Neuroscience

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52204

Tobias Ruck¹, Stefan Bittner^1,2, Lisa Epping¹, Alexander M. Herrmann¹, Sven G. Meuth^1,3

¹Department of Neurology, University of Münster, ²Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, ³Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I, University of Münster

Introduction

الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الخلايا البطانية (BMEC) شكل الطبقات الوحيدة التي تشكل جزءا لا يتجزأ من درجة عالية من التخصص الدم في الدماغ من العوائق (BBB). مترابطة BMECs من البروتينات صلي تعلق على الغشاء القاعدي. جنبا إلى جنب مع pericytes، وخلايا العضلات الملساء، قدم نهاية نجمي وخلايا الدم يبنون ما يسمى وحدة وعائية عصبية (NVU) ^1. ضد فكرة سابقة من حاجز كتيم بين الدم و-عصبي-النظام المركزي (CNS)، وNVU هو واجهة ديناميكية ومحددة للغاية والتنظيم الذي يسيطر على الانتقال من السوائل، والجزيئات والخلايا بين الأوعية الدموية الدماغية والجهاز العصبي المركزي ² . خلل وظيفي أو التقلبات في NVU قد بدء و / أو المساهمة في مجموعة متنوعة من الوعائية العصبية، والأمراض المعدية، والتهابات أو التنكسية في الجهاز العصبي المركزي، مثل السكتة الدماغية، ومرض الاعتلال الدماغي، والتصلب المتعدد، الزهايمر أو مرض باركنسون ^3-6.

_content "> وختم أحادي الطبقة BMEC بإحكام من قبل مجمع صلي تتألف من ضيق (TJ) والملتصقة تقاطعات (AJ) ^7. والمقاومة الكهربائية عالية ونفاذية منخفضة paracellular من BBB تقوم أساسا على البروتينات TJ ^(8). وTJS و المجمعات التي شكلتها البروتينات عبر الغشاء من عائلة claudin وoccludin، التي ترتبط الهيكل الخلوي للخلايا البطانية من قبل جزيئات محول، مثل zonulaoccludens (ZO) البروتينات ZO1-3 ^4، ويتم تجميعها بشكل رئيسي تقاطعات الملتصقة بها بروتين الغشاء لا يتجزأ الوعائية البطانية (VE) -cadherin، الذي يرتبط الهيكل الخلوي عبر catenins ^8.

وختم ضيق من BBB يمنع التبادل الحر للركائز والخلايا بين الدم والسائل النخاعي. استثناءات لهذه القاعدة هي محبة للدهون، جزيئات صغيرة ذات وزن جزيئي <400 دا، والتي هي قادرة على عبور BBB من قبل بوساطة الدهون نشر ^9. مرور أكبر و / أوجزيئات ماء، مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية، والببتيدات والبروتينات والعديد من الأدوية يقتصر على أنظمة رقابة شديدة النقل العابر ^لل10، والتي يمكن تصنيفها إلى خمس فئات رئيسية هي: النقل بوساطة الناقل، نقل أيون، والنقل هروب رأس المال النشط، بوساطة مستقبلات النقل، وcaveolae بوساطة النقل ^4. هذه الأنظمة تساعد على نقل الحفاظ على التوازن للجهاز العصبي المركزي، وهو مطلوب لجيل إشارة دقيقة، التنبيغ والتكامل. وعلاوة على ذلك، BMECs هي قادرة على السيطرة بفاعلية على انتقال الجزيئات متميزة من خلال التعبير عن مجموعة متنوعة من ectoenzymes. يتم ترجمة هذه الإنزيمات على سطح الخلية وتعديل ركائز الداخلية والخارجية التي تعيق أو محددة تسمح بالانتقال من BBB ^11.

في حين اعتبر الجهاز العصبي المركزي كجهاز المناعة حظا لفترة طويلة، وتشير النتائج الأخيرة لنظام ديناميكي ومنظم بإحكام بدلا من surv المناعةeillance من الجهاز العصبي المركزي. وBMECs تشارك بشكل حاسم في تنظيم هجرة الخلايا المناعية. من خلال التعبير عن selectins على الخلايا الليمفاوية سطحها والناجم بشكل انتقائي إرفاق فضفاضة إلى البطانة. إفراز كيموكينات التي تواجهها مع مستقبلات معينة على الكريات البيض يؤدي إلى التعبير أو تغيير متعلق بتكوين integrins من الكريات البيض، مثل LFA-1 (وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد 1) وVLA-4 (أواخر جدا مستضد 4). وintegrins توسط في التصاق متين من قبل ملزم counterreceptors البطانية، وعلى سبيل المثال VCAM-I (الأوعية الدموية جزيء التصاق الخلية)، ICAM-I (بين الخلايا جزيء التصاق) تمكين التهجير في لحمة بين الدماغ أو من خلال BMECs من BBB ^12-14. هذه النتائج وغيرها تؤكد على الدور النشط للالبطانة نفسها في تنظيم هجرة الخلايا المناعية.

وعلاوة على ذلك، BMECs كما يشارك جزءا من NVU في تنظيم تدفق الدم الدماغي لىnked لمطالب الأيضية العصبية المحلية. على التحفيز نجمي الخلايا تنتج الخلايا البطانية المواد فعال في الأوعية مثل أكسيد النيتريك مما يؤدي إلى التخفيف من خلايا العضلات الملساء الوعائية ^15.

الأوعية الدموية والخلايا العصبية في البلدان النامية وكذلك في المعرض الدماغ الكبار الزخرفة موازية والتنمية وتبادل العديد من خصائص التنظيم ^{1، 4.} الخلايا البطانية وتشارك بشكل حاسم في هذه العمليات ^{16، 17.}

باختصار، BMECs توفر ميزات أساسية لتبرير التنمية السليمة وأداء الجهاز العصبي المركزي. يرتبط ضعف BBB إلى العديد من الاضطرابات العصبية الحادة. ومع ذلك، فقد تم التعرف سوى عدد قليل جدا من الأهداف في واجهة الدماغ الأوعية الدموية لعلاج محدد وفعال ^18. نماذج مبسطة في المختبر استخدمت لفهم الآليات التي تشارك في تنظيم وظيفة من الأنظمة الفسيولوجية المعقدة للوالوقت نانوغرام. العزلة كما وصفها هذا المخطوط والدراسة في المختبر من الفئران BMECs، نظرا لمجموعة واسعة من الماوس خروج المغلوب-سلالات محددة، قد يوفر المزيد من التفهم لوظيفة BBB والتنظيم في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض فتح آفاقا علاجية جديدة.

Protocol

وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل السلطات المحلية ("LandesamtfürNatur، UMWELT اوند Verbraucherschutz NRW، Fachbereich 87، Tiergesundheit، Tierschutz، ركلينغاوسين، ألمانيا") والتي أجريت وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان.

1. تعليقات عامة عن تجارب ماوس

أداء جميع التجارب باستخدام الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام كل منها.
الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
استخدام الفئران السن والجنس المطابقة في المجموعات التجريبية وذلك لأن الخصائص البيولوجية يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس.
كلما أمكن ذلك في محاولة للحد من، أو استبدال صقل التجارب على الحيوانات.

2. إعداد التدرج Percoll

مزيج 19 مل من 1X PBS مع 1 مل 10X PBS، 1 مل و 10 مل FCS Percoll.
أداء الظريفتثير غضب الترشيح في أنبوب زجاجي (قطر المسام مرشح: 0.2 ميكرون). بعد ذلك تخزين الحل في 4 درجات مئوية.

3. إعداد متوسطة البطانة Endothelium خلية وطلاء الثقافة الخلية لوحات

البطانية المتوسطة الخلية:
1. إعداد 500 مل المتوسطة: (حوالي 20٪) مزيج 400 مل DMEM المتوسطة (حوالي 80٪) مع 100 مل PDS، 0.25 مل bFgF (20 ميكروغرام / مل، حوالي 0.05٪)، و 0.5 مل الهيبارين (100 ميكرولتر / مل؛ حوالي 0.1٪) و 0.5 مل pyrumycin (4 ملغ / مل؛ حوالي 0.1٪). إضافة pyrumycin فقط لمستنبت الخلايا المستخدمة في الأيام الأولى 2 من الثقافة.
2. أداء الترشيح العقيمة في أنبوب زجاجي (قطر المسام مرشح: 0.2 ميكرون). بعد ذلك تخزين الحل في 4 درجات مئوية.
طلاء من لوحات زراعة الخلايا:
1. ل1 مل من محلول طلاء، وإعداد محلول من 500 ميكرولتر DDH ₂ O، 400 ميكرولتر الكولاجين الرابع (0.4 ملغ / مل) و 100 ميكرولتر فبرونيكتين (0.1 ملغ / مل).
2. تغطي السطح كله من EACح بئر من لوحة زراعة الخلايا مع الحل الطلاء. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.

4. عزل الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران (MBMEC)

10 تضحية الفئران البالغة 8 (- 12 أسبوعا من العمر، C57BL / 6) من قبل خلع عنق الرحم. بعد ذلك عزل الماوس العقول وتخزينها في 5 مل من برنامج تلفزيوني (التحذير: العمل العقيم).
إزالة ينبع الدماغ، مخيخات والمهاد مع ملقط. فصل السحايا قبل المتداول بعناية العقول على ورقة النشاف العقيمة. جمع المجانية السحايا الناتجة forebrains.
نقل أدمغة إلى أنبوب 50 مل الصقر مليئة 13.5 مل من DMEM.
تخطر على الأنسجة، أولا مع ماصة 25 مل، ثم مع ماصة 10 مل حتى يصبح حليبي وسائل الإعلام.
ثم هضم الأنسجة مع مزيج من 0.6 مل كولاجيناز CLS2 (10 ملغ / مل في DMEM) و 0.2 مل الدناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على المدار هزةفي ص 180 دورة في الدقيقة.
إضافة 10 مل من DMEM أضافت إلى تعليق الأنسجة والخلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
طاف نبذ (التحذير: بيليه من السهل أن تفقد)
لإزالة النخاعين، resuspend الكرية مع ماصة 25 مل في 25 مل من BSA-DMEM (20٪ ث / ت) (حوالي 25 مرة)، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
تجاهل طبقة المايلين العليا (حليبي) مع كسر الزجاج ماصة باستور مع قطر أكبر، ومن ثم التخلص من طبقة BSA مع ماصة باستير العادية.
resuspend الكرية في 9 مل DMEM وإضافة 1 مل كولاجيناز / dispase (تركيز النهائي هو 1 ملغ / مل) و 0.1 مل الدناز. هضم الحل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري في 180 دورة في الدقيقة (تحذير: لا تستخدم ماصة ل resuspend - خلايا يمكن أن تضيع).
خلال عملية الهضم، جهاز طرد مركزي الحل Percoll لإعداد التدرج الكثافة باستخدام نابذة فائقة السرعة في 3000 x ج لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، مع التسارع، وايتوت الفرامل.
إضافة 10 مل من DMEM إلى تعليق خلية هضمها. الطرد المركزي في 1000 x ج لتعليق لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ثم تجاهل طاف و resuspend بيليه في 2 مل من DMEM.
إضافة الخلايا معلق بعناية على قمة التدرج Percoll والطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية دون التسارع والفرامل. ملاحظة: الخلايا مرئية مثل سحابة في الطور البيني.
اتخاذ تقريبا. 12 مل من الطور البيني مع الخلايا بإبرة معقمة طويلة ووضعها في جديد 50 مل الصقر مع 5 مل من DMEM.
الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد ذلك resuspend الكرية في البطانية المتوسطة الخلية (استخدام حوالي 0.2 مل من المتوسط في 1 سم ² من سطح لوحة زراعة الخلايا).
إزالة الطلاء من حل المغلفة لوحات زراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.2)، وشطف جيدا مع كل برنامج تلفزيوني العقيمة في خطوتين غسل متتالية.
الحفاظ على مزارع الخلايا البطانية فيمتوسطة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ في حاضنة معقمة. تغيير المتوسطة كل يومين أو ثلاثة أيام. انقسام الخلايا في 90٪ التقاء.

Representative Results

مباشرة بعد العزلة، BMECs الفئران وخلايا تلويث تشكيل تكتلات عائمة في مستنبت الخلية (الشكل 1A، يوم 0). العلاج مع pyrumycin يؤدي إلى مجموعة مختارة من BMECs الفئران لأنها تعبير عن مستويات عالية من الناقلين هروب رأس المال مثل P-بروتين سكري مما يؤدي إلى مقاومة نسبية للسموم. خلايا تلويث أكثر عرضة بكثير للpyrumycin السمية الخلوية بوساطة ^19. خلال عملية الاختيار pyrumicin، خلايا تلويث تدخل موت الخلايا أفكارك أو الناخر، في حين تبدأ MBMECs لنعلق على الكولاجين IV / فبرونيكتين المغلفة لوحات زراعة الخلايا (الشكل 1A، يوم 1 ويوم 2). حتى يوم 5، وMBMECs تتكاثر لكثافة تقريبا. 80-90٪. فهي تتميز نموذجي ظهور على شكل مغزل. في التقاء، وتشكيل أحادي الطبقة من الخلايا تحول دون الاتصال غير متداخلة معبأة بإحكام، تتماشى طوليا و(الشكل 1A، يوم 5). بواسطةيتم التوصل pyrumicin الاختيار، نقاء عالية تصل إلى 99٪ MBMEC كما يتبين من علامة الخلية البطانية CD31 (PECAM1، الشكل 1B). وMBMECs تشكيل الطبقات الوحيدة مغلقة بإحكام مترابطة من البروتينات مفرق ضيقة. بعد 7 - 8 أيام للثقافة، طبقات الخلايا البطانية تبنى القيم المستقرة للمقاومة الكهربائية (الوصول إلى القيم النموذجية بين 20 - 30 Ω س سم _^2). والسعة (الشكل 1C) عند هذه النقطة مرة المقايسات الفنية مثل الخلوي تجارب الهجرة ^{3، 20،21} ونفاذية الاختبارات، على سبيل المثال مع ايفانز الأزرق أو ديكستران، يجب أن يتم تنفيذ.

الشكل 1. خصائص المورفولوجية والوظيفية من الفئران BMECs. (A) بالطبع الوقت تمثيلي من BMECs مثقف ينظر إليها من قبل انتقال الضوء الصغيرscopy أكثر من 5 أيام. ينطبق شريط النطاق لجميع الصور. (B) تلطيخ المناعي للخلايا البطانية علامة CD31 CD31 في اليوم 5. (الخضراء) ودابي (الأزرق). وقد precultured (C) خلايا لمدة 5 أيام، ثم نقل إلى نظام آلي ل تحليل الخصائص الفيزيائية الحيوية (المقاومة والسعة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ضعف الدم في الدماغ من العوائق هو السمة المميزة لمختلف أمراض الجهاز العصبي المركزي الضارة، مثل انهيار من BBB في التصلب المتعدد يسهل على نطاق واسع للغزو من قبل الجهاز العصبي المركزي الخلايا المناعية autoreactive وتمكن من لقاء وتدمير الخلايا قليلة التغصن. في السكتة الدماغية اختلال BBB وتشكيل لاحق من الوذمة الدماغية من العوامل الهامة التي تؤثر على نمو احتشاء الثانوي وبقاء الكلي للمرضى ^6. وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات من BBB في المناطق النائية الآفات الدماغية اتصال قادرة على إحداث تغييرات وظيفية واسعة النطاق من الدماغ. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة إلى حد كبير ^5. في المقابل، فإن كثافة عالية وتنوع النقل هروب رأس المال في BMECs ظيفية يقلل من تركيز الأدوية النافعة مثل مبحث المعالجة الكيميائية عن الأورام الخبيثة في المخ أو المضادات الحيوية للأمراض المعدية. لذا، فهم أعمق للدماغ بار الدممطلوب رير وظيفة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض لتطوير كلاء الدوائية التي تكون قادرة على تنظيم تحديدا وظيفة الحاجز في الاتجاه المفضل ^21. يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج من BBB هي أدوات لا غنى عنها لدراسة الآليات التنظيمية على BBB.

وقد تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا البطانية خلد الدماغ ويعمل كما هو الحال في المختبر نماذج BBB ^22. هذه خطوط الخلايا توفر مزايا معينة على BMECs الابتدائية لأنها تنمو أسرع والحفاظ على الخصائص BBB معينة على مدى عدة فقرات. ومع ذلك، يمكن للخطوط الخلايا البطانية ليس بديلا كاملا للخلايا الأولية يتم تغيير الخصائص الهامة كما أن تختلط مع إمكانية نقل نتائج التجارب إلى الوضع في الجسم الحي. على سبيل المثال، خط الخلية البطانية دماغ الفئران bEnd.5 عن مستويات منخفضة فقط من البروتينات وزعت متقطع مفرق ضيقة مما يؤدي إلى ارتفاع paracنفاذية ellular ^23. BEnd.3، الفئران البطانية الدماغ خط خلية أخرى تستخدم في كثير من الأحيان، يدل على التقاطعات كثيفة ومستمرة بتوزيع ضيقة، ومقاومة transendothelial عالية، عدة ناقلات هروب رأس المال وانخفاض نفاذية paracellular. ومع ذلك، طبقات الخلايا bEND.3 مقارنة BMECs الابتدائية تفتقر إلى التمييز الحقيقي فيما يتعلق تخلل العابر للبعض وركائز paracellular ^24.

في الأعمال التحضيرية للثقافات الخلية الأولية، يمكن خلايا تلويث تتدخل بشكل كبير مع صحة النتائج التجريبية. في البروتوكول وصفها، يستخدم pyrumicin كعامل انتقائي للخلايا البطانية لتحقيق نقاوة عالية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مراقبة الجودة العادية للثقافة الخلية حتما إلى ضمان للتجارب موثوقة. هناك عدة طرق لمراقبة الجودة، إلى جانب الخصائص المورفولوجية نموذجي من الخلايا البطانية (انظر الشكل 1A)، وtransendotheliaيمكن قياس لتر المقاومة أو قد يتم تقييم التعبير عن البطانية علامة الخلية مثل CD31 (انظر الشكل 1B) أو عامل فون ويلبراند (VWF).

عدد الخلايا البطانية الدماغ معزولة عن بعضها مخ الفأر منخفض نسبيا وإنشاء ثقافة الخلية المناسبة لتجارب متعددة، العقل المدبر للعديد من الفئران يجب أن تكون مجمعة. في تجربتنا، وتحتاج على الأقل 10 الفئران لاستخدامها في تجربة واحدة التي قد تكون عاملا مقيدا اعتمادا على موارد مرفق الحيوانية منها. من أجل تجنب التحيز أو عوامل خارجية، ينبغي تجميع الفئران فقط مع خلفية وراثية وبيئية مماثلة. في المقابل، البقر والخنزير التحضيرات الخلايا البطانية الدماغ توفير عدد كبير من الخلايا البطانية الدماغ المتاحة في الدماغ واحد. ولكن، إلى جانب تربية غير معقدة، والإسكان، وذخيرة واسعة ومتزايدة من الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة يجعل الفئران الأساسي BMECs باعتباره المثل الأعلىنموذج لدراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق.

وتأتي العديد من النتائج الرئيسية التي تتعلق بوظائف BBB والآليات الجزيئية الكامنة من الدراسات في أنظمة زراعة الأنسجة 2D. مؤخرا، تم تطوير نظم الاستزراع 3D ^25، حيث توضع الخلايا البطانية داخل مصفوفة الكولاجين وتمكينهم من تشكيل التجويف والشبكات الأنبوبية. هذه الأنظمة الثقافة خلية جديدة تسمح لاستنساخ أكثر دقة من العمليات الدموية في الكائن الحي سليمة في الجسم الحي. إشراك المزيد من خلايا NVU في 3D أنظمة زراعة الخلايا، مثل الخلايا النجمية وpericytes قد تحدث ثورة في المختبر دراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق. وقد تم مؤخرا تطوير النماذج الأولى ^26.

هناك بعض التوصيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا وقبل كل عمل عقيم أمر ضروري لنوعية زراعة الخلايا البطانية. ثانيا، ينبغي أن يضاف pyrumycin فقط للخليةمستنبت المستخدمة في الأيام الأولى 2 للثقافة، قد يؤدي إلى زيادة الطلب أطول MBMEC موت الخلايا وانخفاض وظيفة الحاجز الجودة. ثالثا، الانزيمات المطبقة في هذا البروتوكول يجب أن تستخدم وتخزن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خلاف ذلك قد يثير الشبهة وظيفتها المناسبة. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل طلاء لوحات ثقافة الخلية إذا الخلايا البطانية لا نعلق. قد تتغير تركيزات فبرونيكتين والكولاجين أو قد تضاف البروتينات مصفوفة أخرى إلى حل الطلاء. أخيرا، العمر، الجنس، الموسم الشروط العام والبيئية داخل المنشأة الحيوانية من العوامل الهامة التي قد تؤثر على نوعية MBMEC العزلة والمقارنة بين التجارب. يجب التأكد من أن الظروف قابلة للمقارنة بين تجارب مستقلة.

ينبغي النظر في بروتوكول صفها بأنها طريقة neuroimmunological الأساسي لعزل BMECs الفئران. الخلايا المعزولة قد يكون شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لمجموعة واسعة من التطبيقات للحصول على مزيد من التبصر في وظيفة BBB، مثل فحوصات الهجرة والجينات ودراسات التعبير البروتين، والتقييمات الكهربية أو تجارب النفاذية. كما ذكر أعلاه، نظم زراعة الخلايا 3D من BMECs قد توفر فرصا جديدة لدراسة الآليات المعقدة التي تنطوي عليها تنظيم BBB في سياق NVU. وبالتالي، فإن عزل الخلايا البطانية الأولية تبقى تقنية لا تقدر بثمن في مجال البحث BBB في المستقبل.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) مونستر (SEED 03/12، SB)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، خلايا الحركة في والعنقودية التميز (EXC 1003 - CIM)، جامعة مونستر (SB لوSGM) وقبل عدا كرونة-فريزنيوس شتيفتونغ (2012_A88 لSB وSGM). نشكر هايكه بلوم للرسوم توضيحية ممتازة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture