Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

Published: December 26, 2014 doi: 10.3791/52220
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 1
1Physiology and Bosch Institute, University of Sydney, 2Motor Neuron Disease Research Group, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 3Advanced Microscopy Facility, Bosch Institute, University of Sydney

Abstract

الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو كبير، والتتابع الكوليني المشبك من خلالها الخلايا العصبية الحركية الثدييات تتحكم تقلص العضلات الطوعية. التغييرات الهيكلية في NMJ يمكن أن يؤدي إلى فشل العصبي، مما يؤدي إلى ضعف، وضمور وحتى الموت من الألياف العضلية. حققت العديد من الدراسات كيف تعديلات وراثية أو أمراض يمكن أن يغير هيكل NMJ الماوس. لسوء الحظ، يمكن أن يكون من الصعب مقارنة النتائج مباشرة من هذه الدراسات لأنها غالبا ما تستخدم معايير مختلفة وأساليب التحليلية. وصفت ثلاثة بروتوكولات هنا. أول يستخدم أقصى الإسقاط كثافة الصور مبائر لقياس مجال أستيل مستقبلات (الاستشاري لحقوق الإنسان) الغنية المجالات الغشاء بعد المشبكي في endplate ومنطقة متشابك حويصلة تلطيخ في المغطي الأعصاب الطرفية قبل المشبكي. بروتوكول الثاني يقارن كثافة نسبية للالمناعية للبروتينات متشابك في الغشاء بعد المشبكي. العلاقات العامة الثالثةotocol يستخدم نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) للكشف عن تغيرات في التعبئة من مركز عمان بعد المشبكي في endplate. وقد تم تطوير البروتوكولات وصقلها خلال سلسلة من الدراسات. وتناقش العوامل التي تؤثر على جودة واتساق النتائج ويتم توفير البيانات المعيارية للل NMJs في صحية الفئران الشباب البالغين.

Introduction

الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك تتابع الأهمية بمكان أن يتوسط التواصل بين الجهاز العصبي والعضلات والهيكل العظمي. هو مطلوب منها لجميع الحركات الإرادية. منذ فترة طويلة تستخدم مضان المجهر لدراسة آثار الجينات المحورة على الماوس NMJ 1-3 أو لمقارنة آثار السن، والنظام الغذائي وممارسة الرياضة والمرض على لل NMJs القوارض 4-11. لقد علمتنا هذه الدراسات لنا الكثير عن علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من NMJ، ولكن ذكرت المعلمات المتنوعة (على سبيل المثال، منطقة الاستشاري لحقوق الإنسان، منطقة endplate، وطول محيط، مؤشرات تجزئة) غالبا ما تجعل من الصعب مقارنة النتائج التي توصلت إليها هذه الدراسات. وهناك توقعات متزايدة للباحثين ما قبل السريرية لتكون قادرة على إثبات استنساخ، لا سيما في الدراسات مع نماذج القوارض من المرض 12. تم تنقيح البروتوكولات المذكورة هنا من خلال سلسلة من الدراسات التي حققت الفصل التنموي، الفسيولوجية والمرضية في جسم المريضفي نفس الفئة إلى NMJ. وتتطلب مثل هذه الدراسات قياس مجال التخصصات متشابك في endplate الماوس السيارات والكثافة النسبية من التعبئة والتغليف من البروتينات متشابك ضمن التخصصات بعد المشبكي 13-15.

وتتجلى فائدة هذه الأساليب التي كتبها الدراسات الحديثة في نموذج الفأر المضادة للالمسك الوهن العضلي الوبيل. حقن يومية من مفتش من الوهن العضلي مكافحة المسك إيجابية الوهن تسبب المرضى إلى فئران بالغة لهم أن يصبحوا ضعيفة في حدود 2 أسابيع 16. وكشفت الصور الأقصى الإسقاط مبائر من أقسام العضلات التي وصفت نقرا مزدوجا لsynaptophysin (في النهايات العصبية) ومركز عمان بعد المشبكي في الانخفاض التدريجي في مجال الاستشاري لحقوق الإنسان تلطيخ كما تغير الابتدائي. كان الأهم معدل الانخفاض كافية لشرح انخفاضات مماثلة في السعة من إمكانات متشابك، فشل انتقال متشابك وضعف العضلات 17،18. نوعيا تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة من قبل مجموعات بحثية أخرى10،19. ومنذ ذلك الحين تم استخدام طرق القياس NMJ نفسها لتقييم تأثير ثلاثة عقاقير لعلاج مضاد للالمسك الوهن العضلي الوبيل في هذا النموذج الماوس 20،21.

الشيخوخة المستقرة يمكن أن يؤدي إلى فقدان الاتصالات العصبية والعضلية. وقد كشفت البروتوكولات الموصوفة هنا تراجع المرتبط بالعمر في مجال الأعصاب الطرفية synaptophysin في endplates السيارات مع تقدم الفئران في سن الشيخوخة. كشفت الأساليب نفسها التي يمكن أن يمنع ممارسة الطوعية إلى حد كبير في الحد من العصبية قبل المشبكي منطقة محطة 22، بما يتفق مع الأعمال السابقة من قبل مجموعات أخرى 4. فقدان اتصالات العصبية والعضلية يحدث أيضا في نموذج SOD1G93A الماوس من التصلب الجانبي الضموري 9،23.

وتظهر الدراسات المذكورة أعلاه أن مجموعة متنوعة من الظروف الصحية قد يؤدي إلى تخفيضات في مجال التخصصات إما قبل أو بعد متشابك في NMJ. هذا قد يؤدي إلى متعة متشابك ضعفction أو قد تبشر خسارة كاملة للاتصال العصبي العضلي. ووصف ثلاثة بروتوكولات الكميات التي تسمح للمنطقة وكثافة التخصصات متشابك. الغرض من البروتوكول الأول هو توفير قدر عملي وقابلة للتكرار للمناطق قبل والتخصصات ما بعد متشابك واتساقها في لل NMJs الثدييات، وذلك باستخدام المجهر مضان. يستخدم ثنائي الأبعاد القصوى الصور الإسقاط متحد البؤر وتحليل الصور مع المعاهد الوطنية للصحة يماغيج للكشف عن تغيرات في مجال synaptophysin تلطيخ (الحويصلات متشابك)، مركز عمان بعد المشبكي ومنطقة تداخل متشابك. هي الأمثل المعلمات مبائر التصوير (الربح وتعويض المستوى) لكل NMJ وذلك لتحقيق أقصى قدر من المعلومات البصرية تستخدم لتمييز مجال التخصص متشابك. يمكن فشل العصبي العضلي أيضا نتيجة من التغيرات في كثافة الاستشاري لحقوق الإنسان بعد المشبكي و / أو البروتينات متشابك الأخرى. ويمكن تطبيق البروتوكول الثاني للكشف عن تغيرات في الكثافة النسبية للبروتينات بعد المشبكي هذهكما المسك، rapsyn، dystroglycan، فسفرته SRC كيناز وفسفرته الاستشاري لحقوق الإنسان 18،21.

في الوهن العضلي الوبيل، كثافة انخفاض الاستشاري لحقوق الإنسان داخل الغشاء بعد المشبكي هي السبب المباشر لفشل متشابك وضعف العضلات. ويصف البروتوكول الثالث طريقة نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لتقييم التغيرات في المناطق القريبة من مركز عمان المجاورة داخل الأغشية بعد المشبكي 14،15. هذه الطريقة بالكشف عن نقل الطاقة بين مركز عمان المجاورة المسمى مع فلوري-α-بنغاروتوكسين (BGT). الحنق يحدث فقط عندما يكون تحقيقات الفلورسنت المانحة ومتقبل أقل من 10 نانومتر إربا. هذا يمكن أن تكشف (دون المجهرية) التغيرات في ضيق من التعبئة الاستشاري لحقوق الإنسان التي قد تتصل مباشرة إلى السعة من إمكانات متشابك.

هذه البروتوكولات الثلاثة، والمكرر على مدى العقد الماضي، توفر تدابير تكميلية النزاهة NMJ بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. استخدام بروتوكولات موحدة ليجب المعلمات ND تسهيل المقارنة بين تأثيرات الجينات والتدخلات البيئية على NMJ الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: التصميم والتنفيذ والإبلاغ من التجارب على الحيوانات يجب أن تأخذ في الاعتبار المبادئ التوجيهية الحالية 24. يجب الموافقة على مثل هذا العمل مقدما من قبل السلطة الرفق بالحيوان المحلية (في حالتنا لجنة الأخلاقيات الحيوان في جامعة سيدني).

1. القتل الرحيم للحيوان وتشريح العضلات

  1. نقل الماوس من غرفة الاحتجاز إلى غرفة منفصلة حيث الموت الرحيم مع حقنة داخل الصفاق من حل بنتوباربيتون (30 ملغ / كلغ) باستخدام طريقة التعامل مع الماوس مفصل من قبل شيميزو 25. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه.
  2. وبمجرد أن توقف التنفس من الفأرة لأكثر من 1 دقيقة، واختبار رد الفعل القدم الانسحاب عن طريق معسر بلطف القدم، ومنعكس القرنية عن طريق تنظيف الأسنان بالفرشاة برفق القرنية. فقط عندما الردود رد الفعل غائبة يمكن إعداد الماوس للتشريح.
  3. استشارة أطلس التشريح القوارض مثل جاسون 26 و / أو السعي للحصول على مساعدة من بتجاربالتشريح دائرة الهندسة المدنية قبل محاولة تشريح العضلات من الفائدة. في كل حالة إزالة الشعر من الجلد المغطي باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية صغيرة قبل فتح الجلد لفضح العضلات.
    ملاحظة: إن تشريح تختلف عن كل العضلات تشريحيا-متميزة.
  4. باستخدام ملقط حادة تحرير العضلات من المغطي الأغشية والأنسجة المحيطة بها. فهم وقطع وتر البعيدة لفصل العضلات من الإدراج لها.
  5. ندف بلطف وقص عضلة خالية من الأنسجة المحيطة الحق في العودة إلى أصله. وضع لفترة وجيزة عضلة تشريح حديثا إلى 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل أو حلول رينغر قبل مزيد من المعالجة.

2. إعداد العضلات لCryosectioning

ملاحظة: الحفاظ الهيكلي الأمثل يمكن تحقيقه عن طريق نضح الحيوان كله كما هو مفصل في وقت سابق 27، أو تثبيت الغمر (للعضلات الصغيرة) كما هو موضح في الخطوة اختيارية 2.1. ومع ذلك،4٪ بارافورمالدهيد التثبيت يمكن أن يضعف تلطيخ لاحقة مع العديد من الأجسام المضادة وتحقيقات مع فلوري-BGT. غلوتارالدهيد بشكل خاص يجب تجنبها. إذا لم تكن لتكون ثابتة العضلات التي يجب على الفور المفاجئة المجمدة (المضي قدما إلى 2.3).

  1. اختياري الغمر التثبيت: دبوس العضلات لالشمع في طبق بيتري في طول يستريح. تغطية العضلات مع 2٪ ث / ت امتصاص العرق (المنحل حديثا في PBS) لمدة 2 ساعة على RT. يغسل مع 3 تغييرات PBS أكثر من 30 دقيقة (3 × 10 دقيقة) ثم استبدال برنامج تلفزيوني مع 30٪ ث / ت السكروز في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
  2. جعل قوالب ('قوارب') في وقت مبكر عن طريق للطي 2 سم × 1.5 سم قطعة من رقائق الألومنيوم كما هو مبين في الشكل (1). ضع قطعة من غشاء النيتروسليلوز في الجزء السفلي من القارب. صب بلطف ناظم البرد تضمين المصفوفة (الجدول المواد) في قارب إلى عمق 2 مم، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء. وضع العضلات في القارب، تماشيه مع خطوط القلم الكرة نقطة علىالنيتروسليلوز. إضافة المزيد من مصفوفة التضمين وذلك لتغطية تماما العضلات (الشكل 1).
  3. أنابيب البولي بروبلين قبل التسمية مع علامة لا تمحى. وضع قطرة من الماء في كل أنبوب وبردت أنبوب في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يحتفظ قطرة الماء المجمدة ضغط البخار ويمنع جفاف خلال فترات طويلة -80 ° C التخزين
  4. باستخدام درع الوجه، وقفازات واقية سميكة وزوج كبير من الملقط حادة، وانخفاض جزئيا كوب معدني صغير (3 سم القطر، 8 سم العميق) التي تحتوي على 2 سم عمق isopentane في وعاء من النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية. إزالة كوب ووضعه على رأس مقاعد البدلاء. باستخدام زوج أصغر من الملقط حادة وضع القالب الذي يحتوي على العضلات وتضمينها مصفوفة في isopentane المبردة. الحرص على تجنب خلط النيتروجين السائل مع isopentane.
  5. سماح 2 دقيقة لكتلة لتجميد تماما قبل استخدام الملقط حادة لرفع كتلة المجمدة خارج وختم ذلك في العلاقات العامة الصحيحةالمسمى الإلكترونية وأنبوب قبل المبردة (الخطوة 2.3).
  6. تخزين أنابيب مؤقتا في النيتروجين السائل قبل نقلها إلى -80 ° C. تسجيل جميع العينات في جدول المحتويات الفريزر.

3. Cryosectioning والإسفار تلطيخ للأون الوجه صور لل NMJs

  1. قشر بعيدا قالب الألومنيوم. ضمن -20 درجة مئوية غرفة ناظم البرد إرفاق كتلة المجمدة إلى تشاك ناظم البرد وذلك لخفض 20 ميكرون cryosections موازية للمحور طويل من الألياف العضلية (الشكل 1). التقاط المقاطع على بولي-L-يسين أو الجيلاتين المغلفة شرائح المجهر.
  2. ملاحظة: حذفت هذه الخطوة إذا تم إصلاح الأنسجة قبل تجميدها. بعد السماح 30 دقيقة للأقسام لتجف على الشرائح، واصلاحها عن طريق وضع قطرة من بارافورمالدهيد 2٪ في برنامج تلفزيوني على كل قسم لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. غسل الشرائح 3 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني في جرة Coplin، ومن ثم تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 M جليكاين لمدة 30 دقيقة لمنع مجموعات ألدهيد المتبقية.
  4. تغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني، ثم تزج في الميثانول (المبردة إلى -20 درجة مئوية) لمدة 7 دقائق. هذه الخطوة permeabilization هي جزءا روتينيا من وضع العلامات مزدوج مع فلوري-BGT ومكافحة synaptophysin لكنها قد تؤثر سلبا المناعية لبعض البروتينات الأخرى.
  5. غسل الشرائح 2 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني ثم وضع كل شريحة في غرفة ترطيب مستقرة وجهها. تغطية كل قسم مع 20 ميكرولتر من عرقلة الحل فورا (0.2٪ تريتون X-100، 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في PBS) لمدة 1 ساعة على RT. يجب عدم السماح للأقسام لتجف في أي مرحلة من مراحل العملية المناعية.
  6. تنفيذ الحضانة الأولية: أخذ شريحة واحدة في وقت وإزالة بعناية عرقلة الحل الزائد من أكثر من كل قسم واستبدالها مع 20 ميكرولتر من أرنب مكافحة synaptophysin (المخفف 1: 200 في عرقلة الحل).
  7. تشمل شريحة السيطرة السلبية التي سيتم المحتضنة مع عرقلة الحل فقط. هذا 'لا الأولية السيطرة الأجسام المضادة"أمر ضروري في كل شوط المناعية.
  8. مع الحرص على أن يبقى الأجسام المضادة الأولية في مكان وعلى كل قسم، إغلاق غرفة ترطيب واحتضان لمدة 1-2 أيام عند 4 درجة مئوية.
  9. تفقد كل قسم للتأكد من أن الأجسام المضادة الأولية لا تزال في مكانها. استخدام ماصة باستور لشطف بلطف كل شريحة مع برنامج تلفزيوني ووضعه في وعاء Coplin. غسل كافة الشرائح 3 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني.
  10. تنفيذ حضانة الثانوية. أخذ شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بعناية PBS الزائدة، وضعه في غرفة ترطيب وتغطية كل قسم مع 20 ميكرولتر من مزيج يحتوي على FITC مترافق مفتش حمار المضادة للأرنب وBGT مترافق إلى ميثيل رودامين أو fluorophor أحمر آخر (TRITC- / redBGT (5)؛ ز / مل) مخففة في عرقلة الحل. في احتضان RT لمدة 2 ساعة.
  11. غسل الشرائح 3 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني في الجرار Coplin.
  12. أخذ شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بعناية PBS الزائدة وجبل مع ساترة باستخدام حجم الحد الأدنى من، glyceroالقائم لتر، وتصاعد المتوسطة مقاومة تتلاشى. ختم حواف لل coverslips واضح مع طلاء الأظافر. اتركه حتى يجف الثابت.
  13. تخزين الشرائح في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، أو في -20 درجة مئوية لفترات أطول تخزين (تصل إلى عدة أشهر).

4. متحيز أخذ العينات والتصوير أون وجه موتور Endplates

  1. أعمى الشرائح التي وصفها كل شريحة مع قانون رقم العشوائية التي لا تزال معروفة فقط لباحث الثاني (لم يشارك في التحليل). ونتيجة لذلك يبقى المشغل أعمى لمجموعات العلاج حتى الكميات من المعلمات NMJ كاملة لجميع العينات.
  2. ضع الشريحة على المسرح المجهر ومشاهدته تحت إضاءة حقل واسع مع مجموعة مرشح TRITC (63X النفط 1.3 الهدف NA). الانتقال تدريجيا (حقل من الحقول) من اليسار إلى اليمين ومرة أخرى حتى تظهر endplate في الميدان (الشكل 2A).
    ملاحظة: أخذ العينات المعيار: كل هيكل الاستشاري لحقوق الإنسان الملون والذي هو نسبياشقة ويواجه الهدف (أي، ويمتد <15 م في ض البعد) يعتبر endplate وتصويرها للتحليل (أهلة الاستشاري لحقوق الإنسان تلطيخ تمثل المقاطع العرضية من خلال endplates وبالتالي مستبعد).
  3. مع مجموعة الثقب مبائر إلى 1.0 وحدة إيري وانخفاض قوة الليزر تحسين الربح وتعويض مستويات لTRITC / أحمر-BGT (532 نانومتر ليزر) في endplate التي سيتم تصويرها. الأمثل المقبل FITC / مضان synaptophysin باستخدام الليزر 488 نانومتر. جمع ض المكدس من endplate مع فاصل زمني 0.7 ميكرون بين كل شريحة البصرية. حفظ الصور مع اسم ملف يتضمن تاريخ الدورة والتصوير، والاسم الرمزي من الشريحة وعدد من endplate.
    ملاحظة: المسح الضوئي باستخدام نانومتر 488 و 532 نانومتر ليزر (FITC وTRITC) ينبغي جمع بالتسلسل (وليس في وقت واحد) لتجنب تلوث القناة FITC من قبل مضان من fluorophore الأحمر والعكس بالعكس (ينزف من خلال).
  4. تكرار أخذ العينات لالثانية تصوير الخطوات التي تم جمعها 4،2-4،3 حتى 20 endplates من الشريحة / عينة.
  5. تغيير إلى الشريحة مشفرة المقبلة وكرر 4،2-4،4. كرر ذلك لكل من الشرائح مشفرة.
  6. جمع بعض الصور من endplates من الشريحة التحكم (لا الأولية السيطرة الضد) باستخدام إعدادات متحد البؤر التي تم العثور عليها الأمثل لالشرائح التجريبية (يجب أن تظهر القناة مضان FITC غامق).
  7. في نهاية نقل جلسة متحد البؤر ملفات الصور إلى جهاز كمبيوتر آخر وعمل نسخة احتياطية من الملفات الأصلية على محرك أقراص خارجي أو الخادم.

5. قياس مساحة متشابك التخصصات في الوجه أون صور

  1. استخدام NIH يماغيج مجانية (http://imagej.nih.gov/ij/) لإعداد الأقصى الإسقاط (MIP) وصور من كل ض المكدس. حفظها كملفات شجار (الشكل 2A & B). وينبغي أن تتضمن أسماء من تاريخ الجلسة صورة، نموذج التعليمات البرمجية، عدد endplate وقناة الفلورسنت (على سبيل المثال، 060414_5723_7_FITC.tiff).
  2. فتح الصورة ض الإسقاط في يماغيج. حدد أستيل مستقبلات صورة قناة (الشكل 3A) وحدد: صورة> اكتب> 8 بت لتحويل 24 بت RGB صورة ملونة إلى ثلاثة الصور الرمادية 8 بت على الشاشة.
  3. باستخدام أداة المضلع يماغيج رسم الخطوط العريضة الخام حول endplate من الاهتمام في redBGT الملون (ACHR) القناة بحيث تشمل جميع المناطق الملون واضحة من endplate فرد معين، في حين استبعاد أي تلطيخ التي لا تنشأ من endplate الفائدة ( الشكل 3C).
  4. تطبيق عتبة كثافة الحد الأدنى للصورة عن طريق اختيار: صورة> ضبط> العتبة (الشكل 3E والصور يماغيج المرتبطة بها).
  5. ضبط مستوى عتبة وذلك لعزل أجزاء الاستشاري لحقوق الإنسان الملون مع استبعاد المحيطة إشارة الخلفية كما عتبة الفرعية (الشكل 3E). فتح الرياح الثانيآه مع النسخة الأصلية (مستمر لهجة) صورة مباشرة بجوار نافذة للمقارنة، لتسهيل قرار حول قيمة العتبة. تسجيل قيمة العتبة لاستخدامها لاحقا في colocalization يحلل.
  6. الإبقاء على مخطط المضلع حول endplate تحديد: تحليل> تحليل الجزيئات. في القائمة المنبثقة تحديد مجموعة من الأحجام على النحو التالي: 50 إلى ما لا نهاية بكسل (وهذا يزيل القطع الأثرية الصغيرة الناجمة عن الضجيج الكهربائي في مضخم).
  7. تحليل الجسيمات الأمر بإنشاء نافذة مع قائمة المناطق فوق عتبة منفصلة وقيمهم كثافة مضان مرقمة كما تظهر في الصورة الثنائية (الشكل 3G وما يرتبط بها من يماغيج الصورة). نسخ هذه البيانات في جدول بيانات المسمى.
  8. قياس المساحة الإجمالية endplate (منطقة داخل المضلع) عن طريق اختيار: تحليل> قياس. هذا ينتج منطقة endplate الإجمالية. نسخ ولصق البيانات للمناطق الاستشاري لحقوق الإنسان وشدة فيجدول بيانات مع التأكد من تسمية الأعمدة بشكل مناسب، سيتم استخدام الصفوف لendplates الفردية للشرائح محددة.
  9. التبديل إلى قناة مضان مكافحة synaptophysin وكرر الخطوات من 5،1-5،5، ولكن لقناة FITC (الشكل 3B، D و F). والهدف من ذلك هو لضبط عتبة بحيث يخلق صورة ثنائية، قدر الإمكان، يتطابق مع حدود تلطيخ كما يراها العين. تسجيل قيمة العتبة.
  10. قياس مجال التداخل من خلال تطبيق الخطوات التالية: افتح الملف الأصلي تحتوي على اثنين من الصور قناة وتقسيمه إلى صورتين منفصلتين عن طريق اختيار: صورة> الأكوام> كومة من الصور.
  11. باستخدام البرنامج المساعد Colocalization (تحميلها وتثبيتها من صفحة ويب يماغيج) حدد: Pluggin> Colocalization وإدخال القيم عتبة سجلت سابقا للقنوات الاستشاري لحقوق الإنسان والعصبية في الاستعلام قناة منهما بثور. هذا وسوف تسفر صورة التداخل في بكسل البيضاء (الشكل 3H والصور يماغيج المرتبطة بها).
  12. تحويل الصورة التداخل التي أنشئت حديثا إلى تنسيق الرمادي وتطبيق الحد الأدنى لقيمة الحد الأقصى. فإن أقصى عتبة فقط تحديد بكسل البيضاء، والمقابلة لمنطقة تداخل اثنين من القنوات السابقة. سجل في جدول بيانات القيمة الناتجة من منطقة "colocalization"، الذي يمثل منطقة التداخل في بكسل.
  13. إعداد جدول وسائل عينة البيانات، وحساب ورسم الانحرافات المعيارية والأخطاء القياسية على النحو رسوم بيانية أو scatterplots 20،22. لاحظ أن قيمة ن يمثل عادة عدد من الفئران في كل مجموعة عينة لأغراض إحصائية.
  14. مؤامرة endplate المناطق الاستشاري لحقوق الإنسان كما scatterplots أو رسوم بيانية تردد لتحديد ما إذا كان يتم توزيع البيانات عادة قبل إجراء الاختبار الإحصائي (الشكل 6).

6. تلطيخ النسبيشدة مقارنة باستخدام المقاطع البصرية عرضية

ملاحظة: للحصول على هذه العملية بروتوكول جميع العينات العضلات معا وصورة في جلسة متحد البؤر واحدة. في التخطيط لتجربة السماح تصل الى 30 دقيقة وقت التصوير في عينة العضلات.

  1. قطع 15 ميكرون cryosections عرضية إلى المحور الطويل للألياف العضلات وجمع على الشرائح كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  2. تنفيذ مضان تلطيخ كما هو موضح في الخطوات 3،2-3،13.
  3. كود الشرائح ملطخة حتى يتم تنفيذ ذلك التصوير والتحليلات مع المكفوفين مشغل لمجموعة العلاج، كما هو موضح في الخطوة 4.1.
  4. باستخدام الهدف مضان 40X (NA 0.75) مسح لفترة وجيزة على قسم من كل شريحة لتحديد مكسب واحد وتعويض إعداد مستوى لالاستشاري لحقوق الإنسان من شأنها أن تكون مناسبة لجميع endplates عبر كافة الشرائح العينة. ألمع endplate ثم ينبغي أن يكون أقل بقليل من 256 اللون الرمادي على نطاق واسع. وينبغي أن يتم هذا التحسين بشكل منفصل لfluorescenc الثانيةالخدمات الإلكترونية (التي تم جمعها على التوالي). تسجيل مكاسب الثابتة وتعويض إعدادات مستوى وليس تغييرها طوال الدورة التصوير.
  5. جمع الصور من شريحة القياسية مضان (على سبيل المثال، وعدم التبييض الخرز الفلورسنت)، وذلك باستخدام نفس المعلمات، في بداية ونهاية الدورة مبائر للكشف عن أي تقلب محتمل في كثافة الليزر.
  6. استخدام قناة الاستشاري لحقوق الإنسان لمسح الشريحة تدريجيا لتحديد موقع endplates.
  7. التركيز للعثور على الطائرة قسم البصرية واحدة في كل حقل المجهر الذي يحتوي على أكبر عدد من endplates الاستشاري لحقوق الإنسان الملون.
  8. مسح هذا القسم بصري واحد مرتين، وحفظ الصورة المتوسط ​​(الشكل 4G).
  9. الحفاظ على نفس الطائرة التبديل البؤري لقناة مضان الثانية (بروتين من الفائدة) وجمع الصورة كما في الخطوة 6.8. حفظ ملف الصورة، بما في ذلك في اسم الملف: تاريخ جلسة التصوير، ونموذج التعليمات البرمجية، رقم الصورة ورمزا للدلالة على قناة الفلورسنت. F يظهر أمثلة على توزيع endplate من الاستشاري لحقوق الإنسان مقارنة rapsyn والمسك أو -dystroglycan (-DG).
  10. نقل مرحلة إلى الحقل التالي الذي يحتوي على واحد أو أكثر endplates وكرر الخطوة 6،8-6،9. كرر هذا حتى يتم تصوير ما مجموعه 60 endplates.
  11. في نهاية نقل دورة التصوير جميع الملفات على جهاز كمبيوتر آخر وعمل نسخ احتياطية منهم.
  12. فتح كل ملف الصورة الأصلية وأثناء عرض القناة الاستشاري لحقوق الإنسان، اختر: صورة> الأكوام> كومة من الصور، لتقسيم القنوات.
  13. اختر: صورة> نوع> من 8bit لتحويل إلى تنسيق الرمادي 8 بت على الشاشة. هل هذا لكلا القنوات مضان.
  14. اختر: صورة> الأكوام> الصور إلى المكدس. فتح كومة جديدة من اثنين من فصل سابقا صور 8-بت. يمكن للمرء ثم التبديل بسهولة بين القنوات مضان اثنين ضمن إطار واحد.
  15. استخدام أداة المضلع لرسم لينالبريد بإحكام حول حدود تلطيخ الاستشاري لحقوق الإنسان (الشكل 4I).
  16. اختر: تحليل> قياس لقياس متوسط ​​كثافة بيكسل للالاستشاري لحقوق الإنسان داخل المنطقة المغلقة (لاحظ أهمية رسم خط بإحكام). نسخ هذه القيمة في جدول المسمى.
  17. الإبقاء على نفس الخطوط العريضة المضلع (لتحديد المنطقة المراد قياسها)، والتحول إلى القناة الثانية الفلورسنت (على سبيل المثال، الشكل 4B، D، F) وحدد: تحليل> التدبير. هذا وسوف تسفر عن متوسط ​​كثافة تلطيخ للبروتين من الفائدة داخل منطقة متشابك حددها الاستشاري لحقوق الإنسان تلطيخ.
  18. اختيار المنطقة بعيدا عن مرئية endplate تلطيخ ثم حدد: تحليل> قياس لقياس متوسط ​​كثافة مضان الخلفية. كرر هذا للآخرين قناة مضان / ث ونسخ القيم الأساسية في جدول البيانات من القيم مضان.
  19. الفرعيةالمسالك القيم الأساسية متوسط ​​من القيم endplate للحصول على كثافة تصحيح لالاستشاري لحقوق الإنسان والبروتين من الفائدة في كل endplate.
  20. تقسيم endplate قيم الكثافة تصحيح للبروتين من الفائدة من شدة BGT مضان تصحيح لانتاج نسب كثافة مضان 14،21

7. وبمقارنة الكثافة بعد المشبكي غشاء الاستشاري لحقوق الإنسان عن طريق الحنق

ملاحظة: هذا البروتوكول يقيم مدى معبأة بشكل وثيق مركز عمان (<10 نانومتر تباعد) في الغشاء بعد المشبكي. مزيج المانحة وfluorophore متقبل الدقيق أمر بالغ الأهمية لهذا الحنق الفحص. يتم إعطاء أسماء وتفاصيل عن fluorophores في الجدول المواد. الخصائص الطيفية، وفيما يتعلق الحنق، وتناقش في منطقتنا الأوراق السابقة 14،15.

  1. إعداد cryosections عرضية ثابت كما هو موضح في القسم 6.1. يجب أن تتم معالجة جميع الفئات عينة معا وصورةد في نفس الجلسة مبائر.
  2. مزيج دقيق 2.5 غرام / مل الأحمر BGT (الحنق المانحة) مع 10 غرام / مل بعيدا الحمراء BGT (الحنق متقبل) مع عرقلة الحل في أنبوب صغير من البلاستيك قبل pipetting صعودا وهبوطا 12 مرة. هذا 1: خليط الضرس 4 يزيد من كفاءة الحنق 14.
  3. وضع كل شريحة في غرفة ترطيب، وتغطي بعناية كل قسم مع انخفاض (12 ميكرولتر) من الخليط المذكور أعلاه واحتضان لمدة 1.5 ساعة على RT.
  4. أقسام التحكم: تغطي أعداد صغيرة من المقاطع مع 2.5 غرام / مل الأحمر BGT (المانحة فقط؛ الضوابط C1 المسمى)، وأيضا بعض المقاطع مع 10 غرام / مل النطاق الأحمر BGT (متقبل فقط؛ الضوابط C2 المسمى). احتضان هذه الضوابط كما في الخطوة 7.3.
  5. غسل الشرائح 3 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني وجبل في القائم على الجلسرين، وتصاعد المتوسطة (راجع الخطوة 3.12) مقاومة تتلاشى.
  6. أداء عينات من endplates كما في الخطوة 6.7. وينبغي أن يكون مضان من الجهة المانحة ومتقبل تماما شارك المترجمة في endplates بسبب الربط العشوائي للجزيئات فلوري-BGT.
  7. الصور التحكم: عن طريق الهدف 40X وانخفاض الليزر الأمثل قوة مكاسب redBGT وتعويض إعدادات مستوى لendplates من C1 السيطرة الشريحة. تحسين بعيدة redBGT الربح وتعويض مستويات لendplates من C2 السيطرة الشريحة. تأكيد غياب أي مضان تنزف من خلال.
  8. دون تغيير قوة الليزر، واكتساب أو إعدادات على مستوى تعويض انتقال إلى الشرائح التجريبية وجمع الصور (قبل photobleach) لكل القنوات مضان.
  9. photobleach انتقائي الحمراء بعيدة BGT على جزء من endplate واحدة عن طريق التكبير في منطقة المسح الضوئي ثم مسح 10 مرات مع ليزر 633 نانومتر في السلطة 100٪. وينبغي أن تصبح مضان في المنطقة الممسوحة ضوئيا قاتمة.
  10. إعادة تعيين قوة الليزر والتكبير وجمع الصور بعد التبييض على كل القنوات الفلورسنت باستخدام الإعدادات مبائر التي أنشئت في 7.7.
  11. حساب الكفاءة الحنق (E) من نسبة الزيادة في المانحة (الأحمر-BGT) مضان بعد photobleach من متقبل (النطاق الأحمر-BGT) وفقا للمعادلة التالية *:
    المعادلة 1
    * وبالنسبة لجميع الحالات التي يكون فيها مضان من الجهات المانحة يزيد بعد photobleaching من المتقبلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قياس المساحة متشابك في NMJ

يعتمد أي تقدير للمنطقة على رسم حدود لتحديد مدى التخصصات متشابك. في عضلات صحية الشباب البالغين يجب عرض الصور NMJ حدود واضحة المعالم لكلا الاستشاري لحقوق الإنسان وتلطيخ synaptophysin (الشكل 2A وباء). كثافة مضان لكلا الاستشاري لحقوق الإنسان وsynaptophysin ترتفع بشكل حاد على الحدود بين الجزء شبه متشابك ومتشابك من endplate السيارات (الشكل 5A 'وباء'). لمثل هذه الصور عتبة دنيا (فقط فوق مضان الخلفية extrasynaptic) سوف عزل بسهولة المجال الاستشاري لحقوق الإنسان الغنية أو synaptophysin الغني للendplate (الخطوط المتقطعة الأفقي في (الشكل 5A 'وباء')). في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين وتلطيخ في بعض الحالات المرضية endplate لالاستشاري لحقوق الإنسان قد يكون أقل كثافة، قد تظهر الاستشاري لحقوق الإنسان حواف العنقودية غير واضحة وإعادة قد تكون مستويات أعلى من تألق ذاتي extrasynaptic (الشكل 5D، 17،22). مضان تلطيخ مع حدود غير واضحة يمكن إدخال خطأ في تقديرات منطقة متشابك. في جميع الحالات فإن الهدف هو اختيار عتبة يمكن أن ينتج صورة ثنائية مماثلة في الشكل والحجم لAChR- أو المناطق synaptophysin غنية كما تظهر للعين في الاصل، صورة مستمرة لهجة. يجب إجراء تحليل أعمى لمجموعة العلاج يقلل من خطر التحيز ذاتي في خطوة العتبة (الخطوة 4.1). في بعض الأحيان يمكن أن الصور endplate باهتة أو عدم وضوح ينتج من معالجة دون المستوى الأمثل. ويبين الشكل 2C وD مثال على صورة ذات جودة منخفضة endplate من ماوس صحي العمر 2 شهر. حواف واضحة وخافت synaptophysin تلطيخ قد نشأت في هذه الحالة من الذوبان الجزئي وإعادة تجميد للعضلات قبل cryosectioning. يجب مقطوع بعض المقاطع من الشباب الصحية (مراقبة إيجابية) في العضلات لالثانية معالجتها بشكل متواز مع العينات التجريبية للتأكد من أن أي انخفاض واضح في الصور NMJ ليس بسبب مشاكل مع المناعية. ينبغي استبعادها دفعات من الصور للخطر عن طريق تجهيز دون المستوى الأمثل من التحليلات.

لEN وجه ض المكدس صور، 15-20 endplates هو حجم العينة معقول لتقدير المناطق متشابك. وعثر على تنوع واسع في الأشكال والأحجام من لل NMJs داخل أي عضلة معينة. Scatterplots تكشف عن وجود مجموعة كبيرة في المنطقة الغنية الاستشاري لحقوق الإنسان بين endplates من عضلة الظنبوبي الأمامي من أي فأر الفردية (الشكل 6A). ومع ذلك، كانت المنطقة الاستشاري لحقوق الإنسان متوسط ​​(استنادا إلى 15-20 أون صور وجه endplate) مماثلة بين سبعة فئران العينة (~ 200 م 2، الشكل 6A). مجال endplate synaptophysin تلطيخ تختلف أيضا إلى حد كبير بين endplates من عضلة معينة. ومرة أخرى، وذلك باستخدام حجم عينة من 15-20 endplates كانت المنطقة متوسط ​​endplate synaptophysin سيميلار بين الفئران 7 درس (~ 170M 2، الشكل 6B). رسوم بيانية تواتر البيانات المجمعة كشفت التوزيع الطبيعي تقريبا لمنطقة الاستشاري لحقوق الإنسان endplate وsynaptophysin (الشكل 6A 'وباء'). ومع ذلك التوزيع الطبيعي للمناطق متشابك لا يمكن افتراض في الحالات المرضية مثل الوهن العضلي الوبيل 16،20. وهذا قد يؤثر على اختيار الاختبار الإحصائي.

I يسرد الجدول مجالات التخصصات ما قبل وما بعد متشابك للل NMJs لصحي 2 شهر من العمر (الشباب البالغين) من الإناث C57BL / 6J الفئران من الدراسات السابقة. انخفضت مجالات التخصصات سواء قبل وبعد متشابك مع المستقرة الشيخوخة 22. كما تم تخفيض مساحة الاستشاري لحقوق الإنسان بشكل ملحوظ في الفئران المحقونة مع مفتش من مكافحة المسك الوهن العضلي الوبيل المرضى 17،21. الفئران الوهن العضلي تعامل مع الكولين المانع المخدرات، والبيريدوستيغمين، عرض خفض كبير آخر في منطقة endplate الاستشاري لحقوق الإنسان 20 </ سوب>.

الكثافة النسبية للEndplate الإسفار وصفها

كثافة النسبية لوضع العلامات المناعي يمكن أن تكشف التغيرات في كثافة البروتين في المصالح متشابك مع التقدم في السن، النمط الجيني و / أو دولة المرض. يستخدم الاستشاري لحقوق الإنسان مضان (أحمر-BGT أو الحمراء بعيدة BGT) أولا لتحديد موقع NMJ. ثم يتم استخدام سطوع مضان ضمن 8 بت منطقة الاستشاري لحقوق الإنسان الغنية لتقييم التغيرات في تركيز البروتين من الفائدة، نسبة إلى السيطرة على الحيوانات. في المقاطع العرضية تظهر مركز عمان endplate عادة ما شكل الهلال، ولكن هذا الشكل غالبا ما تكون غير منتظمة الشكل (4A، C، E، H). كثافة منخفضة مضان الخلفية عادة ما تكشف ما إذا كان التصحيح من تلطيخ الاستشاري لحقوق الإنسان يمثل endplate واحدة، أو اثنتين endplates منفصلة تقع على ألياف العضلات المجاورة. العديد من البروتينات متشابك (مثل rapsyn والمسك وSRC) هيcolocalized مع الاستشاري لحقوق الإنسان في endplate (الشكل 4A - D). ويمكن أيضا المناعي تلطيخ مع الأجسام المضادة الفوسفات محددة يمكن استخدامها لمقارنة تأثير التدخلات التجريبية عن حالة الفسفرة معينة بروتينات الغشاء بعد المشبكي 21.

الموثوقية واستنساخ قياس كثافة مضان تعتمد اعتمادا كبيرا على سلامة العضلات المجمدة ونوعية المناعية. يجب تشريح العضلات والمفاجئة مجمدة فورا أو (في غضون دقائق من وفاة الحيوان) الثابتة امتصاص العرق لتجنب التغيرات التنكسية إلى NMJ. المناعية يعتمد إلى حد كبير على نوعية من الكواشف وتحقيق الاستفادة المثلى من بروتوكول تلطيخ عن الأجسام المضادة المحددة. للحصول على أي دفعة جديدة من الأجسام المضادة الأولية التجارب المناعية الطيار المطلوبة. يتم تحضين cryosections قطع طازجة من عضلات الشباب صحية مع مسلسل التخفيفات 2-أضعاف من الأجسام المضادة الأولية. Aيستخدم يعرف الضد الثانوية موثوق بها وتتم مقارنة النتائج. إذا كان من المعروف البروتين التي تهم يقتصر على NMJ ثم أفضل تركيز الأجسام المضادة هي التي تعطي أعلى نسبة من NMJ كثافة مضان النسبية لتلك الموجودة في أجزاء extrasynaptic من العضلات (مضان الخلفية). يجب أن لا تتجاوز Extrasynaptic (ويفترض غير محددة) كثافة مضان عادة 15٪ من كثافة endplate مضان. وبالمثل يجب أن تظهر "أي سيطرة الأجسام المضادة الأولية" أقسام (المحتضنة فقط مع الأجسام المضادة الثانوية) الظلام، مؤكدا أن الأجسام المضادة الثانوية لا يلزم غير وجه التحديد. يجب مقارنة نوعية دفعات مختلفة من (بولكلونل) الأجسام المضادة الثانوية يمكن أن تختلف دفعات الأجسام المضادة الثانوية بشكل ملحوظ البديلة حتى قبل إنشاء بروتوكول قياسي. الاختبار المثالي لخصوصية المناعي ينطوي على المقارنة المباشرة لمقاطع من البرية من نوع الفئران وأقسام الرقابة السلبية من الفئران رقبعة تفتقر إلى (خروج المغلوب الجينات) البروتين في المصالح. المراجع التالية تصف الكميات من endplate تلطيخ مضان لالمسك، rapsyn، dystroglycan، SRC والاستشاري لحقوق الإنسان 13،14،18،21.

أحجام عينة صغيرة إدخال خطأ في تقديرات كثافة مضان النسبية. endplates الفردية تختلف إلى حد كبير في كثافة مضان. يفترض هذا التباين بين endplates داخل العضلات نظرا يعكس تنوع هيكل وفرصة الخلافات NMJ في قسم البصرية العينة. ومع ذلك، زيادة عدد endplates عينات النتائج في تقدير أكثر استقرارا من متوسط ​​كثافة مضان (الشكل 7). لتقدير متوسط ​​endplate كثافة مضان يجب المتوسط ​​40-60 endplates من كل عينة العضلات.

الاستشاري لحقوق الإنسان-الاستشاري لحقوق الإنسان الحنق

كل الاستشاري لحقوق الإنسان هو مخموس مع موقعين ملزمة لBGT (الموجود على كل واحد ألفا فرعية). تجليدأحمر BGT وبعيدة والاحمر وBGT لهذين الموقعين أن تسفر عن الفصل المانحين متقبل من حوالي 9nm 28-30. وبالتالي انخفاض الكفاءة الحنق يمكن الكشف عنها حتى قبل التجمع مركز عمان في مجموعات 14. ومع ذلك، فإن كفاءة الحنق في endplates الفئران تضاعف تقريبا بعد الولادة، بما يتفق مع إدراج أكثر كفاءة من مركز عمان الى معبأة بإحكام بعد المشبكي شعرية غشاء 14. استخدام أحمر BGT والحمراء بعيدة BGT كما المتبرع الحنق ومتقبل (على التوالي)، وendplates من الفئران من العمر 1-2 الشهر أنتجت متوسط ​​الكفاءة الحنق تتراوح 20-37٪ (الجدول 2). ويعتقد الكفاءات الحنق من 20٪ أو أكثر لتمثيل التعبئة ضيق من مركز عمان 14. تم تخفيض كفاءة Endplate الحنق قليلا بعد إزالة التعصيب 14، وانخفاض ملحوظ بعد تم حقن الفئران مع مفتش من الوهن العضلي مكافحة المسك إيجابية الوبيل المرضى 18. هذه هي الظروف التي تكتظ مركز عمان الفردي أقل بإحكام في postsyسقالة غشاء naptic من قبل النظام المسك / rapsyn بعد المشبكي 31.

الشكل (1)
الشكل 1. التضمين وتجميد العضلات لcryosectioning (1-5) إعداد قوالب ('قوارب') قبل تجميد مجموعة من العضلات: (1) يتم قطع رقائق الألومنيوم إلى مستطيلات (2.0 X 3.0 سم) و (2). مطوية مثل المتهمين إلى إنشاء قالب / قارب (3). (4) يتم قطع مستطيلات من النيتروسليلوز رقة immunoblotting لتناسب في القالب ويتم استخدام الكرة نقطة القلم لحكم خطوط لويوجه العضلات. (5) يتم وضع المستطيل النيتروسليلوز في القالب. (6-8) تضمين وتجميد العضلات: يسكب (6) ناظم البرد تضمين السائل مصفوفة بلطف في القالب (على رأس النيتروسليلوز) على عمق 2 مم. وتستخدم (7) ملقط غرامة على خفض العضلات، عن طريق وتر لها في مصفوفة التضمين، في محاذاة مع nitrocelluتفقد الأحكام، (8) يسكب التضمين إضافية مصفوفة بلطف في القالب لتغطية العضلات، مع الحرص على تجنب خلق فقاعات. عضلة جزءا لا يتجزأ من وثم المفاجئة المجمدة، وأغلقت في الأنابيب وتخزينها في -80 ° C كما هو موضح في النص. (9-12) التحضير لcryosectioning: (9) وتستخدم الملقط الجميلة لقشر بعيدا العفن الألومنيوم ثم يتم وضع كتلة المجمدة في -20 ° C الغرفة ناظم البرد، وتستخدم (10) وعلامات في النيتروسليلوز لمحاذاة وبالتوازي مع العضلات لمواجهة ظرف (11) لباجتزاء الطولي (12). ويستخدم قطرة-تضمين البرد السائل المتوسطة إرفاق كتلة إلى تشاك المبردة. وتستخدم الملقط حادة للتلاعب في كتلة العضلات المجمدة. للحصول على المقاطع العرضية، كتلة هي التي شنت بدلا من ذلك بحيث العضلات هو عمودي على سطح تشاك (لا يظهر).

الشكل 2
Figure 2. أون صور وجه لل NMJs من العضلات الظنبوبي الأمامي من 2 الشهر القديمة الفئران C57Bl6J الإناث. وكانت العضلات جديدة مبكرة المجمدة وأقسام ثابتة على الشريحة كما هو موضح في الخطوة 3.2. وقد تم الحصول على أقصى قدر من الصور الإسقاط كثافة ض مداخن كما هو موضح في البروتوكول الأول. (A) الأحمر BGT تلطيخ يكشف عن endplate السيارات واحدة تتألف من مجموعتين من المزاريب خلف الوصل الأولية الاستشاري لحقوق الإنسان الغنية (أون عرض الوجه). (ب) Synaptophysin تلطيخ مع الضد الثانوية FITC مترافق يكشف الأعصاب الطرفية قبل المشبكي، واحتلال المزاريب متشابك الأولية. جزء من محور عصبي قبل محطة مرئيا أيضا في الجزء العلوي من لوحة. (C & D) مثال على سوء جودة الصورة NMJ من الماوس صحي الشباب. تلطيخ ضعيف وحدود التخصصات ما قبل وما بعد متشابك غير واضحة. ويعزى ذلك إلى النقص في تيكان تجهيز الأنسجة و / أو عدم كفاية الوقت يسمح للحضانة الأجسام المضادة الأولية. شريط النطاق في لوحة D يمثل 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. خطوات في تجهيز أون الوجه الصور NMJ (كما هو موضح في البروتوكول 1). (A & B) إظهار النسخة الأصلية مستمرة الصور هجة MIP مضان أحمر بغت يكشف الاستشاري لحقوق الإنسان والمناعي الأخضر لsynaptophysin على التوالي. (C) الاستشاري لحقوق الإنسان تلطيخ بعد التحويل إلى 8 بت صورة مقياس الرمادية واستخدام أداة المضلع لرسم endplate (الخط الأصفر رقيقة). (D) Endplate خط الحدود ترحيلها إلى الصورة synaptophysin الخضراء. (E) تطبيق ورقةication من الحد الأدنى أمر عتبة كثافة لخلق صورة الثنائية التي يعزل suprathreshold الأحمر BGT (الاستشاري لحقوق الإنسان) مضان. يتم عرض سلسلة من يماغيج لقطات واجهة المستخدم إلى اليسار من الصور. (F) ثنائي صورة synaptophysin بعد تطبيق عتبة منفصلة. (G) تحديد suprathreshold منفصلة المجالات الاستشاري لحقوق الإنسان الغنية داخل endplate من خلال تطبيق تحليل القيادة الجسيمات إلى الصورة الحمراء BGT الثنائية. ويماغيج المقابلة (من اليسار من لوحة (G) يدل على إدخال البيانات المطلوبة. يجب إدخال الحد الأدنى لحجم المناطق بكسل suprathreshold المطلوبة. (H) تحديد مناطق التداخل من synaptophysin ثنائي والصور الاستشاري لحقوق الإنسان. ويمثل التداخل من قبل بكسل البيضاء . يماغيج لقطات واجهة المستخدم (دون لوحة H) تبين الخطوات للوصول إلى صورة التداخل الثنائية، والقيم الدنيا اختيار عتبة كثافة لكل مضان جhannel يجب إدخالها ضمن نافذة "Colocalization". يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. أمثلة من المقاطع البصرية عرضية يستخدم لمقارنة شدة الفلورسنت النسبية (بروتوكول 2). وكانت العضلات المفاجئة المجمدة والأبواب الثابتة على الشريحة كما هو موضح في الخطوة 3.2. (A & B) A endplate واحدة المسمى مزدوجة مع بعيدا -أحمر-BGT (الاستشاري لحقوق الإنسان، هو موضح هنا في pseudocolor الأزرق) وFITC-مكافحة rapsyn يوضح شارك في توطين هذه البروتينات التفاعل اثنين في الغشاء بعد المشبكي (C & D) اثنين endplates على ألياف العضلات المجاورة العرض المشارك المترجمة AC. ساعة والمسك. (E & F) وهو endplate المسمى نقرا مزدوجا لالاستشاري لحقوق الإنسان و-dystroglycan (-DG). و-DG يمتد الحق حول محيط ألياف العضلات ولكن غير المخصب في endplate (شريط النطاق في F، لوحات AF: 25 ميكرون) (G - I) عزل لendplate لقياس كثافة (G) حقل المجهر نموذجي،. يحتوي على ثلاثة endplates الحمراء بعيدة BGT الملون (شريط النطاق في لوحة G: 40 ميكرون (H) صورة مكبرة من endplate محاصر (I) تحويل نفس endplate إلى صورة تدرج الرمادي 8 بت ويرسم باستخدام المضلع. . أداة يماغيج (الخط الأصفر رقيقة) يتم قياس متوسط ​​كثافة مضان ضمن هذا الخط الحدودي. (شريط مقياس H & I: 10 ميكرون) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ontent "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 5
الرقم 5. تأثير جودة الصورة في تقييم منطقة متشابك. (A & B) ذات جودة عالية أون الصور مواجهة NMJ صحي من ماوس العمر 2 الشهر عرضها على الأحمر BGT وقنوات مضان مكافحة synaptophysin. (A '& B ') شدة الإسفار لمحات الموافق الخط الذي رسمته عبر endplate لA و B على التوالي. أحمر متقطع خط أفقي يشير الحد الأدنى من العتبة المستخدمة لإنشاء الصورة الثنائية. (C & D) Endplate من الماوس المسنين. Endplate synaptophysin تلطيخ عموما أقل كثافة. (C '& D') تظهر ملامح كثافة على مستوى عال من extrasynaptic (خط الأساس) مضان التذبذب في synaptophysin (FITC) قناة (الى الوراءالأرض) الذي يؤثر على تحديد عتبة مناسبة. الكثير من هذا هو واسع الطيف الأنسجة تألق ذاتي. الحانات النطاق تمثل 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. تباين المناطق متشابك بين لل NMJs داخل العضلات وبين الفئران. (A) Scatterplots تظهر إجمالي المساحة الاستشاري لحقوق الإنسان الغنية من endplates من العضلات الظنبوبي الأمامي من سبعة ساذجة 2 الشهر القديمة الإناث C57BL / 6J الفئران التي حصل عليها المؤلف NT. يمثل كل رمز وendplate. ويمثل كل شريط يعني ± SD لendplates عينات من الماوس واحد. (B) Scatterplots يظهر في منطقة synaptophysin الغنية لنفس endplates. (A ') (B ') التوزيع التكراري لمنطقة synaptophysin غنية من endplates (البيانات المجمعة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
واستخدمت الرقم 7. تأثير حجم العينة بناء على تقديرات كثافة endplate مضان. المقاطع البصرية عرضية لقياس كثافة مضان (في وحدات التعسفي) في 40 60 endplates من العضلات الظنبوبي الأمامي على فأرة الحاسوب صحي العمر 2 شهر. يتم رسم المتوسطات التراكمية مقابل عدد endplates المدرجة في المتوسط. (A) Endplate الأحمر BGT كثافة مضان حصلت بالمؤلف AV. (ب) مكافحة synaptophysiن كثافة المناعي لنفس endplates كما هو الحال في لوحة A. (C) Endplate النطاق الأحمر BGT كثافة مضان تم الحصول عليها من عينة العضلات الثانية بالمؤلف NG. (D) لمكافحة rapsyn كثافة المناعي من نفس endplates كما هو الحال في لوحة C.

دراسة عضلة عدد من الفئران منطقة الاستشاري لحقوق الإنسان منطقة Synaptophysin منطقة التداخل
يعني ± SD (μm2) يعني ± SD (μm2) يعني ± SD (μm2)
Morsch وآخرون (2012) 1 الساق 3 181 ± 7 163 ± 24
غشاء 3 130 ± 41 102 ± 21 76 ± 26
Morsch وآخرون (2013) 1 الظنبوبي الأمامي 3 166 ± 26 117 ± 21 الثانية
تشنغ وآخرون (2013) 2 الظنبوبي الأمامي 4 226 ± 18 150 ± 44 110 ± 34
تسي (غير منشورة) 2 الظنبوبي الأمامي 7 213 ± 27 157 ± 23 111 ± 11
1 تصويرها على المجهر ميتا زايس LSM 510 ولكن مع زيادة ثابت وتعويض المستويات. قياسات العتبة والمناطق متشابك استخدمت Metamorph سوفتواريالبريد من قبل MM.
2 تصويرها على المجهر لايكا DM IRE2 وتحليلها التالية البروتوكول الحالي من قبل المؤلف الأول المشار إليها، أعمى لمجموعة العلاج.
الثانية لم يحدد.

الجدول 1. المناطق متشابك للل NMJs من 2 الشهر القديمة أنثى C57BL / 6J الفئران (الاصحاء)

دراسة عضلة الحنق الكفاءة (٪) * مجموعة (٪)
(يعني ± SEM)
Brockhausen وآخرون (2008) الظنبوبي الأمامي 24 ± 1 غ
كول وآخرون. 2010 الظنبوبي الأمامي 26 ± 1 22 - 30
Morsch (غير منشورة) غشاء 37 ± 1 24-47
غضنفري (غير منشورة) الظنبوبي الأمامي 30 ± 1 20 - 45
* الحنق بين الأحمر BGT وبعيدة الأحمر BGT (دائرة نصف قطرها فورستر للالحنق الزوج = 51A (لايف تكنولوجيز).
البيانات غير متوفر غير متوفرة

الجدول 2. الكفاءة لالاستشاري لحقوق الإنسان الحنق من الفئران الشابة الفئران البالغة C57Bl6J

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد مكنت البروتوكولات الموصوفة هنا لنا لقياس بشكل موثوق وقياس التغيرات في خصائص NMJ عبر مجموعة من الشروط، بما في ذلك الشيخوخة والمرض الدول العادية. الطرق الموضحة للأون تواجه والصور NMJ تسمح للباحثين لمقارنة مجال التخصصات قبل وبعد المشبكي ومنطقة متشابك التداخل / المحاذاة. لمقارنة الكثافة النسبية للبروتينات قبل وبعد المشبكي البروتوكول الثاني، والذي يستخدم المقاطع البصرية عرضية، ويفضل. بروتوكول ثالث اختبارات على وجه التحديد لإجراء تغييرات في القرب من التعبئة والتغليف من مركز عمان في الغشاء بعد المشبكي.

ضوابط خصوصية حيوية في المناعي المجهري. عند استخدام أي الأجسام المضادة الأولية لالمناعي غير المباشر من الضروري أولا التأكد من أنه يربط على وجه التحديد إلى البروتين المستهدف في الأقسام العضلات. يمكن معالجة أنواع مختلفة من الأنسجة والتثبيت يغير تفاضلي خصوصيةالأجسام المضادة. من المهم للتأكد من أن تلطيخ المناعي (لقول rapsyn) حقا يتركز مع الاستشاري لحقوق الإنسان في endplate السيارات. ويجب أيضا أن تفقد أقسام سيطرة سلبية للتأكد من أن الأجسام المضادة ملزم هو محدد. على سبيل المثال، فإن أفضل السيطرة السلبية لrapsyn المناعي يكون مقاطع من rapsyn - / - الفئران. وينبغي لهذه لا تظهر أي تلطيخ endplate مع anti-rapsyn. مضان غير محددة يمكن أن تنشأ أيضا من المواد الكيميائية الفلورية المحلية في الأنسجة (تألق ذاتي) أو من غير محددة وملزمة من قبل الفلورسنت المكورات الضد الثانوية. وغالبا ما تفاقم هذا مضان من قبل ألدهيد التثبيت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن في بعض الأحيان يتم الكشف عن TRITC-BGT تلطيخ endplates في القناة مضان FITC ويمكن الخلط بين هذه الفلورسنت تنزف من خلال مع FITC المناعي محدد. لحراسة ضد ثلاثة أشكال الأخيرة من مضان غير محددة، يجب على كل دفعة من الشرائح التي هي ملطخة تشمل بعض 'ن"أقسام مراقبة الأجسام المضادة س الأساسي (الخطوات 3.7 و 4.6). يجب مقارنة صور endplates من هذه الأقسام التحكم لتلك من الشرائح التجريبية للتأكد من أن تلطيخ مناعي غير المباشر لل NMJs يعكس حقا الربط من الأجسام المضادة الأولية.

عرضية أقسام مبائر مفيدة بشكل خاص لتقييم الاختلافات في شدة النسبية المناعية في المشبك. في أقسام متحد البؤر عرضية أنه من الأسهل أن نحكم الدقيق شارك في توطين البروتينات متشابك. الملف الشخصى endplate على شكل هلال يمثل مجرد عينة قطع من خلال NMJ في السؤال. ومع ذلك، فإن الخلفية (extrasynaptic) مضان عموما أقل مقارنة أون الوجه الصور ض الإسقاط. وهكذا، يمكن أن يكون أسهل للتمييز "الحقيقية" (محدد) المناعية وإقامة مكاسب متحد البؤر ثابت وتعويض القيم باستخدام المقاطع البصرية عرضية 13-15،18. على سبيل المثال، في نموذج الفأر من الوهن العضلي الوبيل (وهرويرسم يتم تقليل البريد endplate الاستشاري لحقوق الإنسان تلطيخ بشكل ملحوظ) endplates بشكل واضح في المقاطع البصرية عرضية 18،21. ومن المرجح أن تعكس كثافة غيرت من البروتين المستهدفة ضمن التخصص متشابك الاختلافات في متوسط ​​كثافة مضان في NMJ. والتحذير هو أنه، في بعض الحالات، تغير هيكلي في البروتين المستهدف أو انسداد الأجسام المضادة ملزمة من البروتينات المجاورة قد يفسر كثافة تلطيخ تغييرها.

تصميم التجارب يتطلب بعض النظر. في كثير من الحالات التجربة وتهدف لاختبار تأثير التحوير، ضربة قاضية الجينات أو دولة المرض على حجم NMJ. قد ثم تتم مقارنة مجموعة العينة التجريبية لصحي الشباب (البرية من نوع) الفئران من نفس الجنس والخلفية الوراثية. يتم إعطاء القيم الأساسية للمنطقة من synaptophysin endplate، الاستشاري لحقوق الإنسان والتداخل متشابك لعدة عضلات في الجدول 1. سوف حجم العينة يعتمد على درجة من الحيوان-to والحيوان التباين داخل مجموعات العلاج وحجم التأثير (الاختلاف في الوسائل لالتجريبي مقابل المجموعات الضابطة في الانحراف المعياري). عندما يقتصر التحليل إلى صور ذات نوعية جيدة عثر على درجة معقولة من الاتساق في العينة تعني للمناطق endplate بين 2 شهر الصحية القديمة الفئران C57Bl6J الإناث (6A الشكل وباء). وبالتالي، كان من الممكن أن تثبت تخفيضات كبيرة 30-40٪ في منطقة متشابك في الفئران المحقونة مع مفتش من الوهن العضلي مكافحة المسك إيجابية الوبيل المرضى، مقارنة مع الضوابط مع حجم عينة من ثلاثة الفئران 17،20،32. الفئران المسنة عرض أكبر الاختلاف الحيوان إلى الحيوان في المعلمات endplate من الشباب الفئران 22. وبناء على ذلك التجارب على الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين قد تتطلب أحجام عينة أكبر.

إذا كان الشاغل الرئيسي هو قياس حجم EN وجه endplate ثم كسب وإعدادات مستوى تعويض ينبغي أن يكون الأمثل لكل فرد NMJ. الكلاسيكي فردييمكن لل NMJs idual تختلف إلى حد كبير في سطوع الاستشاري لحقوق الإنسان وsynaptophysin تلطيخ، وخاصة عندما يتم فحص الحالات المرضية. وعلاوة على ذلك شدة خارج متشابك (غير محدد) مضان غالبا ما تكون أعلى وأكثر تنوعا في عضلات الحيوانات الشيخوخة، بالمقارنة مع تلك الحيوانات الصغيرة صحية (الشكل 5C وD). يجب أن تستغل من 1-256 مقياس الرمادية بشكل كامل وذلك لتحقيق أقصى قدر من المعلومات نغمي التي سيتم الاحتفاظ بها في الصور النهائية. وسينطوي هذا على ضبط الربح وتعويض مستويات لكل NMJ التي ض المكدس ليتم جمعها. ويبين الشكل 5D مثال لصورة NMJ حيث يمكن أن تكون المعلومات نغمي حاسما في تحديد حدود منطقة من قبل وبعد التخصصات متشابك.

قياسات المناطق متشابك يمكن تطبيقها على استعدادات مختلفة من العضلات والتجارب. وقد استخدمت معظم قياساتنا من المناطق متشابك cryosections طولية من الخاطف عضلات المجمدة. تجميد العضلات قبل تثبيت يحافظ على استضداد من مجموعة واسعة من البروتينات. عندما تتوافق مع مستضد، تثبيت بارافورمالدهيد والتسلل السكروز قبل cryosectioning (الخطوة 2.1) يمكن أن توفر الحفاظ بشكل أفضل على هيكل NMJ. يمكن الحصول على الحفاظ الهيكلي الأمثل من قبل التروية القلبية مع امتصاص العرق. التحف من تجميد وباجتزاء يمكن تجنبها تماما من قبل endplates وضع العلامات على سطح العضلات والتصوير لل NMJs سليمة على كراسات مازحت من العضلات ثابتة 21. بغض النظر عن الإعداد، لا تزال إجراءات أخذ العينات والتصوير والكميات المنطقة دون تغيير (بروتوكول الخطوات 4-5). التطبيق المتسق بروتوكولات أخذ العينات، والتصوير والتحليل العمياء (باستخدام مختلف العاملين، وعينات مختلفة من الفئران وأوقات مختلفة)، يمكن أن يؤدي إلى متوسط ​​قيم استنساخه إلى حد ما (قارن تشنغ وآخرون. وتسي النتائج في الجدول 1).

"> وقد وصفت Endplates أن يصبح" مجزأة "في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية. على سبيل المثال، في شيخوخة العضلات الماوس، انحطاط متفرقة من الألياف العضلية (تليها تجدده) أدى إلى إعادة تشكيل مثل المملح endplate الاستشاري لحقوق الإنسان لوحة ل تشكيل مجموعات أصغر متعددة الاستشاري لحقوق الإنسان (6). وفي الفئران المحقونة مع مفتش من مكافحة المسك الوهن العضلي الوبيل المرضى، وكان تفتيت endplate مختلفة نوعا ما. وendplate الاستشاري لحقوق الإنسان المملح فرقت إلى حد كبير، مخلفين وراءهم كوكبة من الصغير (<4 م 2) microaggregates الاستشاري لحقوق الإنسان " "20،21. هذه الأمثلة اثنين تبرز الحاجة لمقارنة حجم التوزيعات لمجموعات الاستشاري لحقوق الإنسان في endplates السيطرة مقابل 21 حيوانات التجارب.

وقد تم الإبلاغ عن وسائل أخرى لتقييم منطقة متشابك أو تلطيخ كثافة في NMJ. يمكن في بعض الأحيان endplates موتور تكون مطوية بحيث الأبعاد صورتين ض الإسقاط المستخدمة هنا قد نقلل اصطناعيالمناطق aptic. قد توفر عمليات إعادة البناء مبائر ثلاثي الأبعاد تدابير أكثر دقة إذا يجب تحديد منطقة متشابك المطلقة 33. والميزة الرئيسية لبروتوكول ض الإسقاط وصفها هنا، ومع ذلك، هو بساطته النسبية، والذي يسمح أعداد كبيرة من endplates المراد قياسها من مجموعات العلاج متعددة وتحديد موثوق للتغيرات المحتملة. بروتوكول لمقارنة شدة تلطيخ endplate يمكن تكييفها لدراسة التغيرات في مستويات العديد من البروتينات متشابك مختلفة. طريقة محدودة، ومع ذلك، شرط أن تتم معالجة جميع العينات لالمناعي ثم تصويرها خلال نفس الجلسة مبائر. دراسة حديثة أجرتها يامبولسكي وآخرون. 5 وصفت طريقة لقياس كثافة endplate الاستشاري لحقوق الإنسان التي قد تساعد في التغلب على هذا القيد. في هذه الدراسة، تم تصوير نفس مجالات endplates في العديد من إعدادات الطاقة ليزر مختلفة. المنحدر للعلاقة بين قوة الليزر وrhodamiوقد استخدم NE-BGT كثافة مضان لتقييم التغيرات النسبية في كثافة الاستشاري لحقوق الإنسان في endplates في الفئران مختلفة 5. هذه الطريقة قد تكون مفيدة لمقارنة كثافة الاستشاري لحقوق الإنسان في عينات تصويرها في أوقات مختلفة على مدار دراسة طويلة.

يوفر الاستشاري لحقوق الإنسان-الاستشاري لحقوق الإنسان الحنق معلومات محددة ومتكاملة حول تنظيم مركز عمان endplate. الإلكترون المجهري تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام 125. -α-I BGT أظهر مركز عمان لتكون معبأة بإحكام مع كثافة مستو من 10 4 م -2 فورا تحت كل موقع قبل المشبكي الإفراج الارسال، في حين المجاورة infoldings الغشاء يحتوي على كثافة أقل بكثير من الاستشاري لحقوق الإنسان (34). الاستشاري لحقوق الإنسان-الاستشاري لحقوق الإنسان الحنق يجعل من السهل نسبيا للكشف عن (شبه مجهرية) التغيرات في التعبئة الاستشاري لحقوق الإنسان. انخفاض في كفاءة الحنق يعكس إعادة توزيع الفرعية المجهري للمركز عمان في الغشاء بعد المشبكي التي قد لا يتم الكشف عن تغيير في متوسط ​​كثافة BGT مضان. متعددة وقد يسبب الجهات الفاعلة تغيير في كفاءة الحنق. وتشمل هذه المباعدة بين المانحين متقبل والتوجهات النسبية، وكذلك البيئة الجزيئي 35،36. قد تنشأ انخفاض في كفاءة endplate الحنق ربما من تغيير في هندسة شعرية الاستشاري لحقوق الإنسان. ومع ذلك، وعلى الأرجح أنه سيكون يرجع ذلك إلى انخفاض في النسبة المئوية للمركز عمان التي كانت معبأة داخل النانو على نطاق وشعرية الجزيئية بعد المشبكي 14.

يبدو فقدان الاتصال بين الخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية لتكون السبب المباشر لضعف العضلات في مرض العصبون الحركي والشيخوخة المستقرة 9،22،23. يجب أن الأساليب والمعايير المشتركة لقياس لل NMJs تجعل من السهل على مجموعات بحثية مختلفة لمقارنة ونتائج النقيض المنشورة. تقاسم بروتوكولات مفصلة (والتحسينات المستقبلية عليها) قد يساعد في تسريع التقدم في فهم آليات صيانة NMJ وكيف يمكن أن تتأثر في الحالات المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).

Tags

علم الأعصاب، العدد 94، العصبية والعضلية، endplate السيارات، والتحكم في المحركات، sarcopenia، الوهن العضلي الوبيل، مرض التصلب الجانبي الضموري، قياس الأشكال، متحد البؤر، المناعي
على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., … More

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter