Introduction
요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 널리 근육 연구 및 진단에 사용되는 면역 조직 화학 기술이다. 또한, 혈액 샘플에 대한 진단 도구로서 이용된다. 기술은 무색 쉬프 시약함으로써 진한 색 마젠타 생성물을 생산하는 반응 생성 다당류 알데히드기 유닛 내에 샘플을 산화에 요오드 산 용액을 적용하여 작동한다. 이 절차의 단계는 그림 1에 나타내었다. 얼룩은 글리코겐, 당 단백질, 당지질, 점액, 또는 다당류 부분과 다른 분자를 포함하는 다당류 마젠타, 아무것도를 켭니다.
PAS 염색 종종 근육 섬유의 글리코겐 수준을 측정하기 위해 사용된다. 근육 조직 섹션은 단단히 슬라이드에 부착하고 여러 세척 및 염색 단계를 견딜로 기술에 이상적이다. 글리코겐은 높은 수요가 유형 II 근육 섬유, 빠른 트 위치에서 가장 존재최대 성능 1,2 글리코겐을 필요로하는 빠른 ATP 생산을위한. 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제 효소의 작용을 통해 무료 포도당으로 분해 될 수있는 포도당의 분 지형 중합체이다. 휴식과 영양 자족의 시대에, 글리코겐, glycogenesis의 과정을 통해 보충하는 동안 영양 부족 또는 고 에너지 수요의 시대; 글리코겐은 글리코겐 분해에 의해 포도당으로 분해된다. 혈액 샘플에 이른 1950의 임상의 과학자들이 탐험으로 PAS 염색에서 각종 질병 3-7 글리코겐 함량을 분석합니다. 예를 들어, 폼 페병 질환-진실한 글리코겐 저장 질환 -에 백혈구 건강한 대조군 (8)로부터 크게 다르다 글리코겐 대량 축적된다.
이 비디오 문서에는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 건강한 피험자에서의 정맥혈 샘플에 대한 사용 PAS 염색 적응 버전을 보여준다. PBMCS는 자연 살해 세포 및 단핵구와 같은 T 림프구와 B 림프구 가정뿐만 아니라 다른 면역 세포 림프구를 주로 함유한다. 제 정제 단계는 적혈구, 호중구 및 다른 과립구를 제거한다. 이 기술은 전체 혈액 도말하여 PAS에 비하여 양성 세포보다 강력한 열거 허용 림프구의 농축 비율에 데이터를 제공한다.
도 1 :. PBMC에 PAS 염색 단계 방법에 의해 단계 (A) 우선, PBMC 단리는 피콜 구배 통해 이루어진다는, 왼쪽 패널 원심 분리 전에 제제를 도시 오른쪽 패널은 원심 분리 후를 도시 PBMC를 포함하는 버피 코트 관의 중심에서 관찰된다. (B)가 격리 된 PBMC 포르말린 - 에탄올 고착성을 사용 솔루 슬라이드에 고정되고기. 슬라이드 부드럽게 세척 플라스틱 병에서 증류수로 세정한다. (C)는 슬라이드 글리코겐 용해 아밀라제 용액으로 채워진 100 ㎖ 비이커 반쯤에 배치된다. 슬라이드 부드럽게 세정한다. (D)는 슬라이드 당류의 산화가 일어나는 요오드 산 용액으로 처리한다. 슬라이드 부드럽게 씻어 준다; 이는 과량의과 요오드 산을 제거하고 산화 공정을 중지한다. (E)을 쉬프 시약이 슬라이드에 첨가 될 때, 산화 단계 동안 만들어 알데히드와 반응 할 것이다. 이 무색 시약은 깊은 붉은 마젠타 제품에서 발생합니다. 슬라이드는 부드럽게 초과 쉬프 시약을 제거하기 위해 세척한다.
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Protocol
인간의 혈액 샘플을 연구 콩 코디 아 대학 윤리 심의위원회, 인증서 번호 10000618.에 의해 콩 코디 아 대학 윤리 심의위원회, 인증서 번호 2010BERG에 의해 승인 된 마우스 근육에 작업을 승인했다.
전혈 1. PBMC 분리
참고 : 멸균 기술과 제조 소독 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서이 절차를 수행합니다.
- 조심스럽게 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 헤파린 (항 응집제) 혈액 수집 튜브에서 전혈 10-15 mL에 붓는다. 작은 혈액 유출시 청소 조직을 사용 DDH 2 O 70 % EtOH로 닦아냅니다.
- 인산 버퍼 식염수 (PBS 1X) pH가 7.4 : 1의 비율로 1 원뿔 튜브에 혈액을 희석. 최대 총 용량은 30 ml를 초과하지 않는지 확인합니다.
- 부드럽게 거품을 방지 혈청 학적 피펫 총을 사용하여 섞는다.
주 : 혈액을 방지하기 위해 튜브를 반전 혼합하지 마십시오원심 분리 동안 모자 및 후속 누출에 ccumulation. - 새로운 50 ㎖ 용량 원뿔 관에, 피콜 - 페이크 13 ml에 (재료 및 장비 표 참조)를 추가합니다. 랙에 튜브를 수직으로 유지합니다.
- 전송 피펫을 사용하여, 희석 된 혈액을 상단에있는 튜브의 내부 벽에 전송 피펫 팁을 터치합니다. 느리고 일정한 압력으로 자당 층의 상부에 혈액 층을 형성하는 튜브의 내부 벽을 따라 혈액 옮긴다. 모든 혈액이 전송 될 때까지이 단계를 여러 번 수행합니다.
- 단단히 튜브 씌우고 5 매체 가속도 세트로 스윙 로터 700 XG에 실온에서 30 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 감속은 제로로 설정.
- 천천히 튜브를 꺼내 레이어를 방해하지 않고, 바이오 안전성 캐비닛에 다시 걸릴.
- 조심스럽게 PBS / 플라즈마 사이에 배치 된 PBMC이있는 버피 코트 (얇은 흐린 흰색 층), 수집차 피콜 층은 전송 피펫을 사용하여. 자당 층 수집 피하고 적혈구 층을 방해하지 않는다.
- 새로운 50 ml의 멸균 원뿔 관에 버피 코트를 전송합니다. 그것은 모든 PBMC를 수집하는 단계 1.8을 반복 여러 번 걸릴 수 있습니다.
- PBMC와 튜브에 PBS 산도 7.4을 추가하고 45 ml의 표시로 채워. 철저하게 튜브를 흔들어. 소용돌이하지 마십시오.
- 워시 1 : 원심 분리기에서 15 분 동안 원추형 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿의 형성을 관찰 (9)에 설정된 최대 가속 및 감속 모두 480 XG에.
- 표백제 10 ㎖와 플라스틱 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오.
- 부드럽게 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대해 "랙"에 의해 세포 펠렛을 풉니 다. 소용돌이하지 마십시오.
- 튜브에 신선한 PBS 산도 7.4의 25 ML을 추가합니다. 하나 이상의 튜브가 처리되는 경우,이 단계에서 함께 펠렛을 풀링.
- 2 세척 : 원심 분리기에게 튜브를 12 분 동안 480 XG 위스콘신(9)에 설정된 최대 가속 및 감속 모두 토륨.
- 표백제의 스플래시와 플라스틱 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오.
- 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대한 조심스럽게 "랙". 소용돌이하지 마십시오.
- 튜브에 신선한 PBS의 25 ML을 추가합니다.
- 세포의 50 μl를 꺼내 생존 수에 대한 microcentrifuge 관에 전송합니다.
- 트리 판 블루 (생존 얼룩)와 피펫 최대의 동일한 양 (50 μl를) 추가하고 아래로 부드럽게 혼합.
- 10 μl를 꺼내 1 ㎖ 당 세포의 생존 능력을 확인하기 위해 혈구로 전송. 세포 / ml의 수를 기록한다.
- 세포의 원하는 금액을 가지고 9로 설정 최대 가속 및 감속 모두 480 XG에 12 분 동안 튜브를 원심 분리기.
- 표백제와 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오.
- 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대한 조심스럽게 "랙". 8 추가튜브에 PBS의 0 μL.
2. PBMC 슬라이드 만들기
- 현미경 슬라이드에 세포의 80 μl를 놓습니다. 다른 슬라이드의 도움으로 드롭 얼룩이나 슬라이드의 양쪽 끝에서 40 ㎕를 각 2 방울을 배치합니다.
- 건조 할 수있는 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 둡니다. 프로스트 측에 연필로 슬라이드 레이블.
3. 슬라이드에 샘플을 고정
- 4.5 ml의 99 % 에탄올 37 % 포름 알데히드 0.5 ㎖를 혼합하여 정착 솔루션을 준비합니다.
- 슬라이드가 건조 된 후, 갓 정착액 용액 2 ㎖를 꺼내 슬라이드의 전체 표면이 피복되도록 슬라이드에 붓는다.
- 1 분 동안 슬라이드에 솔루션을 남겨주세요. 수돗물로 1 분 동안 슬라이드를 씻어 공기 건조에 둡니다.
4. 음성 대조군의 아밀라아제 솔루션 만들기
- 아밀라아제 분말 0.25 g을 디 50ml에 용해잠잠 물. 깨끗한 100 비이커에 용액을 붓고.
- 슬라이드의 절반이 치료를 수신하고, 다른 절반은 미처리 유지 한 후, 실온 (도 1C)에서 15 분 동안 인큐베이션 비이커에 슬라이드 젖어.
- 슬라이드의 측면 아밀라아제 치료를 받고있는 메모를합니다. 치료 및 제어 사이의 경계를 나타내는 슬라이드 뒷면에 선을 그립니다.
- 아밀라아제 용액을 제거하고 공기 건조에 슬라이드를 떠나 DDH 2 O와 함께 슬라이드를 씻으십시오.
5. 요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 및 이미지를 수행
주 : PAS는 시약 흡입 독성 및 부식성, 그래서 단계 화학 퓸 후드에서 수행해야하고, 노폐물을 적절히 기관 가이드 라인에 따라 처리되어야한다.
- 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 샘플에 정기 산 용액의 1.50-2.00 ml에 붓는다. Incuba실온에서 5 분 동안 TE.
- 증류수의 여러 비용이 슬라이드를 씻어.
- 슬라이드에 쉬프의 시약의 1.50-2.00 ml에 붓고 실온에서 15 분 동안 그것을 품어.
- 5 분 동안 증류수로 슬라이드를 세척하고 건조 공기에 둡니다.
- 슬라이드에 10 μl의 설치 미디어를 적용하고 두 개의 작은 된 커버 커버, 또는 50 μl를 적용하고 하나의 큰 커버 슬립을 사용합니다.
- 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 적용, 건조 하룻밤을 할 수 있습니다.
6. 100X 목표를 사용하여 쌍안 광학 현미경으로 이미지를 가져옵니다
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Representative Results
시약 및 기본 기술의 유효성을 검증하기 위해, PAS 염색 마우스 가자미근 섹션에 제조업체의 지침에 따라 수행 하였다. 염색은 제물로 같은 날에 이루어졌다과 염색의 마지막 단계에서, 섹션 자일 렌에 의해 수정되었습니다. 가자미근은 ~ 35 % 글리코겐 양성 세포 구를 포함하는 것으로 알려져있다. 근육 세포 염색은 세포 내에서 두 개의 별개 PAS 양성 특징 - 점상 과립을 표시하고, 세포막 (도 2A)를 demarking 실선. 점상 과립의 존재는 글리코겐과 일치하고, 긍정적 인 근육 세포를 정의하는 데 사용 하였다. 아밀라아제와 샘플의 치료는 그들을 글리코겐 (그림 2B)을 인과 일치하는 점 모양의 입자를 제거했습니다.
그림 2 : 담임 스테인드 마우스 근육 섹션은 광학 현미경으로 분석 하였다. 마우스 가자미근 절편 PAS 염색 하였다. 일부 샘플 아밀라아제로 미리 처리 하였다. (A) PAS 양성 입자는 근육 세포 안에 표시했다. 근육 섹션 전처리 아밀라아제 있었을 때 (B) 이하 PAS 양성 세포가 관찰되었다. 세포막 주변의 염색이 아밀라아제 처리 (스케일 바 = 100 ㎛) 후 남아 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
막 - 염색 신호도 아밀라제 처리 후에 남아 있었다. 예상 한 바와 같이 근육 아밀라제 처리 섹션은 약 5 % PAS 양성 세포 (도 3), 훨씬 적은 있었을 때, 비 - 아밀라아제 근육 섹션 PAS 양성 세포의 비율은 37 %였다.
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도 3 : PAS 양성 근육 세포의 정량화 PAS 포지티브없이 또는 아밀라아제 전처리로 대표 슬라이드로부터 카운팅 하였다이었다 근육 세포의 비율.. 예상대로, 근육 세포의 37 %는 글리코겐에 대한 긍정적이었다. 아밀라제 처리는 크게 4 % (* p <0.001)로 PAS 신호를 감소시켰다.
다음에, PAS-염색 프로토콜 절에 설명 된대로 수정 된 기술을 사용하여 건강한 인간 대상의 정맥 혈액으로부터 PBMC에서 수행하고,도 1에 도시 하였다. 세척 단계 신중하게 수행된다면 PBMC 잘 부착. PAS 염색 한 PBMC는 염색 패턴의 다양한 표시. 과립 작은 세포 (5 μm의)는 쉽게 관찰되었다. 확산 염색 패턴으로 큰 세포의 비율이 관찰되었다 (그림 4A 및 삽입 A.1-6 (그림 4B)를 감소.
그림 4 :. PBMC를 인간의 PBMC를에주기적인 산 - 쉬프 (PAS) 염색 (A) PAS-염색을 시행 하였다. 두가지 형태의 세포가 관찰되었다. 비 - 아밀라제 처리에 슬라이드 (A.1-6) 작은 셀 (5 μm의 AT는) 글리코겐과 일치 마젠타 입자를 보여 주었다. 이 세포들은 세포를 휴식 할 수있다. 비 처리 된 세포 아밀라아제가 큰 세포 (5㎛ 이하)은 미만성 PAS 양성 염색했다. 이러한 세포는 림프구를 활성화 할 수있다. (B) PBMC를 전에 신호를 PAS 염색 감소로 15 분 동안 아밀라아제로 처리 하였다. 일곱 가지 건강한 사람을 대상으로 대표. (C) PAS 및 hematoxy린 염색은 전체 혈액 슬라이드에서 수행. 화살표가 많은 적혈구 (스케일 바 = 10 μm의)에 의해 둘러싸인 PBMC를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PAS 양성 반응 비율은 더 작은 셀들에 대한 98 %와 큰 셀들에 대한 40 %였다. 아밀라제 처리는 작은 셀 PAS 신호 (p <0.001)를 제거하고 크게 7 % (도 5)에 큰 셀 PAS 신호를 감소.
그림 5 : PAS 양성 PBMC를 정량 PAS 긍정적없이 또는 아밀라아제 전처리로 대표 슬라이드에서 계산 된 있었다 된 PBMC의 비율.. 작은 크기의 세포의 98 %가 PAS 양성이었다. 큰 세포의 40 %가 P이었다PAS에 대한 ositive. 아밀라제 처리는 작은 셀 PAS 신호 (p <0.001)를 제거하고 7 % 유의하게 (p <0.001)로 크게 셀 PAS 신호를 감소.
PBMC를 또한 글리코겐의 양을 정량은 10, 11을 사용 제공하고, 이전에 다른 세포 유형 12 조브에 발표 된 두 번째, 독립적 인 방법을 글리코겐 가지고 있는지 확인합니다. 한 PBMC는 저장성 버퍼에 용해시켰다 글리코겐은 그림 6의 캡션 간단하게 설명으로 분리되었다.
그림 6 : 가수 분해 효소로 소화 효소를 사용하여 글리코겐의 측정. 글리코겐은 제조업체의 지시에 따라 측정 하였다. 요약하면, 프로토콜은 불용성 물질의 펠렛 화 한 다음 × 106 PBMC를 저 삼투압의 세포 용해를 수반즉 글리코겐이 포함되어 있습니다. 펠릿을 세척 및 측정법에 의해 측정 된 표준 곡선과 비교 하였다 글루코오스를 산출 가수 분해 효소로 분해시켰다. 세포 용 해물은 가수 분해 완충액 나타낸 비율로 희석 하였다. 데이터는 세 가지 실험을 나타낸다. 글리코겐은 상당한 수준의 하나에서 검출된다 : 1 희석 (p = 0.02) 및 용해질로서 적정이 신호는 더 희석 하였다.
불용성 글리코겐 수회 세정 한 후, 가수 분해 효소를 사용하여 분해시켰다. 소화로부터 수득 포도당의 양을 분광 광도법을 사용하여 측정하고 표준 곡선과 비교 하였다. 백만 PBMC를 글리코겐의 1.19 μg의했다. 세포 용 해물로 다운 적정 글리코겐 신호는 또한 (도 6)로 희석시켰다.
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Discussion
이 비디오 문서의 중요한 단계는 세포의 세척 및 아밀라아제 치료 중이었다. 슬라이드를 세척하는 동안, 키 단계는 플라스틱 짤 세척 병을 사용하고 물이 부드럽게 슬라이드에 샘플을 통해 실행시키는 및 샘플에 직접 목표로하지 않았다. 조금이라도 물을 직접 압력은 슬라이드를 나서야 세포를 일으킬 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 ± 아밀라아제 조건에 대해 동일한 슬라이드를 사용하는 것이 었습니다. PBMC를 상기 슬라이드에 부착 된 후에, 슬라이드는 신중히 스미어의 절반 만이 아밀라제 용액에 노출시켰다 비이커에 넣었다. 혈액 세포가 동일한 슬라이드에서 때문에이 단계 따라서 약간의 타이밍 변화로 인해 발생할 수있는 교란 변수를 최소화 강력한 제어를 제공한다. 세포 치료 없이도 잘 붙어 있으므로, 예를 들면 폴리 -L- 리신 또는 폴리에틸렌 글리콜 코팅과 관련된 추가 비용 및 시간이 보장되지 않을 것이다.
TR을 통해아밀라아제의 최적 활성을 oubleshooting 것이 결정되었다. 근육 섹션 들어, 아밀라아제 활성이 최적 배양 1 시간 내에 관찰 하였다 주목 하였다. 적절하게 PAS 신호를 제거하지 않은 짧은 시간 아밀라아제에있는 동안 긴 시간에 근육 섹션은 천천히, 슬라이드를 벗겨 것입니다. PBMC 슬라이드 용 아밀라아제 배양하는 타이밍은 15 분까지 (1 시간이었다) 근육, 샘플 타이밍에 상대적으로 감소 되어야만했다. 긴 시간은 짧은 시간이 효과적으로 PAS 신호에 영향을주지 않았지만 PBMC를가, 슬라이드를 나서야 원인이되었다. PAS 염색의 표준 프로토콜에 대한 한 변형 예에서는 슬라이드를 세정하는 방법을 변경했다. 제조업체의 지침은 세포가 슬라이드를 나서야 인한 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어 지적했다. 수정 세포를 보존하기 위해 짤 세척 병 슬라이드를 세척하는 것이었다. 중요한 단계 섹션에서 설명한 바와 같이, 직접 물을주지 않도록 매우 중요세포에 압력.
이러한 방법에 몇 가지 제한이 있습니다. 근육 세포막은 근육 세포의 세포질에 점 모양의 과립과 함께 염색 하였다. 막 염색이 아밀라아제에 영향을받지 동안 과립, 아밀라아제 처리 및 글리코겐 할 수에 따라서 가능성 의해 제거되었다. 세포막에 PAS 양성 입자의 신원을 알 수 없습니다. 그것은 근육 지하 (perimysium) 막을 수 있습니다. 이 막은 근육 다발을 둘러싸 높기 때문에 당 단백질 함량이 긍정적 PAS 것으로 알려져있다. PAS 염색의 또 다른 한계는 글리코겐 과립 직경이 적어도 50 nm의 기존의 광학 현미경으로 볼 수 있도록해야한다는 것이다. 따라서, 작은 글리코겐 과립 세포에 존재하지만, 여전히 PAS 시험에서 부정 등록 할 수 있습니다. 사용 된 두 번째 방법은 파쇄물 글리코겐 검출을 제공함으로써, 이러한 한계를 극복한다. 표준 곡선과 결합이 dete하는데 사용될 수있다글리코겐의 정확한 양을 rmine. 이 기술은 매우 정량화하고 과립의 크기에 의해 제한되지 않지만, 그 자체가 일정한 한계를 가지고있다. 글리코겐 과립은 가능성이 가수 분해 효소가 완전히 전체 글리코겐 분자 (13)를 용해 것을 만들고, 많은 액세서리 단백질과 화학 가교 복잡한 지형 구조이다. 따라서, (PAS 기법 등), 효소 - 검출은 샘플에서 글리코겐의 실제 양을 과소 나타낼 수있다. 이 제한 사항을 처리하는 한 가지 방법은 가장 작은 글리코겐 과립 14 해결 전자 현미경이다. 하나는 글리코겐의 가장 포괄적 인 특성에 대한 이러한 기술, PAS-염색, 소화 효소 및 전자 현미경의 조합을 사용해야합니다.
이 문서와 비디오는 한 PBMC에 사용되도록 요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 기술을 보여줍니다. 이 연구의 중요성은 사용의 선택에서 볼 수있다더 가능 림프구를 열거했다 혈액 도말 검사를 통해 PBMC를. 우선, 혈액 고전 미어 기술 시험 하였다, 슬라이드 세포 그러나 대부분 적혈구 및 가능 호중구 (도 4C)이었다. 림프구 집중, PBMC를 표준 밀도 구배 기술을 사용하여 혈액으로부터 정제 하였다. 혈액 도말 표본과 유사한 기술을 사용하여, 많은 PBMC를 용이 격렬한 세정 단계가 PAS 절차 기간 동안 부착. PAS 기술은 얇은 절편으로 만들어 슬라이드에 부착되는 근육 조직 생검, 글리코겐 수준을 결정하기 위해 수십 년간 사용되어왔다. PAS 염색에 의한 높은 신뢰성 및 문헌에서 예상 된 결과의 존재로 다른 탄수화물 염색 화학 걸쳐 선택되었다. 예상대로 마우스 (뮤스 spretus) 근육 섹션은 세포의 37 %가 PAS 양성 (9)이라고, 양성 대조군으로 사용 발견되었다. 비용과 시간면에서 PBM 제조C는 혈액 도말 이상 부담이지만, 몇 가지 장점이있다. 첫째, 준비는자가 면역에 중심 프로젝트에 대한 관심의 세포 인 림프구, 더 풍부한입니다. 혈액 도말가 사용 된 경우, 림프구는 도전 관심 셀을 찾을 수 있도록, 소수 일 것이다. 하나는 준비하고 몇 PBMC 슬라이드로 얻을 것 같은 숫자를 얻기 위해 훨씬 더 많은 슬라이드를 분석해야합니다. 연구팀은 T와 B 림프구와 NK 세포가 역할을 어디 한 당뇨병 등 다발성 경화증, 루푸스, 류마티스 관절염, 입력과 관련된자가 면역 프로젝트에 우리의 새로운 최적화 기술을 사용하여 매우 관심이 될 것입니다. 물론, 적혈구 또는 호중구가 관심있는 다른 응용 프로그램에 혈액 도말 검사가 권장된다. 다른 장점은 PBMC를 시험관 내에서 인간 림프구 생물학 연구를 위해 사용될 수 있다는 점이다.
지속적인 연구는 PBMC를 글리코겐의 원인을 조사하고있다. 나는N 미래, 그것은 다발성 경화증, 15, 16의 2013로 세계적 추정 2백30만명 영향을 T 림프구 매개자가 면역 질환의 맥락에서 글리코겐 함량을 측정 할 계획이다. PBMC 샘플에서 크고 작은 세포는 무엇입니까? 5 μm의에서 세포들이 휴식 상태에서의 림프 계통과 일치한다. T 림프구, B 림프구, 자연 살해 세포 및 다른 작은 부분 집합이 크기 범위 내에있다. 큰 된 PBMC 가능성이 골수 계통에서 활성화가 면역 체계에서 염증 신호를 수신으로 더 큰 성장 림프구 및 단핵구로 구성된다. 형광 활성 세포 정렬 또는 자기 활성화 된 셀 정렬과 같은 고급 세포 정렬 기술이 더 글리코겐을 표현 일부를 수정해야합니다.
염색 전체 혈액에서 수행 할 때 헤 마톡 실린 카운터 염색을 사용 하였다. 이는 적혈구에서 단핵 세포 (구별 할 수있게도 4c). 염색 한 PBMC에서 수행 될 때 모든 셀 단핵 이었기 때문에, 셀을 식별하기 위해 헤 마톡 실린으로 카운터 염색 할 필요가 없었다. 또한 마톡은 PAS 세포 신호를 방해 하였다. 요약하면, 우리는 PBMC를 적응-PAS 염색 과정을 보여 주었다. 이 기술은자가 면역, 감염과 알레르기를 연구하는 과학자와 임상에 유용합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Periodic Acid Shiff Kit |  Sigma-Aldrich |
395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution. |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich |
A3176 | |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich |
MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare |
17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose. |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used. |
References
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).
- Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
- Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
- Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
- Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
- Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
- Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
- Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
- Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
- Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
- Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
- Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
- Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
- Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: http://www.atlasofms.org (2013).
