FIM Imaging og FIMtrack: To nye verktøy som tillater Høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv Locomotion Analysis

Summary

FIM er en roman, kostnadseffektiv bildesystem utviklet for å spore små objekter som beveger seg som C. elegans, planaria eller Drosophila larver. Den medfølgende FIMTrack Programmet er utviklet for å gi rask og effektiv dataanalyse. Sammen utgjør disse verktøyene lar high-throughput analyse av atferdsmessige trekk.

Abstract

Analysen av nevronale nettverk funksjonen krever en pålitelig måling av atferdsmessige trekk. Siden virkemåten til fritt bevegelige dyr er variabel i en viss grad, mange dyr har til å bli analysert, for å oppnå statistisk signifikante data. Dette igjen krever en datamaskin assistert automatisert kvantifisering av locomotion mønstre. For å få bilder av nesten gjennomsiktige og små objekter som beveger seg med høy kontrast, ble en ny avbildningsteknikk basert på frustrert total intern refleksjon kalt FIM utviklet. I dette oppsettet er dyr bare opplyst med infrarødt lys på helt spesifikke posisjon av kontakt med den underliggende kryp overflaten. Denne metodikken gir bilder med svært høy kontrast. Deretter er disse bilder med høy kontrast behandlet ved hjelp av etablerte kontur sporing algoritmer. Basert på dette har vi utviklet FIMTrack programvare, som tjener til å trekke ut en rekke funksjoner som trengs for å kvantitativt beskrive et stort utvalg av bevegelsekjennetegn. Under utviklingen av denne programvarepakken, fokuserte vi vår innsats på en åpen kildekode arkitektur slik at den lett tillegg av ytterligere moduler. Programmet opererer plattformuavhengig og er ledsaget av et intuitivt GUI guiding brukeren gjennom dataanalyse. Alle locomotion parameterverdier er gitt i form av csv-filer slik at ytterligere dataanalyser. I tillegg er en Resultater Viewer integrert i sporing programvare gir mulighet til å interaktivt gjennomgå og justere produksjonen, som kan være nødvendig i løpet av stimulus integrering. Kraften til FIM og FIMTrack er demonstrert ved å studere bevegelse av Drosophila larver.

Introduction

De fleste dyr har mulighet til å bevege seg i en svært sofistikerte og kontrollert måte. Å tyde den genetiske basis liggende locomotion kontroll er det obligatorisk å kvantitativt vurdere ulike atferdsmønstre. I dette henseende, kan Drosophila tjene som en ideell modell. Sporing av fritt flygende Drosophila er frist ^1-4, men gjennomsøking av Drosophila larver skjer i to dimensjoner ved relativt lav hastighet, og kan således lett overvåkes. Kamerabaserte oppsett kombinert med riktig belysning brukes til å hente bilder ^5. Både hendelsen eller overføres lys er ansatt i atferdseksperimenter ^6,7. Imidlertid, på grunn av den delvis gjennomsiktige legeme av larvene og mulige lysrefleksjoner av kryp overflaten trofast opptak av larve bevegelser kan være utfordrende. For å overvinne slike problemer, har noen kompliserte metoder blitt utviklet. Nylig ble mørkt felt belysning innført for å styrke forgrunn / bakgrunn contrast ^8. Som et alternativ til kamerabasert opptak, linse mindre optisk avbildning og bildesensoren-mindre on-chip oppkjøps teknikker har blitt introdusert ^9-11.

Flere sporing programmer har blitt introdusert nylig, inkludert kommersielt tilgjengelige programvare ¹² og tilpassede løsninger. Eksempler på high-throughput sporing programmer er Multi Worm Tracker (MWT) ¹³ og Multianimal ganglag og Track (Magat) ^8. Begge har til felles, at flere dyr kan spores i en enkelt åpen-feltet arenaen slik at kolliderende dyr føre til flere nye dyre identiteter. For å overvinne denne begrensningen, ble en fler godt oppsett introdusert skille 12 dyr i individuelle brønner ^14. Nøyaktig kvantifisering av bevegelse av enkeltpersoner kan oppnås ved hjelp av en bevegelig sporingstrinn i kombinasjon med et mikroskop ^15. Men alle disse tilnærmingene er enten kostnads ​​ineffektiv, mangel tilstrekkelig reoppløsning eller for tidkrevende for høy gjennomstrømning fenotyping.

For å overvinne de ovennevnte begrensninger, har vi utviklet FIM (FTIR Basert avbildningsmetode) basert på frustrert total indre refleksjon (FTIR) ¹⁶ (figur 1). Denne nye bilde tilnærmingen gir en enestående høy kontrast og selv tillater multi-farge opptak av krypende dyr ^16. Den underliggende prinsippet om denne hendige og effektive metoden er enkel. En akryl glass plate er oversvømmet med lys (f.eks 875 nm infrarød). På grunn av forskjellige brytningsindekser for akryl glass og luft, blir lyset helt reflekteres i glass / luft grensen. Ingen oppvarming av akrylglass er angitt ^16. Bare hvis objekter med en høyere brytningsindeks berører bordet flombelyste, kan lyse inn disse stedene. Hvis dyrene berøre overflaten, reflekteres lyset og kan fanges nedenfra (figur 1). Som følge herav kun kontaktOmrådet av dyrene vises som et lyspunkt, som tillater detaljert avbildning med en samlet sort bakgrunn. Dermed kan FIM-imaging å registrere perfekte filmer for computer vision algoritmer. Den enkle og robuste bruk av FIM bringer nå detaljert høy gjennomstrømning analyse av komplekse dyrs atferd i rekkevidde og kan brukes til å studere informasjonsbehandling: for eksempel, luktesans ^{8, 16;} visjon ¹⁷ eller thermosensation ^18.

Figur 1. FIM oppsett med varme stimulans integrering og underliggende fysiske prinsipper. (A) FIM oppsett. Belysningsintensiteten kan reguleres på frontpanelet. (B) for å levere en varme stimulus, en svart malt aluminiumplate, perfusert med varmt og kaldt vann på begge sider, er plassert 2 mm over agaroverflaten hvilkei seg selv er 2 mm tykt. Gradienten er etablert på varmestråleren platen og agar ved temperaturforskjellene (C) Den fysiske prinsipp forstyrret total innvendig refleksjon. En akrylglassplate belyses med infrarødt lys. θ _1, θ _2, og θ ₃ angir de lette refleksjonsvinkler. n _A, n _1, n ₂ og n _tre betegne brytningsindeksene for luft, akrylglass, agar og larven henholdsvis og oppfylle ulikheten n _A <n ₁ <n ₂ <n _tre. På grunn av refraksjon, endrer refleksjonsvinkel under overgangen. Hvis vinkelen er under den kritiske vinkelen, er lys ikke reflekteres lenger, kan passere gjennom lagene og kan fanges nedenfra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Spectrum av prosesser som kan bli analysert ved FIM er bred. Uten ytterligere justeringer, kan FIM bildebehandling brukes til å overvåke alle larvestadier av Drosophila (Figur 5B) eller kan brukes til å følge foten-utskrifter av voksen Drosophila ^19. Likeledes er de baner av C. elegans eller bevegelsen av planarian Flatormer kan lett registreres (figur 5C). Selv analyse av sopp hypha eller rot hårvekst vises bart ^19. I vår nåværende FIM oppsett, er 4 x 16 infrarøde lysdioder (IR- LED) integrert i en 32 x 32 cm ² akrylglass plate, kalt sporings tabellen (figur 1). Intensiteten av IR-lysdiodene justeres avhengig av vekten av de gjenstander på relativ bordet, noe som lett kan utføres av en mikrokontroller som er koblet til kretsen via pulsbreddemodulasjon (PWM). FIM gir bilder med svært høy kontrast over et bredt spekter av belysning intensiteter. Viktigst, det generates gode resultater på allerede lave generelle infrarød irridation.

Et kamera med infrarødt filter er plassert under sporings bordet, som gjør integrering av ytterligere stimuli inn i oppsettet. Varme stimuli enkelt kan brukes av en varme radiator plate og lys stimuli er brukt av en LCD-projektor. Også odoranter kan ligge i gradienter ved enkle lokk ^8. For varme gradient eksperimenter er varmeradiatorplaten perfusert med varmt og kaldt vann på begge sider henholdsvis 2 mm og plassert ovenfor larvene (figur 1B).

Generering av høy kontrast, høy kvalitet filmer åpner muligheten for avansert databasert bildeanalyse, og dermed vi implementert FIMTrack programvare for å trekke et stort sett med funksjoner fra bilder (figur 2). Første seks primære funksjoner ble definert fra konturen av dyr (figur 3A). Disse funksjonene gir grunnlinjenfor ytterligere beregning av seks sekundære funksjoner som beskriver dyrene form og sin posisjon på visse stimuli ved et gitt tidspunkt (figur 3B). For tiden er ni tertiære funksjoner beregnet som integrerer tidsmessige aspekter og derved karakterisere bevegelse av dyret sammen med den primære og sekundære funksjoner (figur 3C).

Figur 2. FIMTrack oversikt, algoritmisk arbeidsflyt og larve representasjon. (A) Hvordan bruke FIMTrack. Bildene er lastet. Grå verdi terskel og larve størrelse terskler definerer enkelt larver må innstilles. Larve området må være i [min-størrelse, maks-størrelse]. Sporing er startet av den merkede knappen. Arbeidsflyt (B) Tracking. Etter starten knappen klikkes, er bakgrunnsbildet calculated (minimal intensitet over tid). Så lenge det er rammer til venstre, blir larvene segmentert basert på det grå terskelen og min- og max-størrelse terskel. For alle segmentations larve representasjoner beregnes (sammenlignet med (C)). Hver nye modellen som er knyttet til en gitt bane om en gyldig spor er tilgjengelig. Hvis den siste rammen er nådd, er å sluttføre etterbehandling ferdig etterfulgt av utgangs generasjon. (C) Larve representasjon. Dyret består av et hode og en hale punkt (h og t). Mellom disse punktene et vilkårlig ulikt antall ryggraden poeng s _jeg kan stilles inn med en radius r _i. I tillegg er midten av masse m og hovedlegemet bøying vinkel γ beregnet. Flere bevegelsesrelaterte parametere er skissert av lilla linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Funksjoner beregnet av FIMTrack. (A) Primære funksjoner basert på konturen av dyrene. (B) Sekundære funksjoner, basert på primære funksjonene. (C) Tertiær funksjoner, basert på primære funksjonene i påfølgende rammer og flere innganger Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette figur.

Protocol

MERK: Her er bruken av FIM presenteres for hendig høy gjennomstrømning analyse av larve locomotion for screening i fritt bevegelige forhold og under påvirkning av en varme stimulans. Andre programmer som analyse av olfactory stimuli avhengige locomotion eller Resolution Imaging av rullende eller annen atferd kanskje trenger subtile endringer i protokollen, som er tilgjengelig på forespørsel høy.

1. Set-up of Experiments

1. Bruk ca. 100 larver pr genotype totalt (1 t tid som kreves) for å oppnå statistisk meningsfulle verdier. MERK: I tilfelle flere genotyper må sammenlignes og spilt inn på forskjellige dager, ta opp samme antall larver per genotype per dag.
2. For de fleste bruksområder, rekord på 10 Hz for parameter analyse. For høyoppløselige bildebehandlingsprogrammer, variere bildehastigheten om nødvendig.
3. For sporing av tredje stadium larver, utføre eksperimenter ca 120 timer etter egglegging. Gjør sure at kulturer gi nok larver i forsøksperioden (se 4.3).
4. For ikke-stimuleringsprogrammer, utarbeide en krypende overflate som inneholder gjennomskinnelig agar (se avsnitt 2). Å inneholde larver i stimulans utvalg for varme gradient søknad, surround synsfeltet med en motvilje salt agar barriere (se avsnitt 3).
   MERK: Andre applikasjoner kan kreve forskjellige overflater.
5. Sørg for å bruke et rom med konstant miljøforhold (temperatur, lys, luftstrøm, luftfuktighet osv).

2. Crawling Overflatebehandling (Translucent Agar)

MERK: I FIM setup en agar overflaten er lagt for å gi en fuktig krypende overflate. I tillegg også forbedrer den belysning egenskaper.

1. Kok 0,8% mat grade agar i avionisert ultrarent vann. For screening-programmet forberede 400 ml.
2. Hell agar ved 50 ° C (hand-hot) på en separat 33 cm x 33 cm acrylic-glassplate. Overflatespenningen av agar og således vil temperaturen definere tykkelsen av agar plate. Ved 50 ° C, blir 2 mm tykke agar plater erholdt. Ikke agitere etter koking og hell hele tiden for å unngå bobler. Forbered friske agar-plater for hver avbildning periode på ca. 4 timer.
3. Fylle standard 6 cm petriskåler med de resterende 0,8% agar-løsning for å sortere, rent og tilvenne larver før eksperimentet (1 fatet pr genotype).
4. I tilfelle en motvilje agar barrieren er nødvendig for programmet, fortsett til punkt 3.
5. Skjær av omtrent 2 cm av omkretsen av agar-plate for å oppnå en plan firkant flate for opptak. Fjern overflødig agar.
   MERK: Størrelsen er avhengig av programmet.
6. Overføre agar skive til FIM-oppsett direkte etter avkjøling ved å skyve glide agar over kanten av akrylglass plate.

3. Valgfritt: Legge til en Ubehage Agar Barrier til Crawling Surface (Salt Agar)

1. Kok 2,5% mat grade agar med 3 M NaCl i avionisert ultrarent vann. For screening i en varme gradient forberede 200 ml.
   MERK: Volumet avhenger av programmet.
2. Skjær en 2 cm bred hakk i den tidligere strømmet kryp overflaten rundt synsfelt (22 x 22 cm).
   MERK: Ulike barriere former og synsfelt kan være nødvendig, avhengig av programmet.
3. Fyll hakket med salt agar 0,1-0,3 cm høyere enn sporings overflaten.

4. Fly Håndtering

1. Bakre flyr i 25 ° C inkubator med 12 timers lys / mørke syklus justert til forsøket tid på standard fly mat på 65% luftfuktighet.
2. For kors, bedøve 30 jomfruelige kvinnelige fluer og åtte menn med CO ₂ og krysse dem i 130 ml kultur ampuller med 35 ml mat.
   MERK: En 130 ml kultur hetteglass med 35 ml mat vil gi ca 20-30 lspiste tredje instar larver innenfor avbildnings tidsrom på 4 timer. Bildebehandling og sporing fungerer for alle larvestadium etapper.
3. Slippe litt vann i kultur ampuller å kjøre sent tredje stadium larve bevegelse og samle den største larver fra ampulle vegger ved hjelp av en liten pensel.
4. 2-5 min før opptak, overføring larver for en video til en Petri-skål med 0,8% mat grade agar i avionisert ultrarent vann å tilvenne og rengjør dem.

5. Justering av FIM Imaging Setup for Recordings (ikke Stimulus betingelser)

1. Justere kameralinsen fokus og blenderåpning hvis nødvendig. Sett eksponeringstiden for det respektive kamera.
   MERK: Disse innstillingene trenger ikke å bli endret i løpet av et eksperiment.
2. Juster lysintensiteten å oppnå god kontrast av tenkelig en larve.
3. Hold miljøforholdene i rommet konstant under opptak. Mørkere i rommet for å ikke forstyrre larver med retningsbestemt lys.

6. Valgfritt: Justere FIM Imaging Setup for Recordings (Gradvis Temperatur Stimulus betingelser)

MERK: Varmen gradient enheten er en 42 x 42 x 0,2 cm ³ aluminiumsplate med en matt svart maling og isolering av materialet på toppen stedet. Platen blir perfusert med vann fra to forskjellige kretser som er koblet til kaloriferer / kjølere og pumper i begge ender (se figur 1B). Temperaturen kan reguleres -5 til 50 ° C.

1. Slå på varmen gradient enhet 1 time før forsøkene og legg den over oppsett for å tillate etablering av ønsket temperatur profil og komponenter til likevekt.
2. Overføre kryp overflaten agar med en salt barriere for oppsettet.
3. Plasser radiatorplaten over agar og justere avstanden mellom platen og kryp overflaten til 2 mm (~ 1 mm over larver).
4. Etablere en lineær gradient avminst 0,8 ° C / cm fra 34 ° C (ca. 2 cm fra barrieren i synsfeltet) til 18 ° C (ca. 2 cm fra barrieren ved den motsatte side i synsfeltet) ved å justere Temperaturen av vannkretser til -1 ° C og 45 ° C.
   MERK: Ulike graderingsegenskaper på metallplaten krever ulike temperaturer som må påvises empirisk. Disse innstillingene trenger ikke å bli endret i løpet av eksperimentene.
5. Justere innstillinger som beskrevet i kapittel 5.
6. Tillate den krypende overflate for å stabilisere seg i gradienten før eksperimenter i 20 min. Test temperaturgradienten med et pyrometer.
7. Fortsett med § 8.

7. FIM Imaging (ikke Stimulus betingelser)

1. Bruk en liten våt pensel til å forsiktig samle 15 larver fra habituering petriskåler og overføre dem til midten av sporings overflaten. Ikke overfør matrester eller for myevann (se 7.8).
2. Record 1-50 larver på en 22 cm x 22 cm sporing område. Bruk 15 dyr per video for de fleste screeningprogrammer (for statistiske grunner bruke minst 100 personer per genotype).
3. Forsiktig skille larver og vente i ca 10-20 sek før alle larvene begynte å bevege seg rett før opptak.
4. Spill larve bevegelse i 2 min ved 10 bilder per sekund for ikke stimulans forhold. Bruk ukomprimerte tif bilder som output format.
5. Under opptak samle larver for neste video fra ampuller å tilvenne dem kritisk:. Ikke forstyrr registrert larver med lys.
6. Etter innspillingen, fjern larver med en stor pensel og kast dem i samsvar med lokale sikkerhets og lovgivning regler.
7. Etter å ha fjernet larver, bruke pensel til å rense og fukte kryp overflate med ultrarent avionisert vann.
8. Kritisk: Hold overflaten fuktig hele tiden, men unngå overdreven moisture, som kan sees som nært eller dråper rundt larver i opptak og forstyrre sporing.

8. Valgfritt: FIM Imaging (Gradvis Temperatur Stimulus betingelser)

1. Etter temperaturgradienten er etablert (se punkt 6), forberede innspillingen programvare for umiddelbar opptak innen 20 sekunder etter at du plasserer larver på gjennomgangen overflaten (se 8.2) f.eks, angi antall bilder per video og definere sparing banen.
2. Løft radiator plate lett og sett larvene ved 33 ° C 2 cm fra salt barriere. Referere til 6. og 7. for ytterligere generelle instruksjoner. Senk radiator plate igjen og starte opptak for 3-4 min rett etter larver begynte å flytte rett.
3. Etter innspillingen, fjern larver direkte, ren og fukte overflaten. Ikke ta på salt agar for å unngå spredning av NaCl.
4. Kritisk: Hold overflaten fuktig hele tiden, men unngåhøy fuktighet, som kan sees som nært eller dråper rundt larver i opptak og forstyrre sporing.
5. Tillate agaroverflaten til likevekt igjen etter fuktighetsgivende for 1-2 min, mens lagring av bilder og samle nye dyr før forberedelsene til neste video. Kontrollere temperaturen gradient ved hjelp av et pyrometer hver 5 videoer og justere temperatur enhet hvis nødvendig (vanntemperatur, høyde og xy orientering i forhold til sporing overflaten).

9. Sporing av larvenes Locomotion

MERK: For mer informasjon se vedlagte manual for FIMTrack (supplement). For et program flytdiagram se Figur 2.

1. Justere sporingsparametre for de respektive eksperimenter ved hjelp av forhåndsvisning.
   1. Juster pixel per cm i henhold til kamera og synsfelt.
   2. Justere bilder per sekund basert på kamerainnstillingene.
   3. Juster lysstyrke terskler så thpå alle dyr blir korrekt registrert (tilbakemeldinger er gitt i forhåndsvisningen).
   4. Justere larve området størrelse terskler. Oppmerksom på tilbakemeldingene alternativet i forhåndsvisningen: enslige dyr er merket med gult, kolliderer larver er uthevet i rødt og arealet av hvert dyr er gitt i blått.
2. Begynne å spore ved hjelp av knappen nederst til høyre.
   MERK: Etter vellykket sporing, er et bilde med larve spor og en csv-fil som inneholder de beregnede locomotion og holdning funksjoner lagret i bildekatalogen.
3. Bruke FIM Resultater betrakteren modul (Rediger> Resultater Viewer ...) for å gjennomgå og manuelt justere sporingsresultatene. Hvis nødvendig, definere stimulans regioner for å evaluere data i forhold til stimulans regime f.eks kryp orientering i forhold til varmen gradient eller avstand til en odorant kilde. For mer detaljert beskrivelse kan du bruke den manuelle (supplement).

10. Evaluering av data

1. Importer csv fil til Excel, Matlab eller andre program for videre statistisk analyse.

Representative Results

For å avbilde flere forskjellige kameraer med ulik oppløsning egenskaper ble testet (figur 4). Alle kameraer der utstyrt med en passende IR-filter. I henhold til den lave oppløsning av den rimeligste kameraet i denne testen, er synsfeltet begrenset til 10 cm x 10 cm. De beste resultater ble oppnådd ved anvendelse av en 4 mega (MP) kamera. Dette fører til en oppløsning på 100 bildeelementer pr tredje instar larver lengde og tillatt å lett gjenkjenne interne strukturer. I tillegg kan den peristaltikk av dyret være lett ekstraheres (figur 4A). Imidlertid kan man fortsatt få høy filmer kontrast ved hjelp av rimeligere kameraer, som også kan analyseres ved FIMTrack. Ved hjelp av en 1,4 MP kamera med en dybde på 8 bit og en oppløsning på 1392 x 1040 piksler er omtrent halve prisen og tillater en oppløsning på 45 piksler per tredje stadium larve lengde i synsfeltet. Hodet, men ingen andre interne strukturer kan gjenkjennes (Figur 4B). Sporing og påvisning av peristaltikk er mulig, men nøyaktighet er redusert (Figur 4B).

Med en enda billigere 0,8 MP kamera med en romlig oppløsning sammenlignes med 1,4 MP kamera, kan larve hodet ikke bli gjenkjent trofast lenger (Figur 4C). Sporing og peristaltikk analyse er mulig, men inkludert mer jitter basert på økt støy. Overraskende, selv gir en lav oppløsning USB webcam tilstrekkelig kvalitet filmer å beregne larve baner (0,3 MP kamera, under 20 €, Figur 4D). Peristaltikk kan beregnes fra området, men målingene er svært støyende.

I vårt oppsett vi rutinemessig bruke 4 MP kamera. For screening, gjør dette kameraet overvåke et 22 cm x 22 cm arena, som åpenbart gir mulighet til å analysere et stort antall dyr samtidig slik at høy gjennomstrømning analyse er gjennomførbart. Ved hjelp av denne innstillingen, larve lengde jegs representert med 40 piksler som fortsatt tillater opptak og analyse av peristaltikk. En eksempelvis bilde av 15 larver baner i en varme gradient er vist i figur 5A. I tillegg gir bruken av en makroobjektiv til bilde larver med meget høy oppløsning, hvor mange indre organer bli synlige og hodet gjenkjennelse forbedres ytterligere (figur 5B). Videre disse kan brukes for ytterligere mer detaljert analyse av atferd av et bredt spekter ^20. Samme oppsett kan enkelt brukes til bilde kryp C. elegans ormer (figur 5C).

Figur 4. FIM bildebehandling og sporing resultater for forskjellige kameraer. (A) Venstre: FIM avbildning av tre larver krypende på en 10 cm x 10 cm tracking scene tatt med en 4 MP kamera med 10 fps. Mid:Klipping og tyngdepunkt bane av en enkelt larve. Arealet av dyret er indikert. Høyre: Areal av larven plottet over 100 rammer. Den røde pilen indikerer tidspunktet av klippet bildet. (B) Tilsvarer (A), men tatt med en 1,4 MP kamera. (C) Tilsvarer (A), men tatt med en 0,8 MP kamera. (D) Tilsvarer ( A), men tatt med en 0,3 MP kamera. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Varme stimulans, og høy oppløsning programmer. (A) Varme stimulans program (sammenlign figur 1). Baner beregnes via FIMtrack. (B) Høy oppløsning søknad bilde av en tredje, andre og første stadium larve bruker et makroobjektiv. Den tredje instar larver lengden er representert ved 400 piksler i et synsfelt på 2,5 x 2,5 cm. (C) En C. elegans ormen tatt med FIM bildebehandling. Skala barer er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I atferdsnevrovitenskap er det obligatorisk å kvantitativt tyde komplekse atferdsmessige trekk. Således må et stort antall individer observeres ved høy oppløsning og automatiserte prosedyrer er nødvendig for statistisk analyse. Her blir FIM avbildning beskrevet en ny, enkel og robust bildeoppsettet, noe som gir mulighet for å overvåke bevegelse av et bredt spekter av dyr. Effekten av FIM bildeoppsettet ble testet ved hjelp av Drosophila larver, planarian flatormer og C. elegans ormer. FIM teknologien gir iboende høy kontrast for å påvise selv interne strukturer av dyrene, slik som hjerne, luftrøret, tarmene, eller proventriculus. Viktigere er disse interne strukturer identifisert robust, slik at de kan tjene til automatisk å identifisere retningen av dyret ^19.

Kvaliteten på filmene kan bli påvirket av overdreven bruk av vann på gjennomgangen overflaten. Således, er det avgjørende åstyre fuktigheten i agar. For gammel agar eller for mye vann på overflaten kan føre gjenstander. Likeledes, sikre at ingen luftbobler er inkludert i gjennomgangen overflaten. Generelt, gjør at en godt forberedt agaroverflaten opptak av filmer i 4 timer.

På grunn av de underliggende fysiske prinsipper FIM bildebehandling genererer nesten støy gratis billedopptak, noe som resulterer i en overlegen bildekvalitet. Dette i sin tur letter etterfølgende datamaskin-basert bildeanalyse og muliggjør høy gjennomstrømning. Imidlertid er den metoden som er begrenset til å analysere dyr som har direkte kontakt med agaroverflaten. Sporingsprogramvare utfordres av dyr som danner en smultring form. Selv om en binær indikator gjenkjenner smultring form, kanskje en feil ryggrad beregnes.

På grunn av den modulære konstruksjonen av sporings tabellen dobbel og trippel farge imaging er i nå. Videre kan flere stimuli (lys, dufter, elektrisk eller mekanisk stimuli) lett bli delivered ovenfra. Den FIMTrack program utviklet for å matche kraften i FIM bildebehandling kan lett vedtatt å spore Drosophila larver, C. elegans eller planarians. Derfor og på grunn av sin enkle og billige konstruksjon (se http://FIM.uni-muenster.de), er FIM avbildning mulig for et bredt spekter av biomedisinske anvendelser, og spesielt gjør det mulig sterkt behov for store gjennomgangs studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FIM setup	Custom		details for construction or purchase of setups is available upon request
Acrylic glass plate	Custom		Additional for agar pouring
Heat radiator plate	Custom		Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting
Water calorifier/cooling pumps and hoses	Custom		based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Standard Camera (4 MP)	Basler	acA2040-25gm	Camera defaultly used for the FIM setup
Test Camera (1.4 MP)	QImaging	1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)	Camera used for comparison
Test Camera (0.8 MP)	Point Grey	Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)	Camera used for comparison
Test Camera (0.3 MP)	Sony	PS Eye USB2.0 camera	Camera used for comparison
Computer	Custom		equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB]
Standard Fly food	Custom
Standard Fly vials 135 ml	Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany	78,895
Petri dishes 9 cm	Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany	821,473
Ultrapure deionized water	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	Synergy
NaCl	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	3957.2
Food grade agar	AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany	A0917,5000
Paintbrush (small and large)	Milan	Aquarell 310 Size 0 and 2
Pyrometer	Trotec	BP20