Summary
FIM är en roman, kostnadseffektivt avbildningssystem utformat för att spåra små rörliga föremål såsom C. elegans, planaria eller Drosophila larver. Den medföljande FIMTrack Programmet är utformat för att leverera snabb och effektiv dataanalys. Tillsammans utgör dessa verktyg kan hög genomströmning analys av beteendemässiga egenskaper.
Abstract
Analysen av neuronala nätverk funktion kräver en tillförlitlig mätning av beteendemässiga egenskaper. Eftersom beteende fritt rörliga djur är variabel till en viss grad, många djur måste analyseras, för att erhålla statistiskt signifikanta data. Detta kräver i sin tur en datorstödd automatiserad kvantifiering av locomotion mönster. För att få bilder med hög kontrast på nästan genomskinliga och små rörliga föremål, var en ny bildteknik baserad på frustrerad total inre reflektion som heter FIM utvecklas. Med den här inställningen är djur endast upplyst med infrarött ljus vid mycket specifika position kontakt med den underliggande krypande ytan. Denna metod resulterar i mycket höga kontrastbilder. Därefter är dessa bilder med hög kontrast bearbetas med etablerade kontur spårning algoritmer. Utifrån detta har vi utvecklat den FIMTrack mjukvaran, som tjänar till att extrahera ett antal funktioner som behövs för att kvantitativt beskriva en stor variation av locomotionegenskaper. Under utvecklingen av denna mjukvara, vi fokuserat våra insatser på en öppen källkod-arkitektur tillåter enkel tillägg av ytterligare moduler. Programmet fungerar plattformsoberoende och åtföljs av ett intuitivt GUI vägleda användaren genom dataanalys. Alla locomotion parametervärden ges i form av CSV-filer som möjliggör ytterligare dataanalyser. Dessutom ett resultat Viewer integrerad i spårningsprogram ger möjlighet att interaktivt granska och justera utgångs, som kan behövas under stimulans integration. Kraften i FIM och FIMTrack demonstreras genom att studera rörelse i Drosophila larver.
Introduction
De flesta djur har förmåga att röra sig i en mycket sofistikerad och kontrollerat sätt. För att dechiffrera den genetiska grunden underliggande rörelsekontroll är det obligatoriskt att kvantitativt bedöma olika beteendemönster. I detta avseende kan Drosophila fungera som en idealmodell. Spårning av fritt flygande Drosophila kittlande 1-4 men krypa av Drosophila larver sker i två dimensioner vid relativt låg hastighet och kan således övervakas lätt. Kamerabaserade uppställningar i kombination med lämplig belysning används för att få bilder 5. Både tillbud eller överförd ljuset används i beteendeexperiment 6,7. Men på grund av den halvgenomskinliga kropp larver och möjliga ljusreflektioner av krypande ytan trogna inspelning av larver rörelser kan vara en utmaning. För att övervinna dessa problem, har vissa komplexa metoder tagits fram. Nyligen var mörkfältsbelysning införts för att förbättra förgrunden / bakgrund fortsRast 8. Som ett alternativ till kamerabaserat inspelning, lins mindre optisk avbildning och bildsensorn lösa on-chip förvärvs tekniker har införts 9-11.
Flera spårningsprogram har införts nyligen, inklusive kommersiellt tillgängliga program 12 och anpassade lösningar. Exempel på hög kapacitet spårningsprogram är Multi Worm Tracker (MWT) 13 och Multianimal gång och Track (Magat) 8. Båda har gemensamt, att flera djur kan spåras i ett enda frilands arenan så att kolliderande djur leder till flera nya djur identiteter. För att övervinna denna begränsning, har en multi-brunninstallations infördes separera 12 djur i enskilda brunnar 14. Exakt kvantifiering av förflyttning av enskilda individer kan uppnås genom användning av en rörlig spårningssteget i kombination med ett mikroskop 15. Men alla dessa metoder är antingen kostnads ineffektiva, brist tillräckligt relösning eller alltför tidskrävande för hög genomströmning fenotypning.
För att övervinna de ovan nämnda begränsningarna, har vi utvecklat FIM (FTIR-baserad avbildningsmetod) baserad på Frustrerad total inre reflektion (FTIR) 16 (figur 1). Denna nya avbildningsmetoden ger en oöverträffad hög kontrast och även tillåter flerfärgade inspelning av krypande djur 16. Den underliggande principen för denna behändiga och effektiv metod är lätt. En akrylglasplatta är översvämmad med ljus (t.ex. 875 nm infrarött). På grund av olika brytningsindex för akrylglas och luft, är ljuset totalreflekteras vid glas / luftgräns. Ingen uppvärmning av akrylglas noteras 16. Endast om objekt med ett högre brytningsindex röra ljusa bord, kan lysa in i dessa objekt. Om djuren röra vid ytan, är ljus som reflekteras och kan fångas underifrån (fig 1). Följaktligen endast kontaktenområde av djuren verkar som en ljuspunkt, vilket möjliggör detaljerad avbildning med en total svart bakgrund. Således låter FIM-avbildning för att spela in perfekta filmer för datorseende algoritmer. Den enkla och robusta användning av FIM ger nu detaljerad hög genomströmning analys av komplexa djurs beteende i räckvidd och kan användas för att studera informationsbehandling: t.ex. olfaction 8, 16; Visionen 17 eller thermosensation 18.
Figur 1. FIM setup med värme stimulans integration och bakomliggande fysikaliska principer. (A) Den FIM setup. Belysning intensitet kan regleras på frontpanelen. (B) För att kunna leverera en värme stimulans, en svartmålad aluminiumplåt, perfusion med varmt och kallt vatten på båda sidor, placeras 2 mm ovanför agarytan somsjälv är 2 mm tjock. Gradienten är etablerad på värmeradiatorplattan och agar av temperaturskillnader (C) Den fysikaliska principen om frustrerad total inre reflektion. En akrylglasplatta är upplyst av infrarött ljus. θ 1, θ 2, och θ 3 indikerar ljusreflektionsvinklar. n A, n 1, n 2 och n 3 betecknar brytningsindex för luft, akrylglas, agar och larven respektive och uppfyller olikheten n A <n 1 <n 2 <n 3. På grund av refraktion, ändrar reflektionsvinkeln under övergång. Om vinkeln är under den kritiska vinkeln, är ljuset inte reflekteras längre, kan passera genom lagren och kan fångas underifrån. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den spectrum av processer som kan analyseras med FIM är bred. Utan några ytterligare justeringar, kan FIM avbildning användas för att övervaka alla larvstadier Drosophila (Figur 5B) eller kan användas för att följa mul-utskrifter av vuxna Drosophila 19. Likaså, banorna för C. elegans eller förflyttning av planarian plattmaskar kan enkelt spelas in (figur 5C). Även analysen av svamp hypha eller rot hårväxt verkar genomförbart 19. I vår nuvarande FIM setup, är 4 x 16 infraröda lysdioder (IR- LED) integreras i en 32 x 32 cm 2 akrylglasplatta, som kallas spårningstabellen (Figur 1). Intensiteten för IR-lysdioder justeras beroende på vikten av föremålen på spårningstabellen, som lätt kan göras av en mikrostyrenhet som är ansluten till kretsen via pulsbreddsmodulering (PWM). FIM ger mycket höga kontrastbilder över ett brett område av belysningsintensitet. Viktigt är det allmbetar utmärkta resultat på redan låg total infraröd irridation.
En kamera med en infraröd filter placeras under spårningstabellen, vilket möjliggör integration av andra stimuli i installationen. Värme stimuli kan lätt appliceras med en värmeradiator platta och ljusstimuli tillämpas av en LCD-projektor. Också odörer kan ingå i övertoningar med enkla lock 8. För värme lutning experiment, är värmestrålare plattan perfusion med varmt och kallt vatten på båda sidor respektive och placerade 2 mm ovanför larver (Figur 1B).
Den generation av hög kontrast, högkvalitativa filmer öppnar möjligheten för sofistikerad datorbaserad bildanalys, vilket vi genomfört FIMTrack programvara för att extrahera en stor uppsättning funktioner från bilder (Figur 2). Första sex primära funktioner definierades från konturen av djuret (Figur 3A). Dessa funktioner ger baslinjenför vidare beräkning av sex sekundära egenskaper som beskriver djurens form och sin ståndpunkt vid vissa stimuli vid en given tidpunkt (figur 3B). För närvarande är nio tertiära funktioner beräknat att integrerar temporala aspekter och därmed karakterisera locomotion av djuret tillsammans med de primära och sekundära funktioner (Figur 3C).
Figur 2. FIMTrack översikt, algoritmisk arbetsflöde och larv representation. (A) Hur du använder FIMTrack. Bilderna laddas. Grå tröskelvärde och larver storlek trösklar definierar enstaka larver måste ställas in. Larver området måste vara i [min-storlek, max-size]. Spårning startas av den markerade knappen. (B) Spårning arbetsflöde. Efter startknappen klickas, är bakgrundsbilden calculated (minimala intensiteter över tid). Så länge det finns ramar kvar, är larverna segmenterad utifrån den grå tröskeln och min- och max-storlek tröskel. För alla segmentelarv representationer beräknas (jämför till (C)). Varje ny modell är associerad till en given bana om en giltig spåret är tillgänglig. Om den sista ramen har nåtts, är färdig efterbearbetning klar, följt av den utgående generationen. (C) Larv representation. Djuret består av ett huvud och en svans punkten (H och T). Mellan dessa punkter ett godtyckligt udda antal rygg poäng s jag kan ställas in med en radie ri. Dessutom är masscentrum m och huvudkroppen böjningsvinkel γ beräknas. Flera rörelserelaterade parametrar skissade av lila linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Funktioner som beräknas av FIMTrack. (A) Primära funktioner baserade på konturen av djuren. (B) Sekundära funktioner, baserat på primära funktioner. (C) Tertiary funktioner, baserat på primära funktioner i konsekutiva ramar och ytterligare ingångar Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
OBS: Här är användningen av mark som presenteras för praktisk hög genomströmning analys av larver locomotion för screening i fri-rörliga förhållanden och under påverkan av en värme stimulans. Andra tillämpningar såsom analys av lukt stimuli beroende locomotion eller hög upplösning avbildning av rullande eller andra beteenden kan behöva subtila ändringar i protokollet, som tillhandahålls på begäran.
1. Ställ upp experiment
- Använd ca 100 larver per genotyp totalt (1 tim tid som krävs) för att få statistiskt meningsfulla värden. OBS: Om du behöver flera genotyper som ska jämföras och registreras på olika dagar, spela in samma antal larver per genotyp per dag.
- För de flesta applikationer, rekord på 10 Hz för parameteranalys. För högupplösta bildprogram, varierar utskriftshastighet om det behövs.
- För spårning av tredje stadiet larver, utföra experiment cirka 120 timmar efter äggläggning. Gör sure att kulturer ger tillräckligt med larver i försöksperioden (se 4.3).
- För icke-stimulans program, förbereda en krypande yta innehåller genomskinliga agar (se avsnitt 2). Att innehålla larver i den stimulans intervallet för värme lutning ansökan, omger synfältet med en aversiv salt agar barriär (se avsnitt 3).
OBS: Andra tillämpningar kan kräva olika ytor. - Se till att använda ett rum med ständiga miljöförhållanden (temperatur, ljus, luftflöde, luftfuktigheten etc.).
2. Krypande Ytbehandling (Genomskinligt Agar)
OBSERVERA: I FIM inställnings en agaryta sätts för att ge en fuktig krypande yta. Dessutom förbättrar också den belysningsegenskaperna.
- Koka 0,8% av livsmedelskvalitet agar i avjoniserat ultrarent vatten. För screening program förbereder 400 ml.
- Häll agar vid 50 ° C (hand heta) på en separat 33 cm x 33 cm acrylic-glasplatta. Ytspänningen av agar och därmed temperaturen kommer att definiera tjockleken på agar plattan. Vid 50 ° C, är 2 mm tjocka agar plattor erhålles. Inte agitera efter kokning och häll ständigt för att undvika bubblor. Förbered färsk agar plattor för varje avbildning period av ca 4 tim.
- Fyll standard 6 cm petriskålar med resterande 0,8% agar lösning för att sortera, rengöra och vänja larver före experimentet (1 maträtt per genotyp).
- Om det behövs en aversiv agar barriär för ansökan, gå vidare till avsnitt 3.
- Trimma bort ca 2 cm av omkretsen av agar platta för att erhålla en plan kvadratisk yta för inspelning. Avlägsna överflödigt agar.
OBS: Storleken beror på tillämpningen. - Överför agar platta till FIM installationen direkt efter kylning genom att försiktigt trycka glid agar över kanten på akrylglas plattan.
3. Valfritt: Lägga ett bitter Agar Barrier till CrawLing Surface (Salt Agar)
- Koka 2,5% av livsmedelskvalitet agar med 3 M NaCl i avjoniserat ultrarent vatten. För screening i en värme gradient förbereda 200 ml.
OBS: Volymen beror på tillämpningen. - Skär en 2 cm bred skåra i tidigare hällde krypa yta som omger synfältet (22 x 22 cm).
OBS: Olika barriär former och synfält kan krävas beroende på tillämpning. - Fyll skåran med salt agar 0,1-0,3 cm högre än spårningsytan.
4. Fly Hantering
- Bakre flyger i 25 ° C inkubator med 12 timmar ljus / mörker-cykel anpassas till experimentet tid på standard fluga mat vid 65% luftfuktighet.
- För korsningar, söva 30 jungfru kvinnliga flugor och åtta hanar med CO 2 och korsa dem i 130 ml odlingsflaskor med 35 ml mat.
OBS: En 130 ml odlingsflaska med 35 ml mat kommer att ge ca 20-30 låt tredje stadiet larver inom avbildning loppet av 4 timmar. Imaging och spårning fungerar för alla larvstadier stadiet. - Släpp lite vatten i odlingsflaskor att köra sent tredje stadiet larver rörelse och samla den största larver från flask väggar med hjälp av en liten pensel.
- 2-5 min före inspelning, överföring larver för en video till en Petri-skål innehållande 0,8% livsmedelskvalitet agar i avjoniserat ultrarent vatten för att vänja och rengör dem.
5. Justera FIM Imaging Setup för inspelningar (Non Stimulus Villkor)
- Justera kameralinsen fokus och bländare om det behövs. Ställ in exponeringstiden för respektive kamera.
OBS: Dessa inställningar behöver inte ändras under ett experiment. - Justera belysningsintensitet för att få bra kontrast genom avbildning en larv.
- Håll miljöförhållanden i rummet konstant under inspelningarna. Mörklägg rummet att inte störa larver med riktat ljus.
6. Valfritt: Justering av FIM Imaging Setup för inspelningar (Gradvis Temperatur Stimulans Villkor)
OBS: Värme lutning enhet är en 42 x 42 x 0,2 cm 3 aluminiumplåt med en matt svart färg och isoleringsmaterial på översta plats. Plattan är perfusion med vatten från två olika kretsar som är anslutna till varmvattenberedare / kylare och pumpar i båda ändar (se figur 1B). Temperaturerna kan regleras från -5 till 50 ° C.
- Slå på värmen lutning anordningen 1 h före experimenten och placera den ovanför setup för att tillåta upprättandet av önskad temperaturprofil och komponenter till jämvikt.
- Överför krypande ytan agar med en salt hinder för installationen.
- Placera kylarplattan över ägarn och justera avståndet mellan plattan och den krypande ytan till 2 mm (~ 1 mm ovanför larver).
- Upprätta en linjär gradient avminst 0,8 ° C / cm från 34 ° C (ca. 2 cm från barriären i synfältet) till 18 ° C (ca. 2 cm från barriären vid den motsatta plats i synfältet) genom justering av temperatur av vattenkretsarna till 1 ° C och 45 ° C.
OBS: Olika gradient egenskaper hos metallplattan kräver olika temperaturer som måste fastställas empiriskt. Dessa inställningar behöver inte ändras under experimenten. - Justera inställningarna som beskrivs i avsnitt 5.
- Låt krypande ytan komma i jämvikt i gradienten före experiment under 20 min. Testa temperaturgradienten med en pyrometer.
- Fortsätt med avsnitt 8.
7. FIM Imaging (Non Stimulus villkor)
- Använd en liten våt pensel för att försiktigt samla 15 larver från tillvänjnings- petriskålar och överföra dem till mitten av spårningsytan. Överför inte matrester eller för mycketvatten (se 7.8).
- Record 1-50 larver på en 22 cm x 22 cm spårning området. Använd 15 djur per video för de flesta screeningtillämpningar (av statistiska skäl använda minst 100 individer per genotyp).
- Separera försiktigt larver och vänta i ca 10-20 sek tills alla larver började flytta rakt före inspelning.
- Spela larver locomotion i 2 min vid 10 bilder per sekund för icke stimulansförhållanden. Använd okomprimerade tif bilder som utdataformat.
- Under inspelningen samla larver för nästa video från flaskor att vänja dem Kritisk:. Stör ej inspelade larver med ljus.
- Efter inspelningen, ta bort larverna med en stor pensel och kasta dem i enlighet med lokala säkerhetsföreskrifter och lagstiftning regler.
- Efter avlägsnande larver, använd pensel för att rengöra och återfukta krypande ytan med ultrarent avjoniserat vatten.
- Kritisk: Håll ytan fuktig hela tiden, men undvika alltför moisture, vilket kan ses som glorior eller droppar som omger larver i inspelningar och stör spårning.
8. Tillval: FIM Imaging (Gradvis Temperatur Stimulans Villkor)
- Efter temperaturgradienten är etablerad (se avsnitt 6), förbereda inspelningsprogram för omedelbar inspelning inom 20 sekunder efter placering larverna på krypande ytan (se 8.2) t.ex. ställa in antalet bilder per video och definiera sparvägen.
- Lyft kylarplåten något och placera larver vid 33 ° C 2 cm från saltbarriären. Se 6. och 7. för ytterligare allmänna anvisningarna. Sänk kylarplåten igen och börja spela för 3-4 min direkt efter larver började röra sig rakt.
- Efter inspelningen, ta bort larverna direkt, rena och återfukta ytan. Rör inte salt agar för att undvika spridning av NaCl.
- Kritisk: Håll ytan fuktig vid alla tidpunkter men undvikamycket fukt, vilket kan ses som glorior eller droppar som omger larver i inspelningar och stör spårning.
- Låt agarytan till jämvikt igen efter återfukt i 1-2 minuter, och samtidigt spara bilder och samla nya djur innan förberedelserna för nästa video. Styr temperaturgradienten med hjälp av en pyrometer var 5 videor och justera temperaturenhet om det behövs (vattentemperatur, höjd och xy orientering i förhållande till spårningsytan).
9. Spårning av Larvernas Locomotion
OBS: För mer information hänvisas till den bifogade manualen för FIMTrack (tillägg). För ett program flödesschema se figur 2.
- Justera spårning parametrar för respektive experiment med förhandsgranskningsalternativet.
- Justera pixel per cm enligt kamera och synfält.
- Justera bilder per sekund baserat på kamerainställningarna.
- Justera ljusstyrka trösklar så thpå alla djur upptäcks korrekt (återkoppling ges i förhandsgransknings).
- Justera larver område storlekströsklar. Notera feedback alternativet i förhandsgransknings: enstaka djur är markerade i gult, kolliderande larver är markerade i rött och området varje djur finns i blått.
- Börja spåra med hjälp av knappen i nedre högra.
OBS: Efter lyckad spårning, är en bild med larvspår och en csv-fil som innehåller de beräknade locomotion och hållning funktioner lagras i bildkatalogen. - Använd FIM Resultat tittaren modul (Redigera> Resultat Viewer ...) att granska och manuellt justera spårningsresultat. Om det behövs, definiera stimulans regioner att utvärdera data i förhållande till den stimulans regimen t.ex. krypa orientering i förhållande till värme lutning eller avståndet till ett luktämne källa. För mer detaljerad beskrivning använd manual (tillägg).
10. Utvärdering av data
- Importera CSV-fil till Excel, Matlab eller något annat program för vidare statistisk analys.
Representative Results
För avbildning flera olika kameror med olika upplösning egenskaper testades (Figur 4). Alla kameror där utrustade med en lämplig IR-filter. Enligt den låga upplösningen av den billigaste kameran i detta test, är synfältet begränsat till 10 cm x 10 cm. Bästa resultat erhölls med en 4 megapixel (MP) kamera. Detta leder till en upplösning på 100 pixlar per tredje stadiet larver längd och får lätt känna igen inre strukturer. Dessutom kan peristaltiken av djuret lätt kan utvinnas (Figur 4A). Men man kan ändå få hög kontrast filmer med billigare kameror, som också kan analyseras av FIMTrack. Med hjälp av en 1,4 MP kamera med ett djup på 8 bitar och en upplösning på 1392 x 1040 bildpunkter är ungefär halva priset och möjliggör en upplösning på 45 pixlar per tredje stadiet larver längd i synfältet. Huvudet men inga andra interna strukturer kan erkännas (Figur 4B). Spårning och detektering av peristaltiken är möjligt men noggrannheten är reducerad (Figur 4B).
Med en ännu billigare 0,8 MP kamera med en rumslig upplösning jämförbar med 1,4 MP kamera, kan larver huvudet inte erkännas troget längre (Figur 4C). Spårning och peristaltiken analys är möjlig men inklusive mer jitter utifrån ökat buller. Överraskande, ger även en låg upplösning USB webbkamera tillräckliga kvalitet filmer att beräkna larv banor (0.3 MP kamera, under 20 €, Figur 4D). Den peristaltik kan beräknas från området men mätningarna är mycket bullriga.
I vår inställning vi rutinmässigt använder 4 MP kamera. För screening, tillåter denna kamera övervaka ett 22 cm x 22 cm arena, vilket naturligtvis ger möjlighet att analysera ett stort antal djur samtidigt så att hög genomströmning analys är genomförbart. Med hjälp av denna inställning, larver längd is representeras av 40 pixlar som fortfarande tillåter registrering och analys av peristaltiken. En exemplifierande bild av 15 larv banor i en värmegradient ges i figur 5A. Dessutom, användningen av en makrolins tillåter att bild larver med mycket hög upplösning där många inre organ blir synliga och huvudet erkännande förbättras ytterligare (figur 5B). Dessutom kan dessa användas för vidare mer ingående analys av beteenden av ett brett spektrum 20. Samma konfiguration kan enkelt användas för att avbilda krypa C. elegans maskar (Figur 5c).
Figur 4. FIM imaging och spårningsresultat för olika kameror. (A) Vänster: FIM avbildning av tre larver kryper på en 10 cm x 10 cm spårning skede tagits med en 4 MP kamera med 10 fps. Mid:Klippning och masscentrum banan för en enda larv. Det område av djuret indikeras. Höger: Ett område med larven ritas över 100 bildrutor. Den röda pilen visar tidpunkten för klippta bilden. (B) Motsvarar (A) men tagits med en 1,4 MP kamera. (C) Motsvarar (A) men tagits med en 0,8 MP kamera. (D) Motsvarar ( A) men tagits med en 0,3 MP kamera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Värmestimulans och högupplösta applikationer. (A) Värme stimulans ansökan (jämför figur 1). Banor beräknas via FIMtrack. (B) Högupplöst ansökan bild av en tredje, andra och första stadiet larv med en makrolins. Den tredje instar larver längd representeras av 400 pixlar i ett synfält på 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans mask tagits med FIM avbildning. Skala barer indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I beteende neurovetenskap är det obligatoriskt att kvantitativt dechiffrera komplexa beteendemönster. Således måste ett stort antal individer observeras med hög upplösning och automatiserade rutiner behövs för statistisk analys. Här är FIM avbildning beskrivs, en roman, enkel och robust bildinställningar, vilket ger möjlighet att övervaka förflyttning av ett brett spektrum av djur. Effekten av FIM avbildning installationen testades med Drosophila larver, planarian plattmaskar och C. elegans maskar. FIM teknik ger hög inneboende kontrast för att upptäcka även interna strukturer av djur, såsom hjärnan, luftstrupe, tarmen eller proventriculus. Viktigt är dessa interna strukturer robust identifieras så att de kan tjäna till att automatiskt identifiera orienteringen av djuret 19.
Kvaliteten på filmerna kan påverkas genom överdriven mängd vatten på krypande ytan. Således är det kritiskt attstyra fukten av agar. För gammal agar eller för mycket vatten på ytan kan orsaka artefakter. Likaså se till att inga luftbubblor ingår i krypande ytan. I allmänhet ger en väl förberedd agarytan filminspelning under 4 timmar.
På grund av de underliggande fysikaliska principer FIM avbildning genererar nästan brusfria bildinspelningar, vilket resulterar i en suverän bildkvalitet. Detta i sin tur underlättar efterföljande datorbaserad bildanalys och möjliggör hög genomströmning. Dock är den metod begränsas till att analysera djur som direkt kontakta agarytan. Den mjukvara utmanas av djur som utgör en munkform. Även en binär indikator erkänner munkform, kanske fel ryggrad beräknas.
På grund av den modulära konstruktionen av spårningstabellen dubbla och tredubbla färgbilder är inom räckhåll. Dessutom kan andra stimuli (ljus, doftämnen, elektriska eller mekaniska stimuli) lätt delivered ovanifrån. Den FIMTrack program för att matcha kraften i FIM avbildning kan lätt antas att spåra Drosophila larver, C. elegans eller planarians. (Se http://FIM.uni-muenster.de), är alltså och på grund av dess enkla och billig konstruktion FIM avbildning möjligt för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar, särskilt tillåter akut behov hög genomströmning studier.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna
Acknowledgments
Vi är tacksamma för S. Thomas som har initierat detta projekt, J. Hermann och U. Burgbacher om hjälp i byggandet av FIM installationen. Detta arbete har finansierats av DFG (SFB 629 B6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
| Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
| Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
| Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
| Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
| Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
| Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
| Standard Fly food | Custom | ||
| Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
| Petri dishes 9 cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
| Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
| NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
| Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
| Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
| Pyrometer | Trotec | BP20 |
References
- Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila. Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).
- Fry, S. N. The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila. Science. 300 (5618), 495-498 (2003).
- Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Klämbt, C. Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects. EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).
- Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. Object tracking: A Survey. ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).
- Pistori, H., et al. Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model. Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PloS one. 3 (5), e2208 (2008).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).
- Cui, X., et al. Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).
- Heng, X., et al. Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip. Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).
- Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion. Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).
- Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Yu, C. -C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).
- Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PloS one. 8 (7), e69653 (2013).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nature communications. 2, 441 (2011).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Risse, B., Thomas, S., Otto, N., Löpmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis. PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).
- Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C. Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images. Comput Biol Med. 14, (2014).
