Neuroscience

Выделение Первичная мышиный Brain Микрососудистой эндотелиальных клеток

Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/52204

Tobias Ruck¹, Stefan Bittner^1,2, Lisa Epping¹, Alexander M. Herrmann¹, Sven G. Meuth^1,3

¹Department of Neurology, University of Münster, ²Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, ³Institute of Physiology I — Neuropathophysiology I, University of Münster

Introduction

Мозг микрососудистых эндотелиальных клеток (BMEC) образуют монослой, которые являются неотъемлемой частью узкоспециализированных гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). BMECs соединены соединительных белков, прикрепленных к базальной мембране. Вместе с перицитов, гладкомышечных клеток, астроцитов конечных ног и циркулирующих клеток крови они образуют так называемый сосудисто-нервный блок ⁽¹⁾ NVU. На предыдущем понятия непроницаемым барьером между кровью и центральной нервной системы (ЦНС), NVU является динамичным, весьма специфичны и регулируемая интерфейс, который контролирует переход жидкостей, молекул и клеток между сосудов мозга и ЦНС ² , Дисфункция или нарушение регуляции в NVU может инициировать и / или способствовать различным нервно-сосудистых, инфекционных, воспалительных или дегенеративных заболеваний ЦНС, таких как ишемический инсульт, ВИЧ-энцефалопатии, рассеянного склероза, болезни Альцгеймера или болезнь Паркинсона ^3-6.

_content "> BMEC монослой плотно закрытыми по соединительного комплекса состоят из плотно (TJ) и слипчивых соединений (AJ) ^7. высокое электрическое сопротивление и низкий парацеллюлярная проницаемость ГЭБ, в основном, на основе TJ белков ^8. В TJs являются комплексы, образованные трансмембранных белков Claudin и occludin семьи, которые связаны с цитоскелета эндотелиальных клеток молекулами адаптера, такие как zonulaoccludens (ZO) белков ZO1-3 ^4. слипчивых соединений в основном собраны с помощью интегрального мембранного белка сосудистый эндотелиальный (VE) -cadherin, который связан с цитоскелетом через катенинов ^8.

Герметизация от BBB препятствует свободному обмену субстратов и клеток между кровью и спинномозговой жидкости. Исключения из этого правила являются липофильные, небольшие молекулы с молекулярной массой <400 Da, которые способны пересечь гематоэнцефалический барьер путем опосредованного липидами диффузии ^9. Прохождение больше, и / илигидрофильные молекулы, такие как глюкоза, аминокислоты, пептиды, белки и многих лекарств ограничено строго контролируемых систем транспортных трансцеллюлярного ^10, которые могут быть разделены на пять основных категорий: несущей-опосредованного транспорта, ионного транспорта, активного оттока транспорта, рецептор-опосредованного транспорт, и кавеолы-опосредованный транспорт ^4. Эти транспортеры системы помогают поддерживать гомеостаз ЦНС, который необходим для точного генерирования сигнала, трансдукции и интеграции. Кроме того, BMECs способны активно контролировать переход отдельных молекул с помощью экспрессии различных эктоэнзимов. Эти ферменты локализованы на клеточной поверхности и модификации определенных эндогенных и экзогенных субстратов препятствуя или позволяя переход ГЭБ ^11.

В то время как ЦНС считался иммунной неблагополучных органа в течение длительного времени, последние данные свидетельствуют о довольно динамичный и жестко регулируемое систему иммунной выжeillance ЦНС. В BMECs критически участвует в регуляции иммунного переселении клеток. К экспрессии селектинов на их поверхности лимфоцитов, селективно индуцировать свободно прикрепить к эндотелию. Секреции хемокинов, которые сталкиваются со специфическими рецепторами на лейкоцитах ведет к экспрессии или конформационных изменений лейкоцитов интегринов, таких как LFA-1 (функция лимфоцитов антиген-1) и VLA-4 (очень поздний антиген-4). Интегрины посредником твердую сцепление, связывая их эндотелиальные counterreceptors, например VCAM-я (сосудистая молекула клеточной адгезии), ICAM-I (межклеточной адгезии), позволяющие переселение в паренхиме головного мозга между или через BMECs от BBB ^12-14. Эти и другие данные подчеркивают активную роль самого эндотелия в регуляции миграции иммунных клеток.

Кроме того, BMECs как часть NVU участвуют в регуляции мозгового Li кровотокаnked местным нейронных метаболических потребностей. После стимуляции астроцитов эндотелиальные клетки продуцируют вазоактивные вещества, такие как оксид азота, ведущей к релаксации сосудистых гладкомышечных клеток ^15.

Ангиогенез и нейрогенез в развивающихся, так и в мозг взрослого шоу параллельного паттерна и развития и имеют много общих свойств регулирования ^{1, 4.} Эндотелиальные клетки критически участие в этих процессах ^{16, 17.}

Таким образом, BMECs обеспечить существенные черты, чтобы гарантировать правильное развитие и функционирование ЦНС. BBB дисфункции связано со многими серьезными неврологическими расстройствами. Тем не менее, только очень немногие цели были определены в интерфейсе мозг-сосудистой сети в течение определенного и эффективного лечения ^18. Упрощенная в моделях пробирке были использованы, чтобы понять механизмы, участвующие в функции и регулирования сложных физиологических систем для лонг раз. Выделение как описано этой рукописи и исследования в пробирке мышиного BMECs, учитывая большое разнообразие конкретных мыши с нокаутом-штаммов, может обеспечить дополнительное понимание функции BBB и регулирования в физиологических и патофизиологических условиях открывает новые терапевтические пути.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены местными властями ("LandesamtfürNatur, Umwelt унд Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz; Реклингхаузен, Германия") и проводится в соответствии с немецким законом защиты животных.

1. Общие комментарии для экспериментов мыши

Выполните все эксперименты с использованием мышей в соответствии с руководящими принципами соответствующего институционального уходу и использованию животных комитета.
Держите мышей под свободных от патогенов условиях и дать им возможность иметь доступ к пище и воде вволю.
Используйте по возрасту и полу соответствием мышей в экспериментальных группах, так как биологические свойства могут меняться в зависимости от возраста и пола.
Всякий раз, когда это возможно попытаться уменьшить, уточнить или заменить эксперименты на животных.

2. Подготовка Перколла Градиент

Смешайте 19 мл 1х PBS с 1 мл 10-кратного PBS, 1 мл FCS и 10 мл перколлом.
Выполните Steраздражать фильтрацию в стеклянную трубку (диаметр поры фильтра: 0,2 мкм). После этого раствор хранить при температуре 4 ° С.

3. Подготовка эндотелия клеточной среде и покрытие клеточной культуре Плиты

Эндотелиальных клеток среда:
1. Приготовление 500 мл среды: (прибл. 20%) Смешать 400 мл DMEM среде (прибл. 80%) с 100 мл PDS, 0,25 мл bFgF (. 20 мкг / мл; около 0,05%), 0,5 мл гепарина (100 мкл / мл;. примерно 0,1%) и 0,5 мл pyrumycin (4 мг / мл;. примерно 0,1%). Добавить pyrumycin только для клеточной культуральной среды, используемой в первые 2 суток культивирования.
2. Выполнение стерильную фильтрацию в стеклянную трубку (диаметр поры фильтра: 0,2 мкм). После этого раствор хранить при температуре 4 ° С.
Покрытие для культивирования клеток пластин:
1. Для 1 мл раствора для нанесения покрытия, приготовить раствор 500 мкл DDH ₂ O, 400 мкл коллагена IV (0,4 мг / мл) и 100 мкл фибронектин (0,1 мг / мл).
2. Накройте всю поверхность EACч хорошо в клеточной культуральной пластины с раствором для нанесения покрытия. Хранить пластину при 4 ° С в течение ночи.

4. Выделение мышиный Мозг микрососудистых эндотелиальных клеток (MBMEC)

Жертвоприношение 10 взрослых мышей (8 - 12 недель, C57BL / 6) от смещения шейных позвонков. Впоследствии изолировать мыши мозги и магазин в 5 мл PBS (предостережение:! Work стерильно).
Удалить мозг стебли, мозжечка и таламуса с пинцетом. Снять мозговые оболочки, тщательно подвижного мозги на стерильной промокательной бумаги. Соберите получившиеся мозговых оболочек свободные forebrains.
Передача мозги в 50 мл сокола трубки, заполненной 13,5 мл DMEM.
Фарш ткани, сначала с 25 мл пипетки, затем с 10 мл пипетки, пока СМИ не станет молочно.
Затем переваривать ткани со смесью 0,6 мл коллагеназы CLS2 (10 мг / мл в DMEM) и 0,2 мл ДНКазы (1 мг / мл в PBS) в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) в течение 1 ч при 37 ° С на орбитальном трястиг на 180 оборотов в минуту.
Добавить 10 мл DMEM добавляют к суспензии ткани и клетки центрифуге при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
Удалите супернатант (Предостережение: PELLET легко потерять)
Чтобы удалить миелина, ресуспендируют осадок с 25 мл пипетки в 25 мл BSA-DMEM (20% вес / об) (прибл. 25 раз) и центрифуге при 1000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
Откажитесь от верхнего слоя миелина (молочный) со сломанной стекло пипетки Пастера с большим диаметром, а затем отбросить BSA слой с нормальным пипетки Пастера.
Ресуспендируют осадок в 9 мл DMEM и добавить 1 мл коллагеназы / диспазу (конечная концентрация 1 мг / мл) и 0,1 мл ДНКазы. Дайджест решение в течение 1 часа при температуре 37 ° С на орбитальном шейкере при 180 оборотах в минуту (оговоркой: не используйте пипетку ресуспендировать - клетки могут быть потеряны).
Во время пищеварения, центрифугировать раствор Перколла, чтобы создать градиент плотности с использованием ультрацентрифуге при 3000 х г в течение 1 ч при 4 ° С, с ускорением, WIбез промежуточного тормоз.
Добавьте 10 мл DMEM с расщепленной суспензии клеток. Центрифуга суспензии при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Затем отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 2 мл среды DMEM.
Добавить ресуспендированные клетки тщательно на верхней части градиента Перколла и центрифуге при 700 х г в течение 10 мин при 4 ° С без ускорения и торможения. Примечание: Клетки видны как облака в интерфазе.
Возьмите ок. 12 мл интерфазе с клетками с длинной стерильной иглой и поместить его в новом 50 мл Сокол с 5 мл DMEM.
Центрифуга клетки снова в 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Впоследствии вновь суспендируют таблетку в эндотелиальных клеток среды (использование ок. 0,2 мл среды на 1 см ² поверхности культуры пластины клеток).
Удаление покрытия из раствора клеточной культуры с покрытием пластин (см шаг 3,2) и промыть каждую лунку со стерильным PBS в течение двух последовательных стадий промывки.
Поддержание клеточных культур в эндотелиальныхклеточной среде при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в стерильном инкубаторе. Изменение среды каждые два-три дня. Разбить ячейки на 90% слияния.

Representative Results

Сразу же после того, как изолированно, мышиные BMECs и загрязняющие клетки образуют конгломераты, плавающие в клеточной культуральной среде (Рис 1А, день 0). Лечение с pyrumycin приводит к выбору мышиных BMECs поскольку они экспрессируют высокие уровни оттока транспортеров, таких как Р-гликопротеин что приводит к относительной устойчивостью к токсинам. Загрязняющие клетки являются гораздо более восприимчивы к pyrumycin опосредованной цитотоксичности ^19. В процессе отбора pyrumicin, загрязняющие клетки вступают апоптоза или некротической смерти клеток, в то время как MBMECs начинают прикрепить к коллаген IV / фибронектина покрытием пластин для культивирования клеток (Фигура 1А, день 1 и день 2). До 5-й день, в MBMECs не пролиферируют до плотности прибл. 80 - 90%. Они характеризуются типичной веретеновидным появления. В месте слияния они образуют монослой плотно упакованных, выровнены продольно и неперекрывающихся контактных подавленного клеток (рис 1А, 5 дней). ПоВыбор pyrumicin, высокая чистота до 99% MBMEC достигается как показывает эндотелиальных клеток маркера CD31 (PECAM1; Рисунок 1б). В MBMECs образуют плотно закрытыми монослоев, соединенных между собой жесткой белков соединительных. Через 7 - 8 дней культуры, эндотелиальные клеточные слои построить стабильные значения для электрического сопротивления (достигнув типичные значения между 20 - 30 Ω х см _^2). И емкость (рис 1С) В этой временной точке функциональные тесты, такие как сотового миграционные эксперименты ^{3, 20,21} и проницаемость тесты, например, с Эвансом синего или декстрана, должны быть выполнены.

Рисунок 1. Морфологические и функциональные свойства мышиной BMECs. (А) представитель Временной ход культивируемых BMECs просмотренных передач света микроскопии более 5 дней. Масштабная линейка относится ко всем изображениям. (B) иммунофлуоресценции окрашивание на эндотелиальных клеток маркера CD31 в день 5. CD31 (зеленый) и DAPI (синий). (С) Клетки культивировали в течение 5 дней, а затем переведен в автоматизированной системе для анализ биофизических свойств (сопротивления и емкости). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Гематоэнцефалический барьер дисфункция является отличительной чертой различных вредных заболеваний ЦНС, например разбивка ГЭБ при рассеянном склерозе широко облегчает вторжение ЦНС аутореактивными иммунных клеток и позволяет столкновение и разрушение олигодендроцитах. В ишемического инсульта нарушение ГЭБ и последующее формирование отека мозга являются важными факторами, которые влияют на рост вторичного инфаркта и общую выживаемость больных ^6. Кроме того, путем изменения ГЭБ в отдаленных районах координационные ишемических поражений способны индуцировать распространенные функциональные изменения мозга. Тем не менее, лежащие в основе молекулярные механизмы в значительной степени неизвестны ^5. В отличие от этого, высокая плотность и разнообразие отток перевозчиков в функциональных BMECs снижает концентрацию полезных препаратов, таких как химиотерапевтические для злокачественных опухолей головного мозга или антибиотики для инфекционных заболеваний. Таким образом, более глубокое понимание через гематоэнцефалический-барRier функция в физиологических и патофизиологических условиях требуется разработать фармакологические препараты, которые способны специфически регулировать барьерную функцию в привилегированное направлении ^21. Расписание в моделях пробирке ГЭБ являются незаменимыми инструментами для изучения регуляторных механизмов на BBB.

Многие иммортализованные мозг эндотелия клеточные линии были созданы и работают как в пробирке моделей BBB ^22. Эти клеточные линии предлагают определенные преимущества перед первичными BMECs, как они растут быстрее и держать определенные характеристики BBB течение нескольких пассажей. Тем не менее, эндотелиальные клеточные линии не могут в полной мере заменить первичных клеток, как важные свойства изменились, что смешиваются с возможность передачи экспериментальных данных в в естественных условиях обстановки. Например, мышиные линии эндотелиальных клеток головного мозга bEnd.5 выражает лишь низкие уровни прерывисто распределенных узких соединительных белков, приводящие к высокому paracellular проницаемость ^23. BEnd.3, другой часто используемый мышиный линия мозг эндотелиальных клеток, демонстрирует плотные и непрерывные распределенных плотные соединения, высокую трансэндотелиальную сопротивление, несколько эффлюксных перевозчиков и низкую проницаемость парацеллюлярного. Тем не менее, сотовые слои bEND.3 по сравнению с первичными BMECs хватает реальной дискриминации по отношению к проникновению определенного трансцеллюлярного и парацеллюлярная подложек ^24.

В препаратах первичных клеточных культур, загрязняющие клетки могут значительно влиять на действия экспериментальных данных. В описанном протокола, pyrumicin используется в качестве селективного агента для эндотелиальных клеток, чтобы достичь высокой чистоты. Тем не менее, обычный контроль качества клеточной культуры неизбежно необходимо, чтобы гарантировать надежные для экспериментов. Есть несколько методов для контроля качества, помимо типичных морфологических свойств эндотелиальных клеток (рис 1А), в transendotheliaл сопротивление может быть измерена или выражение эндотелиальной маркера клеток, таких как CD31 (см Фигура 1В) или фактор фон Виллебранда (ФВ) может быть оценена.

Количество эндотелиальных клеток головного мозга, выделенных из мозга мыши один относительно низка и, чтобы создать надлежащий культуру клеток для нескольких экспериментов, мозги нескольких мышей должны быть объединены. По нашему опыту, по крайней мере, 10 мышей необходимо использовать в течение одного эксперимента, который может быть ограничивающим фактором в зависимости от ресурсов соответствующего объекта животного. Для того чтобы избежать предвзятости или вмешивающихся факторов, только мыши с одинаковым генетическим и экологического фона должны быть объединены. В отличие от этого, бычий и свиной препараты мозга эндотелиальных клеток обеспечивают большое количество эндотелиальными клетками головного мозга, доступных в одном мозге. Однако, помимо несложного размножения и жилья, широкой и постоянно растущей репертуар доступных трансгенных мышей оказывает первичный мышиный BMECs как идеалМодель для изучения функции гематоэнцефалического барьера-.

Несколько ключевые выводы, касающиеся функций ГЭБ и нижележащих молекулярных механизмов пришли в результате исследований в 2D системах культивирования тканей. В последнее время культивирования системы 3D были разработаны ^25, где эндотелиальные клетки помещают в коллагеновой матрице, позволяющей им формировать полость и трубчатые сетей. Эти новые системы клеточных культур позволяют еще более точным воспроизведением сосудистых процессов в здоровом организме в естественных условиях. Участие дальнейших клетках НВУ в 3D системах клеточных культур, таких как перицитов и астроцитов может произвести революцию в пробирке изучения функции гематоэнцефалического барьера; Первые модели последнее время были разработаны ^26.

Есть некоторые рекомендации по устранению неисправностей. Прежде всего стерильной работы имеет важное значение для качества культуры эндотелиальных клеток. Во-вторых, pyrumycin должны быть добавлены только для ячейкипитательная среда используется в первых 2 дней культуры, больше приложений может привести к увеличению клеточной гибели MBMEC и низкой функции качества барьера. В-третьих, ферменты, применяемые в данном протоколе должны использоваться и храниться в соответствии с инструкциями изготовителя; в противном случае их надлежащее функционирование может быть поставлена под угрозу. Кроме того, покрытие из клеточной культуры пластин может быть изменен, если эндотелиальные клетки не придают. Концентрации фибронектина и коллагена может быть изменен или другие матричные белки могут быть добавлены в раствор для нанесения покрытия. Наконец, возраст, пол, время года и экологических условий в учреждении животных являются важными факторами, которые могут повлиять на качество изоляции MBMEC и сопоставимости экспериментов. Следует убедиться, что условия сопоставимы между независимых экспериментов.

Описанный протокол следует рассматривать в качестве основного метода neuroimmunological, чтобы изолировать мышиных BMECs. Выделенные клетки могут быть UСЭД для широкого спектра приложений, чтобы получить дальнейшее понимание функции BBB, например, миграции анализов, гена и белка исследований экспрессии, электрофизиологических оценок или экспериментов проницаемости. Как упоминалось выше, 3D культуры клеток системы BMECs может предоставить новые возможности для изучения сложных механизмов, участвующих в регуляции ГЭБ в контексте NVU. Таким образом, изоляция первичных эндотелиальных клеток останется бесценным техника в области исследований BBB в будущем.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Межотраслевой Центр клинических исследований (IZKF) Мюнстер (SEED 03/12, СО), по Немецкого исследовательского общества (DFG), Клетки в движении кластера передового опыта (EXC 1003 - CIM), Университет Мюнстера (в SB и СГМ) и по Else крон-Fresenius-Stiftung (2012_A88 к SB и СГМ). Мы благодарим Хайке Блюма за прекрасные иллюстрации.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 days of culture