Abstract
Вымирание условного страха была тщательно изучена в мужских грызунов. В последнее время были все большее число исследований, показывающих, что нейронные механизмы для определенных поведенческих задач и поведения реагирования отличаются у женщин и мужчин. Использование женщин в научных исследованиях может представлять собой проблему из-за изменения половых гормонов во время их эстрального цикла. Этот протокол описывает устоявшиеся процедуры, которые являются полезными в исследовании роли эстрогенов в страхе консолидации вымирание памяти у крыс-самок. Фаза эстрального цикла и экзогенное введение эстрогенов до исчезновения обучения может влиять исчезновения отзыв 24 ч позже. Вагинальный техника швабры для эстрозного идентификации фазы, описанной здесь помогает осмотр и манипуляции, естественно, езда на велосипеде половых гормонов. Использование этой базовой модели грызунов может дополнительно определять механизмы, посредством которых эстроген может модулировать страх экстинкции памятьженщины.
Introduction
Врожденные половые различия наблюдаются в различных когнитивных поведения и обучения парадигм в обоих людей и грызунов. Например, было сообщено, что женщины, как правило, сильные устные и ориентированы на детали способности, в то время как мужчины имеют лучшие пространственные способности 1-3. Эти половые различия могут быть отчасти из-за влияния половых гормонов. Высокий уровень эстрадиола повысить производительность задач, в которых женщины лучше, но ухудшить производительность на задачах, которые мужчины, как правило, хорошо 4-6. Хотя это свидетельство является убедительным, ограниченная способность полностью контролировать экспериментальных условий, в исследованиях на людях делает его трудно определить, если эти эффекты на поведение можно отнести именно к гормонам. Исследования на животных, напротив, позволяют полностью контролируемых условиях.
Хотя основные нервные механизмы страха вымирания были выявлены и изучены у мужчин, неясно, является лиЭти системы являются одинаковыми или у женщин, как они изменяются по эстрального цикла. Кондиционирование Страх и вымирание широко используются поведенческие парадигмы у грызунов и человека для проведения исследований, связанных с тревожными расстройствами. Учитывая, что женщины имеют более высокий риск для тревожных расстройств, а также более высокую продолжительность симптомов и тяжесть 7-13, важно включить женщин в этих исследованиях. Недостаточная женщин в этом исследовании может быть связано с проблемами эстрозного контроля фаз и учета поведенческих эффектов половых гормонов. Лаборатории, осуждающих женщин в этом отношении вопросов, обнаружите, что часто не регистрируются и не описанных в способах их исследований.
Новые доказательства грызунов предполагает, что половые различия в страхе исчезновения модулируются половых гормонов 14-18. В страхе кондиционирования, животные обучаются бояться конкретного раздражителя. После ряда неармированных презентацийстимул, животные научиться не бояться кий, процесс, называемый вымирания. Как хорошо животное учится и закрепляет память обучения эту задачу можно наблюдать во время испытания вымирание отзыва данного спустя некоторое время после обучения вымирания. Менее выражение страха во время тушения отзыва демонстрирует хорошую консолидацию вымирание памяти. Недавние исследования в нашей лаборатории предполагают, что эстроген может модулировать консолидации страха вымирания памяти и улучшить исчезновения отзыв. В частности, у самок крыс, которые тушили в проэструсе, фаза эстрального цикла, в течение которого циркулирует пиковые уровни эстрогена, проявляют повышенную задержку исчезновения памяти. В отличие от этого, женщины, которые тушили в низкой эстрогенов metestrus фазы обладают относительно бедных вымирание Напомним, которое может быть улучшено с администрацией экзогенный эстрадиол до или сразу же после исчезновения обучения 15,16. Нервные механизмы консолидации памяти исчезновения (в т.ч.uding роль половых гормонов) у женщин не ясны.
В лабораторных животных, роль гормонов могут быть исследованы с помощью инвазивных процедур удаления хирургические, такие как кастрация и удаление яичников. После восстановления после операции, половых гормонов часто экзогенно манипулировать во время выполнения поведенческого задачи 19. Такой подход обеспечивает необходимую информацию о половых гормонов и полезен, поскольку он позволяет хорошо контролируемых манипуляций половых гормонов (с точки зрения сроков и дозы) 20-23. Этот подход, однако, не позволяет оценить влияние природных колебаний, которые происходят по всему эстрального цикла и они не представляют собой «нормальные» животных, тем самым ограничивая поступательное потенциал для исследований на людях. Он был хорошо документированы, что уровень женских половых гормонов пик и спад в определенных фазах эстрального цикла, а также изменения экспрессии рецепторов эстрогена в течение цикла,и после овариэктомии 24. Таким образом, существует необходимость в проведении исследований на женщинах с неповрежденными половых желез и уточнить экспериментальные проекты, чтобы надежно изучению влияния, что высокие и низкие состояния эстрогена может оказывать на женщин на протяжении всей их жизни.
Этот протокол фокусируется на эффекте эстрогенов на нейробиологических систем, участвующих в страхе исчезновения. Он описывает, как: 1) внимательно следить за цикл течки, 2) подготовить эффективные дозы эстрадиола для системного введения, и 3) следуют поведенческие парадигмы, которая включает в себя страх кондиционер, вымирание, и вспомнить в естественно Велоспорт самок крыс. Этот протокол может быть изменен с другими фармакологическими манипуляций и клеточных и молекулярных инструментов, чтобы помочь исследования, чтобы лучше понять половые различия, которые наблюдаются в условный страх поведение вымирания. Обратите внимание, что процедуры, описанные ниже, являются использовать в течение нашей лаборатории, и существуют множество вариаций этих процедур ян литература.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе были одобрены подкомитета по научным исследованиям животных помощи, которая служит уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) для Массачусетского общего госпиталя, и в соответствии с национальными институтами инструкций по охране.
1. Содержание животных и процедура обработки
- Прибыв на место, дом для взрослых Sprague Dawley самок крыс около 8-10-недельного возраста (весом 200-225 г) в группах по 3-4 дюймовых пластиковые контейнеры с щепы постельные принадлежности. Поддерживать их на диету объявлений доступ вволю чау и воды и 12 ч свет / темнота цикла. Оставьте крыс акклиматизироваться к жилищным условиям и животных объекта в течение как минимум 1 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этой рукописи проводятся в течение светового цикла. - После этого периода акклиматизации, обрабатывать все животные в течение 5 минут каждый в течение 2-3 дней. Правильно подобрать крысы по одному (поддерживаются туловища, а не за хвост),держать их надежно, и погладить их в течение этого времени. Обращайтесь животных, которые появляются более подчеркнул, нервный или тревоги в течение более длительного периода времени. Сделайте это, чтобы свести к минимуму обращения стресс, который может повлиять на следующие шаги в этом протоколе.
ПРИМЕЧАНИЕ: количество дней и количество времени, обработки животных может варьироваться в зависимости от различных лабораториях; Однако, они должны быть согласованы между экспериментами в пределах одной и той же лаборатории.
2. Контроль за цикл течки: вагинальный тампон размытие и Процедура окраски
- Сделать 0,9% солевой раствор (хлорид натрия, растворенного в дистиллированной воде). Смочите ватный-аппликатор в этом растворе. Промокните кончик, используя бумажное полотенце, чтобы избежать перенасыщения, которые могут привести к неадекватности сбора или потери клеток образца. Проведение хвост вверх от входа во влагалище, аккуратно вставьте кончик хлопок в вагинальный канал и свернуть вдоль стен, чтобы захватить свободные вагинальных клеток.
- Если животное мочится на кроватит наконечник, замените его новым, как загрязнение мочи будет трудно для идентификации фазы. Будьте крайне осторожны, чтобы не причинить страдания животному во время этой процедуры, так как воздействие стресса будет нарушать цикл течки. Когда моечные, стремиться к достижению быстрого введения и отмены, который не слишком глубоко, чтобы свести к минимуму дополнительные стимулы к шейке матки, которые могут вызывать Ложная.
Примечание: Ложная могут быть идентифицированы в качестве ациклического эстрального цикла, что, как правило, длится в течение примерно 12 дней, т.е. последовательных дней диэструса 25. - Осторожно снимите наконечник аппликатора и свернуть его на предварительно меченных предметное стекло. Не нажимайте вниз слишком сложно, как слишком много жидкости на слайде можно сделать Идентификация фаз трудно после высыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один слайд может содержать несколько дней для каждого животного, хотя это может быть сделано в соответствии с индивидуальными предпочтениями. - Убедитесь, что образец переводы на слайде. Сбор образцов для SeverAl дней подряд на одном слайде, чтобы иметь возможность лучше отслеживать и идентифицировать ежедневные эстральных фазы изменения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, он также идеально подходит, если люди собирают образцы остаются одинаковыми для всех животных. - После того, как ползун сухой, начинают протокол окрашивания для идентификации фазы. Использование окрашивания комплект (табл материалов), погрузите слайды 10 раз в фиксатора (голубой), 10 раз в пятно раствором (розовый), и 5 раз в контрастирующая решения (фиолетовый). Промыть слайды аккуратно под проточной водой. Пусть слайды полностью высохнуть на воздухе перед просмотром под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: обычно 4-5 дня течки цикл состоит из (в этом порядке): течка (E), metestrus (M), диэструс (D), и проэструс (P) 26. Эструс характеризуется синий, ороговевших клеток, metestrus лейкоцитами и комбинации ороговевших и ядерных клеток, диэструс аналогично metestrus в присутствии типов клеток за исключением того, что они очень редки, и проэструс пурпурными пятнами агрегатовядерных клеток (рисунок 1). Существуют различные процедуры окрашивания, в дополнение к тем, которые описаны выше, которые в равной степени эффективны для вагинального мазка цитологии. - Соберите образцы в течение по крайней мере двух полных циклов (~ 8-10 дней) для того, чтобы контролировать фазы точно до эксперимента. Будьте последовательны со временем суток, когда берутся пробы. Сбор образцов вагинальных мазков ежедневно в течение и до конца эксперимента.
3. Pre-экспозиция
- До начала эксперимента, предварительно подвергнуть животных в кондиционирования камеры дают животным привыкнуть к контексту (кондиционирования камер) перед любым поведенческим тестированием.
- Pre-разоблачать женщин в той кондиционирования камер (расположенных в звуковых-ослабления коробок) с домом огни на в течение 20-30 мин в день в течение 3 дней до любого эксперимента. Связать коробку они предварительно подвергались, как их камеры для исследования. Тщательно очистите тон коробки (стены и лотки) в период между сессиями и животных для удаления запахов, так как они могут влиять на поведение и эстрального цикла.
4. День 1: Привыкание / Страх Кондиционер
- После того, как животные были проверены, чтобы быть в фазе течки их эстрального цикла, начинают фазу привыкание / кондиционирования в 3-дневном эксперименте.
- Возьмите предварительно тон базовых мер по заморозке до первого тона условного раздражителя (CS) презентации на каждый день эксперимента. Сделайте это путем приобретения баллы процентов замораживания (рассчитывается путем деления секунд, проведённых неподвижны длительностью судебного разбирательства, умноженное на 100) в течение стимула-отсутствует промежуток времени в начале первого CS-только суда до наступления CS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти меры могут быть использованы для оценки и сравнения базовых уровней замораживания с тем, во время привыкания, кондиционирования, исчезновения, и вспомнить. - Для проведения исчезновения обучение во время фазы metestrus,состояние крыс в их последний день течки. Тампон и определить течки фаза (этап 2) каждый день перед началом экспериментального протокола (кондиционирование / исчезновение / повторного вызова). Как течка фаза может длиться дольше, чем один день, использование история цикла предсказать длину фаз чтобы определить, когда животные готовы начать обучение.
- Возьмите предварительно тон базовых мер по заморозке до первого тона условного раздражителя (CS) презентации на каждый день эксперимента. Сделайте это путем приобретения баллы процентов замораживания (рассчитывается путем деления секунд, проведённых неподвижны длительностью судебного разбирательства, умноженное на 100) в течение стимула-отсутствует промежуток времени в начале первого CS-только суда до наступления CS.
- В кондиционирования камер, подключите футов шок решетчатый пол с электрическим генератором стимуляции. Используйте уровень стимуляции 0,5-0,6 мА в качестве безусловного раздражителя (США). Используйте 4 кГц, тон 80 дБ, как условный раздражитель (CS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут варьироваться в зависимости от лаборатории и могут быть изменены для оптимального кондиционирования.- Если программа замораживания анализ требует визуальные подсказки (в отличие от временных), со-активации светодиодные с тоном. Поместите свет на внешней стороне оперантного камере, в видеокадра. В начале каждого испытания, включите светодиодной подсветкой, и держать его не горит до конца гое испытание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот свет не виден животным и служит только в качестве маркера для начала и конца судебное разбирательство в записанных видео файлов (используется для измерения поведения замерзания).
- Если программа замораживания анализ требует визуальные подсказки (в отличие от временных), со-активации светодиодные с тоном. Поместите свет на внешней стороне оперантного камере, в видеокадра. В начале каждого испытания, включите светодиодной подсветкой, и держать его не горит до конца гое испытание.
- Поместите животных в кондиционирования камер для 5 CS-только испытаниях привыкания. Сразу же после привыкания сессии, выполните 7 парных CS-американских испытаний страха кондиционирования. Убедитесь, что тон CS длится в течение 30 сек coterminates с 0,5 сек США током. Проводить испытания в всех сессий (привыкание, кондиционирование, вымирание, и помню) с переменным intertrial интервал усреднения 3 минут.
- В конце устройства формирования сессии, не возвращают животных в их клетки и объекта животного до следующего дня.
5. День 2: Эстрадиол Подготовка
- Тампон и определить течки фазу для всех животных, подвергшихся день 1 настоящего Протокола. Подготовка эстрадиол (также известный как E2, 17бета-эстрадиола илибета-эстрадиол) в течение 15 мкг / кг подкожно с использованием кунжутного масла или 0,9% солевой раствор в качестве транспортного средства.
- Чтобы вычислить количество эстрадиола, чтобы подготовить для инъекций, используют массу тела всех животных, которые были измерены и записаны, когда они были обусловлены на 1 день этого протокола.
- Сделать расчеты по стандартизации введенного объема эстрадиола (т.е. 0,2 мл) на крысу. Поскольку эстрадиол трудно растворим в связи с его нерастворимость в воде и требует большого объема растворителя для малой дозы, подготовки исходного раствора путем смешивания эстрадиол в кунжутном масле более высокой температуре, пока не растворится. Раствор затем может быть пропущен через 0,22 мкм фильтр для удаления загрязнений. Например, можно добавить вычисляемый объем в 3000 мкг эстрадиола / 1 мл кунжутного масла исходного раствора к общему необходимого объема кунжутное масло, с тем, чтобы достичь 15 мкг / кг дозу в объеме 0,2 мл на животное инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, использовать другие формы эстрогена Tha т являются водорастворимыми и легче растворяются.
6. День 2: Эстрадиол управление / Extinction Обучение
- Администрирование эстрадиола подкожно. Поднимите дряблая кожа между лопаток за шею в нежном шнура и вставить иглу шприца в треугольник, который образован в складках кожи.
- 30 минут после подкожной инъекции эстрадиола, место животных в кондиционирования камер и приступить к вымирания обучение. В этом исчезновения сессии, выполните 20 CS-Alone испытания, с каждым испытанием, состоящей из 30 сек, 4 кГц, тон в 80 дБ, представленных на переменном intertrial интервал усреднения 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: эффект эстрадиола об отзыве происходит, когда эстрадиол вводят до исчезновения тренировки или сразу после исчезновения. Эффект не наблюдается 4 ч после исчезновения, поэтому его рекомендуется вводить близко по времени к началу или концу тренировки 15.
- 24 ч после обучения исчезновения, мыть животных, которые завершили день 1 и 2 настоящего Протокола.
- Поместите животных в их назначенных кондиционирования камер (такие же, как День 1 и 2). Начните исчезновения отзыва сессии, представляя 3 CS-Alone исследования (три испытания исчезновения отзыва), который состоит только из 3,80 CS-только дБ испытаний с intertrial интервалами, подобных 20 испытаний в ведении для тушения обучения, как описано в шаге 6.2.
- После завершения отзыва сессии, вернуть животных в их клетки.
Анализ 8. Данные
- Приобретать поведенческие данные с помощью видео и анализировать их с помощью компьютерных программ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание оценки также может быть вручную пересчитать экспериментатором, который слеп к лекарственной терапии по времени приступы замораживания во время презентации CS каждого испытания, выраженное в процентах от времени, проведенного замерзания во время звукового сигнала. Замораживаниеопределяется полным отсутствием движения, за исключением дыхания во время 30 сек CS-американских исследований. Рассчитать процентное замораживания путем деления секунды, потраченные замораживания (неподвижным) на 30 секунд (длительность судебного разбирательства), умноженное на 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе отзыва страх экстинкции, процент замораживания измеряли как показатель страха. Животные, которые тушили хорошо и сохранили память о подготовке исчезновения характерно низкое страх на последний день тестирования поведения во время тушения отзыва. Мужские и женские крыс существенно не отличаются условного выражения страха во время кондиционирования, исчезновения, и вспомнить этапы (рисунок 2). Тем не менее, разница секс становится очевидным, когда животные, анализируются отдельно, как с высоким и низким содержанием эстрогена эстрального фазовых групп. Самки крыс, которые подвергаются исчезновения обучение во время фазы низкой эстрогенов metestrus эстрального цикла не помню память экстинкции на 3-й день, а также тем, кто обучался в проэструсе (рис 3). Эти metestrus женщины также проявляют значительно более высокий выход страх во время тушения отзыва (плохая память вымирание) по сравнению с мужчинами. Однако, когда metestrus самки подкожно INJECТед с 15 мкг / кг дозы эстрадиола до исчезновения обучения в консолидация памяти страх исчезновения, кажется, быть повышена, как показано на низкой замораживания во время тушения отзыва (рисунок 4). Таким образом, эти данные показывают, что половых гормонов может модулировать страх исчезновения отзыв, а также посредником половые различия в условных поведения страх исчезновения.
Рисунок 1: Типичные изображения типов клеток в фазах эстрального цикла (увеличение 20х) Проэструс характеризуется масс круглых, пурпурно-окрашенные ядросодержащих клеток эпителия.. Эструс можно определить по агрегатов голубыми пятнами, плоскоклеточный ороговевших клеток. Metestrus и диэструс выразить сочетание типов клеток (лейкоцитов, сплоченной и ороговевших клеток), но показать меньше клеток. Уровень эстрогена колебаться в течение течки этапов, Достигнув в ходе проэструсе. (Met = metestrus;.. Диест = диэструс;. Проесть = проэструс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Сравнение между мужчинами и женщинами во всех трех фазах эксперимента Там нет существенных половых различий, наблюдаемые в привыкания (. Жил), кондиционер (. Конд), вымирание, или вспомнить этапов эксперимента 15.
Рисунок 3: поведенческие различия между проэструсе (высокий эстроген) и metestrus (низкий эстроген) женщины Женщины в высоком эстрогенов проэструс фазы вывода.F течки проявляют цикл меньше страха, чем те, в странах с низким содержанием эстрогена metestrus. Эти данные свидетельствуют о том, что уровень эстрогена в естественно велосипедных женщин может влиять на консолидацию страх исчезновения памяти, модуляции Напомним, 24 ч спустя 15 лет.
Рисунок 4: Эстроген лечение в metestrus женщин. Администрация эстрадиол 30 мин до исчезновения обучения (стрелка) облегчает исчезновения отзыв сравнению с носителем 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Страх вымирание была тщательно изучена у самцов крыс с нервных механизмов, опосредующих условный страх исчезновения определены и оценены в соответствии с различными манипуляциями. Относительно мало исследований самок крыс или роль половых гормонов в страхе исчезновения. Специально изучать влияние эстрогенов на страхе исчезновения, естественно велосипеде самок крыс подвергали три дня поведенческой парадигмы. Эта процедура состоит из фаз привыкания / кондиционирования, исчезновения и вымирания отзыва. Используя этот протокол, было продемонстрировано, что самки крыс обучаются исчезновения во время низкого эстрогена metestrus фаза выставочная выше точки замерзания (или нарушением исчезновения помню) по сравнению с женщинами, которые гасятся в высоком эстрогенов проэструсе 15. Администрация эстрадиола до исчезновения подготовки на этапе metestrus модулирует консолидации исчезновения памяти 16. Об этом свидетельствует уменьшением морозилг во время тушения отзыва. Вместе взятые, эти результаты указывают на важность проведения женские исследования, обращая особое внимание на влияние гормонов яичников и эстрального цикла на поведение. Хотя контрольные эксперименты не были описаны здесь, это будет необходимо включить соответствующие элементы управления, то есть без каких-либо вымирания групп, для дальнейшей оценки влияния эстрогенов на процессы, связанные с консолидацией вымирание памяти.
Цель этого протокола состоит из двух частей: 1) исследовать влияние эстрогенов на условный страх исчезновения в течение определенного фаз эстрального цикла у интактных животных, и 2) изучить, насколько остро эстрадиол замена во время самки обычно низкое положение эстрогена может модулировать его поведение. Через влагалища процедуры получения смывов, описанном здесь четыре фазы эстрального цикла можно выделить: течки, metestrus, диэструс и Проэструс. Это позволяет нам оценить поведение, когда гормоны яичников суч как эстроген, естественно, при низких и высоких концентрациях. Например, уровни эстрогена низки во время течки (20-40 пг / мл), metestrus (15-20 пг / мл), и диэструс (25-40 пг / мл) фазы, но с высоким течение проэструса (~ 75 пг / мл) фазы эстрального цикла 27,28. Эти фазы не только отличаются гормональной среде, но и в продолжительности. Хотя переменная, проэструс была, как правило, наблюдается длиться от 12 до 14 ч; течка от 25 до 27 часов; metestrus от 6 до 8 часов; и диэструс для 55 до 57 часов. Продолжительность каждой фазы может быть длиннее или короче, чем один день (в зависимости от животного), что приводит к 5-дневных циклов, которые включают 2 дней либо диэструса или течки. Как уже упоминалось, проэструс и metestrus более короткие фазы (12-14 и 6-8 ч соответственно) и могут быть пропущены. В этом протоколе, поэтому решающее значение для внимательно следить за цикл течки при использовании естественно Велоспорт гормоны животного для изучения межфазных различий в способности вспомнить исчезновения обучениеза день до. Цикл течки у самок крыс, так же, как менструального цикла человека, также чувствительна к многочисленных внешних факторов, таких как возраст, стресс, времени суток, жилищных условий, температуры и т.д., и их следует рассматривать при планировании экспериментов. Животное может стать ациклические (Extended течки / диэструс) или отобразить нерегулярном цикле (менее 4 дней или дольше, чем 5 дней) до или во время исследования. В этом случае, эти животные будут исключены из экспериментальных анализов, будучи строгим к тестированию в течение определенного фаз эстрального цикла. Важно отметить, являются переходными этапами, в течение которого образцы смешиваются со слизью, что делает его немного трудно четко определить конкретные типы клеток, которые характеризуют каждый этап. Это также может быть из-за времени суток тампон берется. Если есть чрезмерное количество слизи, как разряда во время мазка коллекции в результате ежедневного свабирование, но позволяет несколько дней обработки, чтобы пройти без моечныеЭту проблему можно устранить.
В дополнение к эстрального способа идентификации фазы, описанной здесь, другие методологические инструменты могут быть использованы для получения меры циркулирующего яичников концентрации гормона в сыворотке крови. Например, концентрация эстрогена может быть определена количественно в образцах крови с использованием иммуноферментный анализ (ELISA). В этой процедуре, эстрогены в сыворотке / плазме образцы связываться с конкретной анти-эстрогена антитела, который связан с ферментом. Субстрата фермента приводит к реакции, что приводит к видимой сигнала, таких как изменение цвета, которое может быть измерена с помощью спектрофотометра. Этот инструмент вычисляет поглощение и обеспечивает количественную оценку уровня эстрогена в образце. Этот способ может быть полезен при оценке, естественно, колебания уровня эстрадиола через эстрального цикла, и что более важно, в определенные моменты времени в ходе эксперимента. Он также может быть использован для определения того, как экзогенное введение эстрогенов может изменить нормуAl физиологические концентрации. Измерение концентрации эстрогена из крови может предотвратить проблемы с идентификацией фаз в процессе переходного периода этапах, или когда мазки трудно читать из-за слизи в образцах. К сожалению, этот метод может стать довольно дорогостоящим и предложения отдаленных результатов по сравнению с вагинальным коллекции мазка.
Процедуры получения достаточных образцы крови, например., В хвостовую вену, орбитального синуса, хвост СНиП и подкожной вены 29, может вызвать излишнюю нагрузку на животных. Это может повлиять на уровень гормонов в критические моменты в эксперименте, что приводит к неточным или перекос измерений. Использование багажника кровь для определения уровня эстрадиола терминал и, следовательно, обеспечивает очень ограниченную информацию о гормональных колебаний в течение фаз. Оценка вагинального цитологического исследования клеток, кажется, предлагает лучшую альтернативу. Хотя этот метод может обеспечить только приблизительную оценку яичников профилей гормонов через эстрального фаз, он можетсвести к минимуму стресс и впоследствии меньше вреда поведенческой эксперимента.
Есть различные формы эстрогенов, стероидов, которые, естественно, циркулирующие в организме человека и нечеловеческих животных, таких как эстриола, эстрадиола, и эстрона. В этом протоколе, эстрадиол остро вводить с помощью подкожных инъекций. Эстрадиол (синоним E2, 17бета-эстрадиола или бета-эстрадиол) используется в данном протоколе, поскольку он является наиболее эффективной формой в природе эстроген у небеременных женщин 30. В отличие от острых уколов эстрадиола, другие лаборатории использовали методы длительном приеме эстрогенов. Например, подкожные имплантаты с медленным высвобождением гранул или силастических капсул позволяют для устойчивого, непрерывного доставки эстрогена или транспортного средства решения 19. Эта процедура, как правило, используется в сочетании с ovariectomies, которые устраняют естественный репродуктивного состояния животного.
Manipulations обсуждаемые здесь сосредоточиться на натуральные гормональные государства содействовать клинического применения лабораторных исследований. Люди с посттравматическим стрессовым расстройством (ПТСР), как правило, нарушается их способность погасить страх раздражителя, связанных с их травматический опыт и помните, что это вымирание. Это условие часто сохраняется еще долго после событий прошло. Длительная терапия воздействия является распространенным вариантом лечения для ПТСР, которая опирается на вымирание на основе процессов, изучаемых в моделях грызунов, таких, как описана здесь. Интересно, что женщины примерно в два раза чаще, чем мужчины разработать стресс и беспокойство, связанные с психическими расстройствами 31. Эта разница секс в распространенности могут быть связаны с половых различий в процессах вымирания страха и лежит в основе потенциальное клиническое значение этих лабораторных исследований. Несмотря на высокую распространенность ПТСР у женщин, сравнительно мало боятся вымирания исследования на грызунах, были проведены в женщин. Женский исследования сосредоточенымости от роли половых гормонов не следует упускать из виду при рассмотрении половые различия в поведении. Характеризуя поведенческих эффектов, естественно, колебания уровня гормонов через эстрального цикла содержит ценную информацию в принципиальных различий в поведении между мужчинами и женщинами. Этот протокол обеспечивает базовую модель, чтобы облегчить будущие исследования гормонов яичников и их влияние, но не ограничиваясь, когнитивных и поведенческих процессов, таких как страх исчезновения. Этот протокол фокусируется на определенном половых гормонов, эстрогена, тем не менее, влияние других гормонов, таких как прогестерон и тестостерон также могут быть оценены. Использование поведенческой парадигмы представлены здесь в сочетании с другими фармакологическими, клеточном и молекулярных методов (т.е. локализованные настои лекарственных средств, иммуногистохимия, вестерн-блот), будущие исследования могут выявить конкретные сайты / целевые действия эстрогена в головном мозге, что может привести к усилению поведенческой терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы этой рукописи не имеют конкурирующие финансовые интересы или другие конфликты интересов раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
