجمع كل PBMC.
10. إضافة PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى أنبوب مع PBMC وملء ما يصل الى علامة 45 مل. هز أنبوب دقيق. لا الدوامة.
11. غسل 1: أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 480 x ج مع كل من أقصى تسارع وتباطؤ المنصوص إلى 9. لاحظ تشكيل بيليه من PBMCs في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل.
12. تجاهل PBS (طاف) في كوب من البلاستيك مع 10 مل من التبييض.
13. تخفيف بيليه الخلية عن طريق بلطف "الاجهاد" ضد سطح بتموجات (أي رف فارغ). لا الدوامة.
14. إضافة 25 مل من الطازجة PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى الأنبوب. إذا كان يتم تجهيزها أنبوب أكثر من واحد، تجمع الكريات معا في هذه الخطوة.
15. غسل 2: أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 12 دقيقة في 480 x ج وايث كلا أقصى التسارع والتباطؤ المتوقع أن 9.
16. تجاهل PBS (طاف) في كوب من البلاستيك مع هذا النبأ من التبييض.
17. بلطف "رف" ضد سطح بتموجات (أي رف فارغ). لا الدوامة.
18. إضافة 25 مل من برنامج تلفزيوني جديد للأنبوب.
    1. إخراج 50 ميكرولتر من الخلايا ونقل إلى أنبوب microcentrifuge لعدد قدرتها على البقاء.
    2. إضافة مبلغ مساو (50 ميكرولتر) من اللون الأزرق التريبان (وصمة عار الجدوى)، وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج بلطف.
19. إخراج 10 ميكرولتر وتحويلها إلى عدادة الكريات للتحقق من جدوى خلايا لكل مل. تسجيل عدد من خلية / مل.
20. إخراج المبلغ المطلوب من الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 12 دقيقة في 480 x ج مع كل من أقصى تسارع وتباطؤ المقرر أن 9.
21. تجاهل PBS (طاف) في دورق مع التبييض.
22. بلطف "رف" ضد سطح بتموجات (أي رف فارغ). إضافة 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب.

2. جعل الشريحة PBMC

1. ضع 80 ميكرولتر من الخلايا على شريحة المجهر. تشويه انخفاض بمساعدة شريحة أخرى أو مكان 2 قطرات من 40 ميكرولتر كل على طرفي الشريحة.
2. ترك الشريحة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لتجف. تسمية الشريحة مع قلم رصاص على الجانب بلوري.

3. تحديد عينات على الشرائح

1. إعداد الحل تثبيتي عن طريق خلط 0.5 مل من 37٪ إلى 4.5 مل الفورمالديهايد من 99٪ من الإيثانول.
2. بعد يتم تجفيفها الشرائح، واخراج 2 مل من محلول تثبيتي تقدم طازجة وسكبه على الشريحة بحيث يتم تغطية كامل سطح الشريحة.
3. ترك الحل على الشريحة لمدة 1 دقيقة. شطف الشريحة لمدة 1 دقيقة بماء الصنبور وتركه في الهواء الجاف.

4. جعل الحل الأميليز للسيطرة سلبية

1. خذ 0.25 غرام من مسحوق الأميليز وتذوب في 50 مل من ديالمياه هدأ. صب الحل في نظيفة 100 مل دورق.
2. تزج الشريحة في الدورق حتى أن نصف الشريحة يتلقى العلاج ويبقى النصف الآخر غير المعالجة ومن ثم احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1C).
3. تقديم مذكرة على أي جانب من الشريحة يتلقى العلاج الأميليز. رسم خط على الجزء الخلفي من الشريحة يدل على الحدود بين العلاج والسيطرة.
4. تغسل الشرائح مع DDH ₂ O لإزالة الحل الأميليز وترك الشريحة الهواء الجاف.

5. تنفيذ حمض الدوري شيف (PAS) تلطيخ والتصوير

ملاحظة: الكواشف PAS سامة عن طريق الإستنشاق وهي تآكل، لذلك تحتاج إلى خطوات ينبغي القيام به في غطاء الدخان الكيميائية، والمنتجات النفايات يجب التخلص منها بطريقة صحيحة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

1. ضع الشريحة على سطح مستو وتصب 1،50-2،00 مل من حمض الدوري الحل على العينة. Incubaالشركة المصرية للاتصالات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. شطف الشرائح في عدة تهم من الماء المقطر.
3. صب 1،50-2،00 مل من كاشف شيف على الشريحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. غسل الشريحة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق وتترك في الهواء الجاف.
5. تطبيق 10 ميكرولتر وسائل الاعلام المتزايدة على الشريحة، وتغطي مع اثنين من coverslips صغيرة، أو تطبيق 50 ميكرولتر واستخدام واحدة ساترة كبيرة.
6. تطبيق طلاء الأظافر واضحة على حواف ساترة، والسماح ليلة وضحاها الجاف.

6. الحصول على الصور مع مجهر الضوء باستخدام المجهر 100X الهدف

Representative Results

للتحقق من صحة الكواشف والتقنية الأساسية، تم إجراء PAS تلطيخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة على أقسام عضلة النعلية الماوس. وقد تم تلطيخ نفس يوم التضحية وفي الخطوة الأخيرة من تلطيخ، كانت ثابتة الأجزاء التي كتبها زيلين. ومن المعروف أن العضلات النعلية لاحتواء ~ 35٪-الجليكوجين إيجابي خلايا ^9. خلايا العضلات ملطخة عرض متميزتين حبيبات منقط features--PAS إيجابي داخل الخلية، وخط متواصل demarking غشاء الخلية (الشكل 2A). وجود حبيبات منقط يتسق مع مخازن الجليكوجين، وكان يستخدم لتحديد الخلايا العضلية إيجابية. علاج العينات مع الأميليز إزالة حبيبات منقط وهو ما يتسق معها كونها الجليكوجين (الشكل 2B).

الشكل 2: PAS- وقد تم تحليل الملون أقسام العضلات الفأر مع المجهر الضوئي. كانت ملطخة أقسام عضلة النعلية ماوس مع PAS. وبعض العينات تعامل مسبقا مع الأميليز، وكانت (A) الجسيمات PAS إيجابي مرئية داخل الخلايا العضلية. وقد لوحظت (B) خلايا إيجابية أقل PAS عندما كانت أقسام العضلات مع الأميليز تعامل مسبقا. بقي تلطيخ حول غشاء الخلية بعد العلاج الأميليز (مقياس بار = 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بقيت إشارة غشاء تلطيخ حتى بعد العلاج الأميليز. وكما كان متوقعا، وكانت النسبة المئوية للخلايا PAS إيجابية في قسم العضلات غير الأميليز 37٪، في حين كان الأميليز تعامل أقسام العضلات أقل بكثير، ما يقرب من 5٪ PAS إيجابية الخلايا (الشكل 3).

">
الشكل (3): الكمي لخلايا العضلات PAS إيجابية ونسبة خلايا العضلات التي كانت وعدها إيجابية PAS من شريحة تمثيلية من دون أو مع الأميليز ما قبل المعالجة. كما هو متوقع، كانت 37٪ من خلايا العضلات إيجابية لالجليكوجين. العلاج الأميليز إلى خفض كبير في PAS-إشارة إلى 4٪ (* P <0.001).

وبعد ذلك، تم إجراء PAS-تلطيخ على PBMC من الدم الوريدي من الموضوعات البشرية السليمة باستخدام تقنية معدلة كما هو موضح في قسم البروتوكول، ويتضح في الشكل 1. وPBMC الالتزام بشكل جيد إذا أجريت بعناية خطوات الغسيل. وPBMCs PAS الملون وعرض مجموعة متنوعة من أنماط تلطيخ. وقد لوحظت خلايا صغيرة (5 ميكرون) مع حبيبات بسهولة. كما لوحظ أن نسبة الخلايا بشكل اكبر مع وجود نمط منتشر تلطيخ (الشكل 4A، وأقحم A.1-6 (الشكل 4B).

تم إجراء حمض شيف الدوري (PAS) تلطيخ على PBMCs الإنسان (A) PAS-تلطيخ على PBMCs: الشكل 4. وقد لوحظت نوعين من الخلايا. أظهرت (A.1-6) خلايا أصغر (في 5 ميكرون) في غير الأميليز-الشرائح تعامل الجسيمات أرجواني تتفق مع الجليكوجين. هذه الخلايا يمكن أن يستريح الخلايا. ديها خلايا أكبر (أكثر من 5 ميكرون) في غير الأميليز-الخلايا المعالجة منتشر-PAS إيجابي تلطيخ. يمكن تنشيط هذه الخلايا الليمفاوية. وعولج (B) PBMCs مع الأميليز لمدة 15 دقيقة قبل تلطيخ، والتي تقلص إشارة PAS. ممثل سبعة مختلف المواضيع البشرية السليمة. (C) وPAS وhematoxyلين تلطيخ القيام به على الشريحة الدم الكامل. السهم يظهر PBMC تحيط به العديد من الكريات الحمراء (مقياس بار = 10 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وكانت النسبة التي كان PAS إيجابية 98٪ للخلايا أصغر و 40٪ للخلايا أكبر. القضاء العلاج الأميليز إشارة PAS في خلايا صغيرة (P <0.001) وتقلص في PAS-إشارة في خلايا أكبر إلى 7٪ (الشكل 5) إلى حد كبير.

الشكل 5: الكمي لPBMCs PAS إيجابية نسبة PBMCs التي كانت وعدها إيجابية PAS من شريحة تمثيلية من دون أو مع الأميليز ما قبل المعالجة. وكانت 98٪ من خلايا صغيرة الحجم إيجابية لPAS. وكانت 40٪ من الخلايا الكبيرة صositive لPAS. القضاء العلاج الأميليز إشارة PAS في خلايا صغيرة (P <0.001) وتقلص في PAS-إشارة في خلايا أكبر إلى 7٪ (P <0.001) بشكل كبير.

للتأكد من أن PBMCs تمتلك الجليكوجين لذلك، الطريقة الثانية المستقلة التي توفر أيضا تم استخدام الكميات من كمية الجليكوجين ^10،11، وقد نشرت سابقا في إن الرب على أنواع الخلايا الأخرى ^12. وهي lysed PBMCs في المخزن منخفض التوتر وفصلت الجليكوجين لفترة وجيزة وصفها في التسمية التوضيحية الشكل (6).

الشكل (6): قياس من الجليكوجين باستخدام الهضم الأنزيمي مع إنزيمات التحلل المائي. وقد تم قياس الجليكوجين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وباختصار، فإن بروتوكول ينطوي تحلل منخفض التوتر من 1 × 10 ⁶ PBMCs تليها التكوير من مادة غير قابلة للذوبانيحتوي على الجليكوجين. وجرفت بيليه ويتفاعل مع انزيمات التحلل العائد الجلوكوز الذي يقاس الطيفي وبالمقارنة مع منحنى القياسية. وقد تضعف المحللة الخلية في النسب المشار إليها مع العازلة التحلل. البيانات هو ممثل ثلاث تجارب. تم الكشف عن مستويات كبيرة من الجليكوجين في 1: 1 تخفيف (ع = 0.02)، وتضعف هذه الإشارة معاير من حيث المحللة أبعد من ذلك.

وجرفت الجليكوجين غير قابلة للذوبان عدة مرات، ومن ثم هضمها باستخدام أنزيمات التحلل. تم قياس كمية الجلوكوز أسفرت عن الهضم باستخدام القياس الطيفي وبالمقارنة مع منحنى القياسية. كان واحد مليون PBMCs 1.19 ميكروغرام من الجليكوجين. كان إشارة الجليكوجين معاير على النحو المحللة خلية مزيد من المخفف (الشكل 6).

Discussion

كانت الخطوات الحاسمة من هذه المقالة الفيديو أثناء الغسيل والأميليز علاج الخلايا. في حين غسل الشرائح، وخطوة رئيسية كانت تستخدم زجاجة غسل للعصر البلاستيكية والسماح الماء تشغيل بلطف من خلال العينة على الشريحة ولا تستهدف مباشرة على العينات. سيكون حتى أدنى ضغط المياه المباشر يسبب الخلايا للخروج من الملعب الشريحة. وكانت خطوة رئيسية أخرى لاستخدام نفس شريحة ل± الظروف الأميليز. بعد أن تم التقيد PBMCs إلى الشريحة، وضعت الشريحة بعناية في دورق ذلك تعرضت نصف فقط من تشويه في حل الأميليز. توفر هذه الخطوة عنصر تحكم قوية لأن خلايا الدم هي من نفس الشريحة، وبالتالي التقليل من المتغيرات التباس التي قد تحدث بسبب الاختلافات توقيت طفيفة. الخلايا تمسك بشكل جيد مع أي علاج، لذلك لن يكون له ما يبرره تكلفة إضافية، والوقت الذي يتطلبه مع بولي-L-يسين أو البولي ايثيلين جلايكول طلاء على سبيل المثال.

من خلال آرoubleshooting النشاط الأمثل للالأميليز تم تحديدها. لأقسام العضلات، لوحظ أن النشاط الأمثل للالأميليز لوحظ في حدود 1 ساعة من الحضانة. في أوقات أطول الأقسام العضلات سوف قشر ببطء خارج الشريحة، بينما في أقصر الأوقات الأميليز لم تقم بإزالة نحو كاف PAS-إشارة. توقيت لحضانة الأميليز للشرائح PBMC كان لا بد من تخفيض نسبة إلى توقيت العضلات العينة (والتي كانت 1 ساعة) وصولا الى 15 دقيقة فقط. تسببت مرات أطول PBMCs للخروج من الملعب الشريحة، في حين أن أقصر الأوقات لم تؤثر بشكل فعال PAS-إشارة. تعديل واحد على بروتوكول قياسي من PAS تلطيخ تم تغيير طريقة غسل الشرائح. وأشارت تعليمات الشركة الصانعة لغسل الشرائح مع تشغيل ماء الصنبور، والذي تسبب في الخلايا لتؤتي ثمارها الشرائح. وكان التعديل لغسل الشرائح مع زجاجة غسل للعصر للحفاظ على الخلايا. كما هو موضح في القسم الخطوات الحاسمة، كان من المهم جدا عدم تطبيق مباشرة المياهالضغط على الخلايا.

هناك بعض القيود في هذه التقنية. كانت ملطخة غشاء الخلية العضلات جنبا إلى جنب مع حبيبات منقط في سيتوبلازم الخلية العضلية. تم القضاء على حبيبات عن طريق العلاج الأميليز وبالتالي من المرجح أن تكون الجليكوجين، في حين كان تلطيخ غشاء حساس للالأميليز. هوية الجسيمات PAS إيجابي على غشاء الخلية غير معروف. ويمكن أن يكون الغشاء القاعدي العضلات (perimysium). هذا الغشاء يحيط كراسات العضلات وبسبب محتواه العالي من بروتين سكري هو معروف أن تكون PAS إيجابية. الحد آخر من PAS تلطيخ هو أن حبيبات الجليكوجين يجب أن يكون لا يقل عن 50 نانومتر في قطر لتكون مرئية من قبل المجهر الضوئي التقليدي. وهكذا، يمكن أن حبيبات الجليكوجين أصغر تكون موجودة في خلية، ولكن لا يزال يسجل سلبي على اختبار PAS. الطريقة الثانية المستخدمة يتغلب على هذا القيد من خلال توفير الكشف الجليكوجين في المحللة. في تركيبة مع منحنى قياسي وهذا يمكن أن تستخدم لDETErmine المبلغ المحدد من الجليكوجين. على الرغم من أن هذه التقنية هي قابلة للقياس الكمي للغاية وليس على سبيل الحصر حسب حجم الحبيبات، فإنه في حد ذاته ديك بعض القيود. حبيبات الجليكوجين هي هياكل متفرعة معقدة مع العديد من البروتينات الإكسسوارات والكيميائية عبر وصلات، مما يجعل من غير المرجح أن إنزيمات التحلل تذوب تماما جزيء الجليكوجين كامل ^13. وهكذا، فإن الأنزيمية الكشف (مثل تقنية PAS) قد تمثل، تحت المبلغ الفعلي من الجليكوجين في عينة. طريقة واحدة للتعامل مع هذا القيد هي مع المجهر الإلكتروني الذي يحل حتى أصغر حبيبات الجليكوجين ^14. سيكون لديك واحدة لتوظيف مزيج من هذه التقنيات، PAS-تلطيخ، والهضم الأنزيمي، والمجهر الإلكتروني لتوصيف أشمل من الجليكوجين.

توضح هذه المقالة والفيديو دورية حمض شيف (PAS) تقنية تلطيخ تكييفها للاستخدام على PBMCs. وينظر إلى أهمية هذه الدراسة في خيار استخدامPBMCs على مسحة الدم، الأمر الذي جعل من أكثر جدوى لتعداد الخلايا الليمفاوية. في البداية، تم اختبار تقنية الدم اللطاخة الكلاسيكية، وكانت مع ذلك فإن غالبية الخلايا على الشريحة خلايا الدم الحمراء، وربما العدلات (الشكل 4C). لتركيز الخلايا الليمفاوية، وتنقيته من PBMCs الدم باستخدام معيار تقنية الكثافة التدرج. باستخدام تقنية مشابهة لاللطاخة الدموية، وPBMCs الالتزام بسهولة لمدة الإجراء PAS، التي لديها العديد من الخطوات غسل قوية. وقد استخدمت هذه التقنية PAS لعقود لتحديد مستويات الجليكوجين في خزعات الأنسجة العضلية، والتي مقطعة إلى أجزاء رقيقة وانضمت إلى الشرائح. وقد تم اختيار PAS تلطيخ اكثر من غيرها من المواد الكيميائية الكربوهيدرات تلطيخ نظرا لموثوقيتها العالية ووجود النتائج المتوقعة في الأدب. تم استخدام الماوس (المصحف spretus) أقسام العضلات كعنصر تحكم إيجابية وجدت، كما هو متوقع، أن 37٪ من خلايا كانت ^PAS-9 الإيجابية. من حيث التكلفة والوقت، وإعداد PBMC هو أكثر إرهاقا من مسحة الدم، ولكن هناك العديد من المزايا. أولا، وإعداد أكثر المخصب في الخلايا الليمفاوية، والتي هي خلايا الفائدة للمشاريع التي تركز على المناعة الذاتية. إذا تم استخدام مسحات الدم، فإن الخلايا الليمفاوية تكون الأقلية، مما يجعل من الصعب العثور على خلية من الفائدة. فلا يملك المرء إلا لإعداد وتحليل أكثر بكثير الشرائح للحصول على نفس الأرقام التي ستحصل مع عدد قليل من الشرائح PBMC. أن الباحثين تكون مهتمة جدا في استخدام تقنية جديدة الأمثل لدينا في مشاريع المناعة الذاتية المتعلقة داء السكري نوع 1، والتصلب المتعدد، ومرض الذئبة والتهاب المفاصل الروماتيزمي، الخ حيث T و B الخلايا الليمفاوية وخلايا NK تلعب دورا في ذلك. وبطبيعة الحال، لتطبيقات أخرى حيث الكريات الحمراء أو العدلات هي من مصلحة مسحة الدم من شأنه أن يكون الموصى بها. ميزة أخرى هي أن PBMCs يمكن استخدامها لدراسة البيولوجيا اللمفاويات البشرية في المختبر.

والبحوث الجارية وتحقق في مصدر من الجليكوجين في PBMCs. أنان المستقبل، ومن المخطط لقياس المحتوى الجليكوجين في سياق التصلب المتعدد، وT-بوساطة الخلايا اللمفاوية أمراض المناعة الذاتية الذي يؤثر على ما يقدر بنحو 2.3 مليون شخص في جميع أنحاء العالم اعتبارا من عام 2013 ^15،16. ما هي خلايا صغيرة وكبيرة في عينات PBMC؟ الخلايا في 5 ميكرون تتفق مع النسب اللمفاوية في ولاية يستريح بها. T اللمفاوية، الخلايا الليمفاوية B، الخلايا القاتلة الطبيعية، ومجموعات فرعية صغيرة أخرى ضمن هذا النطاق الحجم. وPBMCs أكبر المرجح تتكون من الخلايا اللمفية تفعيلها، التي تنمو وتكبر لأنها تتلقى اشارات من التهابات الجهاز المناعي، وحيدات من سلالة الدم النخاعي. مطلوبة تقنيات خلية فرز متقدمة مثل الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية أو المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا لزيادة تحسين فرعية التي تعبر عن الجليكوجين.

وقد استخدم الهيماتوكسيلين مكافحة تلطيخ عندما تم تلطيخ على الدم الكامل. هذا مكننا من التمييز وحيدات من الكريات الحمراء (الشكل 4C). عندما تم تلطيخ على PBMCs، حيث أن كل الخلايا وحيدات النوى، ليست هناك حاجة لمواجهة وصمة عار مع الهيماتوكسيلين لتحديد الخلايا. أيضا الهيماتوكسيلين تتدخل مع إشارة PAS في الخلايا. وباختصار، لقد أثبتنا إجراء PAS-تلطيخ تكييفها لPBMCs. هذه التقنية مفيدة للعلماء والأطباء البحث المناعة الذاتية، والعدوى والحساسية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.