Isolare cellule staminali intestinali da adulti Drosophila Midguts di FACS per Studiare Stem Cell Comportamento durante l'invecchiamento

Sommario

Comprendere i cambiamenti molecolari endogeni nelle cellule staminali adulte durante l'invecchiamento richiede l'isolamento delle cellule di interesse. Il metodo qui descritto presenta un approccio semplice e robusto per arricchire e isolare le cellule staminali intestinali di Drosophila e le cellule progenitrici degli enteroblasti mediante FACS in qualsiasi momento durante l'invecchiamento.

Abstract

Il tessuto che invecchia è caratterizzato da un continuo declino della capacità funzionale. Le cellule staminali adulte sono fondamentali per mantenere l'omeostasi tissutale, in particolare nei tessuti che hanno un alto tasso di turnover come l'epitelio intestinale. Tuttavia, le cellule staminali adulte sono anche soggette ai processi di invecchiamento e al concomitante declino della funzione. L'intestino medio di Drosophila è emerso come un sistema modello ideale per studiare i meccanismi molecolari che interferiscono con la capacità delle cellule staminali intestinali (ISC) di funzionare nell'omeostasi dei tessuti. Sebbene le ISC adulte possano essere facilmente identificate e isolate dall'intestino medio di giovani mosche, è stata una grande sfida studiare i cambiamenti molecolari endogeni delle ISC durante l'invecchiamento. Ciò è dovuto alla mancanza di una combinazione di marcatori molecolari adatti a isolare le ISC dall'intestino invecchiato. Qui proponiamo un metodo che consente di dissociare con successo il tessuto dell'intestino medio in cellule viventi che possono essere successivamente separate in popolazioni distinte mediante FACS. Utilizzando cellule dissociate dalla linea di mosca esg-Gal4, UAS-GFP, in cui sia le ISC che le cellule progenitrici dell'enteroblast (EB) esprimono GFP, si distinguono due popolazioni di cellule in base alle diverse intensità di GFP. Queste differenze nell'espressione della GFP sono correlate a differenze nelle dimensioni e nella granularità cellulare e rappresentano popolazioni arricchite di ISC ed EB. Curiosamente, le due popolazioni cellulari GFP-positive rimangono nettamente separate durante l'invecchiamento, presentando una nuova tecnica per identificare e isolare popolazioni cellulari arricchite per ISC o EB in qualsiasi momento durante l'invecchiamento. L'ulteriore analisi, ad esempio l'analisi del trascrittoma, di queste particolari popolazioni cellulari in vari momenti durante l'invecchiamento è ora possibile e ciò faciliterà l'esame dei cambiamenti molecolari endogeni che si verificano in queste cellule durante l'invecchiamento.

Introduzione

Una conseguenza inevitabile di invecchiare è la capacità decrescente di tessuti e organi a funzionare. Le cellule staminali adulte sono essenziali per mantenere l'omeostasi dei tessuti e la funzionalità degli organi, ma come organismi di età, le cellule staminali anche sperimentare un calo della loro comportamento biologico. Ciò è particolarmente dannoso per tessuti che hanno un alto tasso di turnover, quali l'epitelio intestinale. Caratteristiche di cellule staminali di età includono danni genomico, i meccanismi di riparazione deteriorate, regolazione del ciclo cellulare alterata e vie di segnalazione misregulated, tutti che influenzano il comportamento delle cellule staminali normali (rivisto in ^1-3). Manipolando vie di segnalazione specifici o abbattere geni specifici, abbiamo acquisito conoscenze del loro ruolo nella regolazione e il mantenimento di un comportamento normale di cellule staminali. Dal momento che la maggior parte di questi esperimenti sono approcci molecola candidati, abbiamo pochissime informazioni circa i cambiamenti molecolari endogeni che si verificano nelle cellule staminali duranteinvecchiamento. Un modo per affrontare questo problema è quello di confrontare il trascrittoma di giovane rispetto a cellule staminali vecchie di identificare molecole il cui profilo di espressione cambia in modo significativo durante l'invecchiamento. Purtroppo, problemi biologici e tecnici hanno ostacolato il nostro progresso per quanto riguarda questo approccio finora.

Drosophila melanogaster è un organismo modello molto adatto per lo studio dell'invecchiamento in quanto ha una vita breve (circa 60-70 giorni) e mostre fenotipi di invecchiamento (rivisto in ^4). Inoltre, il processo di invecchiamento in Drosophila può essere accelerato dalla temperatura. Quando mantenendo in linea a 29 ° C, un fenotipo invecchiato nel tessuto intestinale può già essere osservato dopo 15 giorni ^5. Inoltre, Drosophila è suscettibile per una pletora di manipolazioni genetiche. In particolare, il midgut Drosophila è emersa come un ottimo sistema modello per studiare l'influenza di diverse vie di segnalazione e le sfide ambientalila biologia delle cellule staminali intestinali (CSI) durante l'invecchiamento (rivisto in ^6-10). L'epitelio intestinale Drosophila ha un alto tasso di fatturato e si rinnova ogni due settimane nelle femmine e circa una volta al mese nei maschi ^11. ISC residente nel midgut Drosophila ha la capacità di dividersi e produrre un ISC auto-rinnovata e una cellula progenitrice post-mitotico chiamato enteroblast (EB) ^12,13. L'EB differenzia in due un enterociti assorbente o una cella enteroendocrine secretoria. A questa data, l'unica combinazione marcatore che le etichette in modo inequivocabile un ISC è l'espressione del fattore di trascrizione escargot (ESG) e il ligando Notch Delta (Dl) ^14. Tuttavia, questo vale per un giovane e sano intestino solo. Durante l'invecchiamento, l'epitelio midgut è caratterizzata da un aumento della proliferazione ISC ^15-17. Inoltre, Notch aberranti sconvolge la decisione destino delle cellule figlie ISCe induce misdifferentiation di EBs ^15. Ciò si traduce in un accumulo di cellule che sono attivi per la segnalazione Notch e co-express ESG e Dl, rendendo così espressione Dl insufficiente per identificare in buona fede le cellule staminali in un midgut invecchiato. La difficoltà di identificare i veri CSI ha impedito la possibilità di esaminare i cambiamenti endogeni in CSI invecchiamento fino ad ora.

Abbiamo affrontato questo problema sfruttando la ESG -Gal4, UAS-GFP linea fly transgenici in cui il livello di espressione GFP in CSI e EBS è intrinsecamente diversa e resta diverso per tutta l'invecchiamento. Un approccio simile è stato descritto per l'isolamento di neuroblasti larvali e neuroni ^18,19. Midguts di giovani e vecchi ESG -Gal4, mosche UAS-GFP sono stati sezionati e dissociate in singole cellule. Le cellule sono state poi ordinati per la cellule GFP-positive utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). È interessante notare che l'ordinato GFP-positive cells distribuiti in due picchi distinti sulla base dell'intensità di fluorescenza GFP (GFP ^{alti e bassi} GFP). Inoltre, la distribuzione delle cellule GFP-positive nei due picchi anche correlati con dimensioni delle cellule: le cellule che mostravano bassa intensità GFP erano piccole e meno granulare che cellule con alta intensità GFP erano più grandi e più granulare. Questa osservazione ha suggerito che i CSI più piccole potrebbero essere distinti dai EBs di grandi dimensioni tramite FACS basati sull'intensità GFP e scegliendo scatter appropriata in avanti (FSC) e le impostazioni di side scatter (SSC). Curiosamente, i due picchi sono rimasti nettamente separati durante l'invecchiamento. Inoltre, il rapporto tra i due picchi modificata in modo da riflettere le caratteristiche di cui sopra di midguts invecchiamento: vale a dire che il numero di grandi dimensioni, misdifferentiated EBS aumenta nel tempo. Da questi risultati possiamo concludere che di classificare per le cellule GFP-positive utilizzando le impostazioni dei parametri FACS appropriate possiamo arricchire per CSI e EBs in qualsiasi punto temporale durante invecchiamento.

In sintesi, si introduce una strategia di FACS che permette ai ricercatori di arricchire di due diverse popolazioni cellulari, CSI ed EBS, dalla Drosophila midguts di ogni età e isolare queste cellule per ulteriori analisi, come sequenziamento di nuova generazione. Questo metodo permette potente per lo studio dei meccanismi molecolari endogeni che sono inerenti all'invecchiamento in una popolazione arricchito di cellule staminali o progenitrici. I dati ottenuti da questi studi saranno sicuramente facilitare l'identificazione di molecole conservate che sono significativi per l'invecchiamento tra le specie.

Protocollo

NOTA: Se il protocollo viene utilizzato per la prima volta a isolare CSI da FAC di smistamento, i seguenti controlli sono obbligatori al fine di impostare inizialmente i parametri FACS correttamente: le cellule dissociate da wild type (es w ¹¹¹⁸⁾ midguts Drosophila senza Sytox. Cellule dissociate da wild type (es w ¹¹¹⁸⁾ midguts Drosophila con Sytox (vedi punto 3.6). Cellule dissociato dal midguts della linea fly UAS-GFP ESG -Gal4 senza Sytox.

1. preparazione di soluzioni e piatti per Gut Dissection

1. Preparare 4-6 flaconcini contenenti ciascuno 40 femminile vola da ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP.
2. Da una soluzione 10x PBS, preparare 500 ml 1x PBS (1,8 mm NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O, 8.4 mM Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 175 mM NaCl, regolare il pH a 7,4).
3. Preparare un 3,5Soluzione% agarosio in PBS 1x (3,5 g di agarosio grado elettroforesi in 100 ml PBS 1x). Preparare piatti dissezione versando questa soluzione in capsule di Petri (diametro 8,5 centimetri) per coprire il fondo. Lo strato di agarosio impedisce di danneggiare le punte della pinza durante la procedura di dissezione. Dopo che il gel è solidificato memorizzare le piastre di dissezione a 4 ° C.
4. Preparare 300 ml di PBS 1x + 1% BSA freschi prima dissezione e posizionare la bottiglia su ghiaccio oppure a 4 ° C.
5. Accendere centrifuga e lasciarlo raffreddare a 4 ° C.
6. Fiamma le punte dei 2 pipette Pasteur in vetro per lisciare i bordi.
7. Pulire due paia di pinze e una lama di rasoio con il 70% di etanolo.
8. Mettere da quattro a sei da 1,5 ml microprovette per la raccolta midguts sezionati sul ghiaccio.

2. Preparazione del tratto gastrointestinale e la dissezione del midgut

1. Anestetizzare le mosche da un flaconcino (40 mosche) con CO ₂ in un letto volo normale, decapitare tuttomosche usando una lama di rasoio e trasferirli al piatto dissezione. Versare fredda soluzione / 1% BSA PBS 1x nel piatto dissezione a coprire il gel di agarosio. Le mosche galleggia.
2. Prendete al volo addome con un paio di pinze, tenendo il torace con l'altra coppia di pinze. Separare il torace dall'addome. L'intestino sarà visibile e la foregut / raccolto sarà molto probabilmente ancora collegato al torace.
3. Afferra l'intestino ed estrarlo del torace. Per aprire l'intestino, afferrare il raccolto e tirare l'intestino leggermente anteriormente fuori dall'addome.
4. Afferrare l'estremità posteriore dell'addome con una coppia di pinze e il bordo della cuticola aperta anteriormente con l'altra coppia di pinze. Fare attenzione a non distruggere il tessuto intestinale sporgenti. Tirare l'estremità posteriore via per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente finché l'intero intestino è stato tirato fuori dalla cavità addominale. Il raccolto potrebbe dover essere rimosso in anticipo se è troppo grande per essereattraverso la cavità del corpo.
5. Rimuovere la foregut, tubuli malpighiani, hindgut e ovaie lasciando il midgut nudo.
6. Utilizzando un vetro pipetta Pasteur, trasferire il lotto di midguts sezionati in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente freddo soluzione BSA 1x PBS / 1% e mantenere il tubo in ghiaccio. I campioni devono essere trattati entro 2 ore.
7. Dopo la dissezione di un intero lotto è completa, lavare il piatto dissezione con acqua bidistillata a lavare sinistra sopra i detriti. Avviare sezionare il prossimo gruppo di midguts (ripetere i passaggi 2,1-2,7). Sezionare tante partite possibili entro 2 ore, quindi procedere al passo 3.1.

3. La digestione del Tissue Gut a Celle di raccolta per FAC Ordinamento

1. Rimuovere la soluzione BSA / 1% 1x PBS dai midguts e aggiungere 500 ml di 0,5% soluzione di tripsina-EDTA per ogni campione.
2. Vortex bene per 20 sec e incubare i campioni dolce dondolio / rotante a 20 rpm a temperatura ambiente per 25-30 min.
3. Vortex nuovamente dopo circa 30 min e lascia intatta lavello tessuto midgut al fondo della provetta. Rimuovere delicatamente le cellule che sono in sospensione con una fiammata Pasteur pipetta di vetro e filtrare attraverso un nylon 35 micron rete in un nuovo 1,5 ml provetta.
4. Spin le cellule giù a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Da notare, quando si avvia il digest, un pellet di cellule potrebbe non essere visibile in un primo momento, ma sarà visibile come il tessuto digest progredisce.
   1. Trasferire accuratamente la soluzione tripsina torna alla provetta campione originale contenente il rimanente tessuto midgut intatto. Evitare il trasferimento troppe cellule dal pellet.
   2. Delicatamente risospendere il pellet cellulare in 400 ml di freddo 1x PBS / BSA 1%. Tenere le provette da microcentrifuga contenenti le cellule dissociate su ghiaccio e coprire le provette con foglio di alluminio per proteggere le cellule dalla luce.
   3. Vortex la soluzione tripsina contenente ancora il restante tessuto midgut intatta e posizionare i campionisul bilanciere per altri 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.4.3 fino a quando tutti i tessuti dell'intestino è stato digerito. Unire le cellule dissociate da tutti i tubi microcentrifuga in una provetta. Ciò può richiedere una fase di centrifugazione come in 3.4, in quanto il volume di tutte le sospensioni cellulari combinate possono superare 1,5 ml. Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio e proteggere le cellule dalla luce.
6. Spin le cellule dissociate giù a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere accuratamente la maggior quantità di surnatante possibile lasciando circa 50-100 ml di soluzione di BSA 1x PBS / 1% in provetta. Risospendere delicatamente le cellule dissociate in 800 microlitri 1x PBS / BSA 1% contenente Sytox (1: 20.000).
7. Trasferire la sospensione cellulare a 5 ml tubo Falcon rotondo fondo filtrando le cellule attraverso un cappuccio filtro cella (maglia di nylon 35 micron). Tenere sempre campioni di cellule su ghiaccio e al riparo dalla luce. Le cellule sono ora pronti peressere ordinati.
8. Pipettare 600 ml di soluzione di RNAlater in ogni provetta in cui le cellule verranno ordinati per successivo isolamento di RNA. Per altre applicazioni a valle le cellule possono essere raccolte in una soluzione diversa, ad esempio in PBS sterile.

4. FAC Ordinamento per isolare le cellule staminali intestinali

1. Accendere lo strumento citometria di flusso almeno un'ora prima di smistamento. Assicurarsi che il sistema di fluidica è privo di bolle d'aria.
2. Scegli le dimensioni dell'ugello 70 micron per iniettare le cellule nel flusso del liquido guaina.
3. Regolare l'ampiezza della corrente di fluido principale in modo che il valore della distanza corrispondente al valore di riferimento (6-7, quando si utilizza l'ugello 70 micron). Lasciate che il flusso del fluido nucleo stabilizzi prima di iniziare a ordinare.
4. Seguire questo ordine quando l'impostazione iniziale dei parametri per l'ordinamento:
   1. Caricare le cellule dissociate ottenute da tipo budella selvatici. In primo luogo, regolare le tensioni FSC e SSCper tracciare le cellule al centro del grafico a dispersione. In secondo luogo, regolare la FITC (GFP) tensione in modo che tutte le cellule sono tracciati inferiore a 10 ² sul logaritmico asse x. L'impostazione del parametro CIC fissa il limite per autofluorescenza.
   2. Caricare le cellule dissociate ottenute da tipo budella selvatici con Sytox aggiunto. Regolare il valore di Pacific Blue di tensione e porta a identificare e cellule soggiorno indipendente dai morti, cellule Sytox-positivi in ​​Blue Pacific vs FSC un diagramma a dispersione.
   3. Caricare le cellule dissociate ottenute dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP senza Sytox e regolare la tensione di FITC per garantire che tutte le cellule GFP-positive sono tracciati all'interno del diagramma a dispersione.
5. Caricare le cellule dissociate ottenute dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP con Sytox aggiunto. Regolare il valore di Pacific Blue di tensione e porta a identificare e cellule soggiorni separati dai morti, cellule Sytox-positive (porta P1).
   1. Impostare la SSC-A e FSC Un cancello per identificare il GFPcellule positive (basati sulla trama istogramma) come determinato dalla dimensione e granularità (cancello P2).
   2. Impostare la porta FSC-H e FSC-W per identificare ed escludere doppiette di cellule GFP-positive in base alla loro dimensione (cancello P3).
   3. Impostare la SSC-H e la porta SSC-W per identificare ed escludere doppiette di cellule GFP-positive in base alla loro granularità (cancello P4).
   4. Utilizzare cancello P4 per rappresentare le cellule GFP-positive in una trama istogramma che mostra il numero di cellule (contare) vs. intensità GFP. Due picchi distinti di cellule GFP-positive saranno visibili. Creare una porta per ogni picco (cancelli P5 e P6). Porta P5 contiene la popolazione di cellule che si arricchisce di CSI e possono essere ordinati separatamente dalle cellule nel cancello P6.
   5. Back-porta in una trama di contorno per verificare che le due popolazioni GFP-positive distinte cellule contengono cellule viventi (confrontare con cancello P1) e le cellule del formato corretto (confrontare con cancello P2).
6. Ordina le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 600 & #181; l di soluzione RNAlater. La selezione è effettuata ad una velocità di flusso bassa (max. 2,0, 70 micron ugello, 1.000 eventi / sec, 70 psi) e impiegando un bidirezionale purezza sorta.
7. Dopo l'ordinamento è completa, vortice immediatamente le cellule ordinati brevemente e mantenere i tubi microcentrifuga su ghiaccio fino procedere con l'isolamento di RNA o altre applicazioni a valle.

Risultati

Per ottenere tra 50.000-100.000 cellule da FAC ordinamento, tra 160 e 200 midguts devono essere sezionato. Ovviamente questo è il più tempo passo dell'intera procedura. Il cartone mostrata in figura 1A illustra le fasi principali di budello dissezione, che sono descritti in dettaglio nel protocollo qui fornite. Questa procedura può essere modificata singolarmente. Un sezionato, tutto il tratto gastrointestinale è mostrato nella Figura 1B.

Quando tutto il tessuto midgut è stato digerito, continua immediatamente con FAC smistamento. Seguendo la strategia di gating descritto nel protocollo consente l'identificazione di successo e smistamento di una popolazione di cellule arricchito per CSI e EBs da giovane (Figura 2) e da vecchie midguts (Figura 3). Il cancello P1 è impostato per includere solo le cellule viventi sane e per escludere le cellule morte. Le cellule che tracciare sopra 10 ³ sulla logaritmica y-axquando si utilizza il canale Pacific Blue sono definiti come cellule morte. I punti che trama sotto 40 sul asse x (FSC-A) sono per lo più detriti e quindi sono esclusi anche (Figura 2A). Nel grafico a dispersione di SSC-A vs FSC-A le cellule sono distribuiti in base alla loro dimensione e granularità. Per una risoluzione ottimale, le cellule sono posti nel diagramma di dispersione, come illustrato in Figura 2B regolando la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT). Nei grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W singole cellule sono separate da aggregati e doppietti base alle dimensioni (Figura 2C) e sulla base di granularità (Figura 2D). Quando raffigurante le cellule contenute in porta P4 in una trama istogramma, la netta separazione di GFP-negativo, GFP ^basso (porta P5) e (cancello P6) cellule GFP ^alta è visibile (Figura 2E). Le cellule che presentano intensità GFP inferiore sono piccole e meno granulare e rappresentano CSI. Le cellule che presentano maggiore int GFPensità sono più grandi e più granulare e rappresentano EBs. Trascrittasi inversa (RT) -PCR per Dl su cDNA sintetizzato da RNA delle cellule di ogni popolazione GFP-positive (cancelli P5, P6) ha rivelato che il segnale Dl è davvero più forte nei più piccoli, GFP ^bassi cellule che nel più ampio, GFP ^alta cellule (Figura 2H). Le cellule sono state poi backgated e rappresentati in grafici di contorno per confermare che le cellule GFP ^basso (porta P5) e GFP ^alto (porta P6) differiscono per dimensioni e granularità (Figura 2F) e sono ancora vivi (Figura 2G). Di nota, i due picchi di cellule GFP-positive (GFP ^bassa e ^alta GFP) possono essere ben distinti solo se il (GFP) canale FITC è stato calibrato correttamente utilizzando i comandi descritti nel protocollo.

La stessa strategia di gating è stato utilizzato durante l'ordinamento CSI derivati ​​da vecchi budella (Figura 3). I grafici a dispersione (Figure 3A-D), l'istogramma (Figura 3E) e le curve di livello (Figura 3F, G) sono analoghi a quelli mostrati in figura 2. Come accennato sopra, non vi è alcun marcatore buona fede identificare ISCs in vecchi midguts e quindi nessun dato RT-PCR è presentato qui. Tuttavia, l'osservazione interessante è che i due picchi contenenti GFP ^basso (porta P5) o (P6) di gate cellule GFP ^elevati rimangono nettamente separati durante l'invecchiamento. Inoltre, il numero di cellule in ^alta (gate P6) picco GFP aumenta significativamente durante l'invecchiamento, che emula chiaramente l'accumulo noto di EBs misdifferentiated con l'età. La variazione del rapporto tra le due popolazioni cellulari può essere visto anche nelle trame dispersione (confrontare Figura 3A-D con la Figura 2A-D) e nei grafici di contorno (confronta figura 3F, G alla figura 2F, G). Da questi risultati possiamo concludere che di classificare per GFPcellule -positive utilizzando FACS si possono arricchire di ISC e EBs in giovani e vecchi midguts.

Per convalidare la purezza della ISC isolata e EBs, un'analisi post ordinamento è stato eseguito (Figura 4). Le trame istogramma del post-ordinati ISC ed EBS (Figura 4B, C) ​​raffigurano purezza tra il 95% e il 98%.

Se la gerarchia di impostare i parametri FACS come sopra descritto è strettamente seguito, le due popolazioni cellulari differenti (GFP ^bassa, piccola e GFP ^alto, più grande) possono già essere distinte in un grafico a dispersione GFP vs. FSC-A (Figura 5A). Queste due popolazioni di cellule non si distinguono se questa gerarchia viene ignorata (Figura 5B-D).

Figura 1: (A) Uno schema delle fasi principali di Disseamen la mosca intestino. Innanzitutto, la testa viene rimossa (la rimozione delle ali è opzionale) seguito da una separazione del torace e dell'addome per esporre l'intestino. L'intestino viene successivamente liberato dalla cavità del corpo nelle seguenti fasi. Le frecce nere indicano la progressione della dissezione, mentre le frecce rosse scure indicano la direzione di estrazione. Le linee rosse nella ultima immagine indicano anteriore e posteriore confini del midgut. (B) A immagine luce del microscopio della mosca adulta dell'intestino. Le principali regioni e caratteristiche anatomiche sono etichettati. Le linee rosse segnano i confini del midgut.

Figura 2:. FAC ordinamento strategia per identificare e isolare ISC e EBs da giovani (7 giorni) midguts Per una migliore visualizzazione, le cellule che rappresentano CSI sono evidenziate in rosso e le cellule che rappresentano EBs sono evidenziatein blu nel diagrammi di dispersione (AD) e nei grafici di contorno (F, G). (A) Il cancello P1 è impostato per escludere cellule morte, Sytox-positivi tracciate sopra 10 ³ sul y logaritmico. La soglia del FSC-A è fissato a 40 per escludere anche le cellule morte e detriti. (B) Le cellule sono state gated per FSC-A e SSC-A per selezionare le celle in base alle dimensioni e granularità (cancello P2). La trama istogramma (E) è stato utilizzato in parallelo per identificare le cellule GFP-positive in FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (B). (C, D) I grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W servono per rimuovere aggregati e doppietti e selezionare per singlets (porta P3 in C e cancello P4 in D). (E) La trama istogramma mostra il numero di cellule e la loro intensità GFP. Due picchi, GFP ^basso (porta P5) e GFP ^alto (porta P6) possono essere distinti. (F, G) Le cellule sono state back-gated in una trama di contorno per verificare che le due cellule GFP-positive distinto populationi sono di dimensioni corrette (F) e contengono cellule viventi (G). (H) Reverse Transcriptase (RT) per -PCR Dl su cDNA sintetizzato da RNA isolato dalle cellule presenti nel primo picco (porta P5) e nel secondo picco (cancello P6), rispettivamente. Più espressione Dl potrebbe essere rilevato in cellule presenti in porta P5 P6 vs cancello. Tubulina servito come controllo di caricamento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: FAC ordinamento strategia per identificare e isolare ISC e EBs dal vecchio (60 giorni) midguts Per una migliore visualizzazione, le cellule che rappresentano CSI sono evidenziate in rosso e le cellule che rappresentano EBs sono evidenziate in blu nei grafici a dispersione (AD) e in. grafici di contorno (F, G). (A) Il cancello P1 è impostato per escludere cellule morte, Sytox-positivi tracciate sopra 10 ³ sul y logaritmico. La soglia del FSC-A è fissato a 40 per escludere anche le cellule morte e detriti. Da segnalare, l'aumento di età-dipendente in cellule GFP-positive più grandi è già evidente in questa trama. (B) Le cellule sono state gated per FSC-A e SSC-A per selezionare le celle in base alle dimensioni e granularità (cancello P2). La trama istogramma (E) è stato utilizzato in parallelo per identificare le cellule GFP-positive in FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (B). (C, D) I grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W servono per rimuovere aggregati e doppietti e selezionare per singlets (porta P3 in C e cancello P4 in D). (E) La trama istogramma mostra il numero di cellule e la loro intensità GFP. Due picchi, GFP ^basso (porta P5) e GFP ^alto (porta P6) possono essere distinti. Da segnalare, ^l'alta cellula popolazione GFP contenenti celle più grandi è aumentato in numero durante l'invecchiamento. (F, G) le cellule sono state back-gated in una trama di contorno per verificare che le due popolazioni GFP-positive distinte cellule sono di dimensioni corrette (F) e contengono cellule viventi (G). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Una analisi post sorta è stata eseguita per determinare la purezza della ISC isolata e EBs cellule (A) GFP-positivi dai giovani (7 giorni) e di età (60 giorni) midguts erano FAC allineati e le trame degli istogrammi mostrano la distribuzione in due picchi sulla base dell'intensità GFP. (B) L'analisi post sorta dimostra la purezza dei CSI isolati da giovani e meno giovani midguts che è> 97%. (C) L'analisi post sorta di ordinata EB da giovani e meno giovani midguts mostra una purezza> 95%. Le lievi impurità possono derivare da fluorescenza tempra o cellule GFP esprimere danneggiate meccanicamente causati dalla ri-ordinare le cellule. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Esempi di grafici a dispersione che mostrano dati FACS non ottimali, che si vede quando i parametri FACS non sono stati fissati correttamente (A) profilo Rappresentante FACS di tutte le cellule, quando i parametri FACS sono stati impostati correttamente sulla base dei controlli descritti nel protocollo.. La popolazione di cellule contenenti CSI è cerchiata in rosso e la popolazione cellulare contenente EBS è cerchiata in blu. Le cellule cerchiate in verde sono le cellule morte che hanno una autofluorescenza forte rispetto alcellule viventi, che sono tracciate sotto 10 ³ on y logaritmico. (B) Il diagramma a dispersione raffigura un tipico risultato ottenuto quando lo strumento FACS non è stata calibrata. Non vengono rilevati cellule GFP-positive. (C) Se la FSC non è impostato correttamente, le diverse popolazioni di cellule GFP-positive non vengono rilevati. (D) Se la (GFP) canale FITC non è regolato correttamente, la maggior parte di GFP cellule positive da ordinare non tracciata nel diagramma di dispersione, ma piuttosto lungo il bordo superiore della trama. Inoltre, nel grafico riportato qui, il limite per autofluorescenza non era regolata, quindi cellule che trama superiore a 10 ² sul y asse logaritmiche sono in realtà autofluorescenti e potrebbe essere scambiato come cellule GFP-positive.

Discussione

Il protocollo presentato descrive un metodo per isolare ISC da giovani e meno giovani adulti midguts Drosophila, che possono poi essere utilizzati per ulteriori analisi molecolari come sequenziamento di nuova generazione. FAC ordinamento della popolazione di cellule GFP-positive dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP è già stato raggiunto da diversi gruppi ^21,22. Tuttavia, fino ad ora la presenza dei due picchi distinti di cellule GFP-positive è stata sia trascurato o sottovalutato. Abbiamo dimostrato che questa separazione non rappresenta solo due diverse popolazioni di tipi di cellule (ISC e EBS), ma anche che i due picchi di cellule GFP-positive rimanere nettamente distinto durante l'invecchiamento. Questa osservazione è molto importante e prezioso per i ricercatori interessati allo studio delle cellule staminali o progenitrici durante l'invecchiamento. Isolamento di ISC da vecchi midguts è stata ostacolata dal fatto che non vi è nessuna combinazione marcatore molecolare per identificare i CSI in un midgut invecchiato. L'unico indicatore che uidentifica nambiguously ISC in un vecchio midgut è fosfo-histone3 (PH3), dal momento che ISC sono le cellule solo dividono nel midgut ^12,13. Tuttavia, PH3 è un indicatore idoneo per isolare ISCs poiché il numero di divisione delle cellule staminali in qualsiasi dato punto di tempo è troppo bassa per ottenere una discreta quantità di CSI per analisi successive. La ESG linea di volo -Gal4, UAS-GFP è la linea di volo più comuni utilizzati dai ricercatori che studiano ISC funzione, la manutenzione e la differenziazione. La nostra conoscenza attuale sulla regolazione molecolare di CSI omeostasi è basata su studi in cui sono stati manipolati specifiche molecole e vie di segnalazione (valutata in ^7). Quindi, ci manca ancora la conoscenza dei cambiamenti molecolari endogeni che si verificano durante l'invecchiamento. Il metodo qui descritto chiude questa lacuna e si basa sul fatto che CSI può essere isolato base alle loro dimensioni, granularità e GFP intensità da midguts adulti in qualsiasi punto nel tempo durante l'invecchiamento.

Mentrestabilire e ottimizzare questo metodo abbiamo trovato le seguenti operazioni per essere critico per un risultato affidabile. Circa 200 viscere devono essere sezionato al fine di ottenere una buona quantità di CSI per FAC smistamento. La velocità di dissezione è fondamentale e dipende dalla pratica dell'individuo. Un individuo addestrato può sezionare 40 budella entro 20-30 min. Poiché GFP si esprime anche nei tubuli malpighiani nel ESG -Gal4, UAS-GFP linea di volo, è indispensabile rimuovere completamente i tubuli malpighiani dal midgut. I midguts sezionati devono essere conservati in un ambiente fresco per evitare il degrado del tessuto e ridurre l'attività RNAse nel tessuto. Pertanto, i midguts sezionati devono essere trasferiti dal piatto dissezione in microprovette contenenti freddo soluzione / 1% BSA 1x PBS dopo un massimo di 20-30 minuti e tenuti in ghiaccio. Tuttavia, i midguts sezionato non dovrebbero essere lasciati sul ghiaccio per più di 2 ore prima di iniziare la dissociazione di tessuto con tripsina. Il più efficiapproccio ent è quello di analizzare il maggior numero di partite di mosche possibili entro questi 2 ore, quindi avviare la tripsina digerire per questi lotti. Se sono necessarie più midguts, possono essere sezionati durante i tempi di incubazione della tripsina digest.

Sebbene tripsina è un enzima molto potente e potrebbe avere effetti negativi sulle cellule, abbiamo ancora ottenuto abbastanza vita, le cellule sane per il successivo smistamento FAC. La fase chiave del nostro procedimento che permette l'isolamento di cellule intatte è che le cellule dissociate sono rimossi dalla soluzione di tripsina ogni 30 min. Se le midguts sezionati sono incubate per 2 ½ ore in una soluzione di tripsina contenente a temperatura ambiente, abbiamo osservato un aumento del 20-30% in celle Sytox-positive morti. Va sottolineato che la soluzione tripsina usiamo contiene EDTA. La presenza di EDTA probabilmente facilita disgregazione del tessuto da chelanti ioni calcio e magnesio necessari per il corretto funzionamento delle molecole della matrice extracellulare.

I passi più importanti per specie con successo ISC da giovani e vecchi coraggio sono le impostazioni iniziali appropriate dei FACS ed i parametri di gating utilizzando i comandi descritti e seguenti una gerarchia di ordinamento specifico. Abbiamo eseguito la FAC l'ordinamento su un II Citofluorimetro ARIA (software FACSDiva). È importante che lo strumento sia acceso almeno un'ora prima di smistamento per riscaldare i laser. Da segnalare, quando viene eseguito FAC ordinamento del CSI per la prima volta, i parametri per la selezione e per necessità di compensazione da impostare utilizzando i controlli di cui sopra: (1) le cellule dissociate da wild type (es w ¹¹¹⁸⁾ midguts Drosophila senza aggiunta di Sytox - impostazione di questo parametro (Step 4.4.1) impedisce l'ordinamento delle cellule in base alla loro autofluorescenza; (2) dissociato da cellule wild type (es w ¹¹¹⁸⁾ midguts Drosophila con Sytox aggiunto - impostazione di questo parametro(Step 4.4.2) permette di separare morto da cellule viventi (le cellule morte hanno un elevato autofluorescenza e possono contaminare le cellule GFP-positive ordinati); (3) dissociato cellule dal midguts della ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP senza Sytox - impostare questo parametro (Step 4.4.3) assicura che tutte le cellule GFP-positive sono tracciati all'interno del diagramma a dispersione. Se questi parametri non sono impostati correttamente, la popolazione cellulare ordinata, molto probabilmente conterrà le cellule morte e detriti (Figura 5B, C), molte cellule GFP-positive verranno perse (Figura 5D) e le due picchi distinti per cellule GFP-positive come visto nella trama istogramma (Figura 2E e Figura 3E) non vengono rilevati. Una volta impostati i parametri FACS e gating, lo strumento è calibrato e pronto per ordinare cellule dal ESG -GAL4, linea di volo UAS-GFP. Dal momento che questi parametri possono essere salvati, tutti i futuri ordinamento sessioni per CSI e EBs dalla ESG -GAL4, UAS-Linea di volo GFP può iniziare dal punto 4.5. Sebbene scegliendo la modalità "Purezza" ed effettuando una purezza bidirezionale sorta diminuisce il numero di cellule filtrate, consente una maggiore stringenza classificare (Passo 4.6 e Figura 4B, C). Da notare, il vantaggio di utilizzare Sytox invece di ioduro di propidio etichettare cellule morte è che c'è solo una bassa straripamento nel canale FITC (GFP), che lo rende facile per compensare la ricaduta.

Il nostro metodo di arricchimento per CSI e EBS, rispettivamente, si basa su ordinamento delle celle in base ai diversi livelli di espressione GFP. Può darsi che durante l'invecchiamento la misdifferentiated EBs anche esprimere GFP a un livello più basso e potrebbe essere scambiato come CSI. Tuttavia, poiché le cellule ordinati differiscono per dimensioni e granularità, riteniamo che la nostra strategia di ordinamento è il più adatto a questa data per arricchire per ISC ed EBS. Inoltre, è noto che le cellule in un midgut invecchiamento ritegno ISC identità hanno un piccolo nucleo ¹⁵. Per ottenere maggiore chiarezza sull'identità delle cellule ordinati, si poteva ordinare cellule da una linea transgenica mosca che porta esg -GAL4, UAS-GFP e un segnale di Notch giornalista transgene. Poiché Notch ha dimostrato di essere attivo solo nelle EBs ^12,13, ISCs isolato da un giovane midgut sarebbe negativo per il reporter Notch, mentre i EBs sarebbe positivo per il reporter Notch. Tuttavia, durante l'invecchiamento diventa segnale di Notch aberranti nel tessuto midgut. Pertanto, deve essere testato se questo set up sperimentale è davvero più affidabile per distinguere tra CSI e EBs isolato da un vecchio midgut.

Abbiamo già impiegato questo approccio per l'analisi del trascrittoma comparativa dei CSI da giovani e vecchi midguts e ha individuato una serie di fattori che sono regolati in modo differenziale durante l'invecchiamento (unpub. Osservati.). Inoltre, questo metodo consente di analizzare le differenze di espressione genica tra CSI e EBS. Tale indagines fornirà comprensione dei cambiamenti molecolari iniziali che si verificano in una cellula entra nel processo di differenziazione. Inoltre, l'isolamento di EBs durante l'invecchiamento e le successive analisi farà luce sui cambiamenti molecolari di misdifferentiation età indotta. Inoltre, questo metodo può essere combinato con altri strumenti genetici utilizzati in Drosophila per studiare la funzione del gene. In sintesi, questo metodo offre un approccio imparziale per indagare le caratteristiche molecolari e cambiamenti di ISC ed EBS durante l'invecchiamento. Si tratta di un prezioso strumento che faciliterà l'esplorazione di invecchiamento meccanismi nelle cellule staminali e progenitrici adulte.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinze: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µ Sefar		3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Provetta in polistirene a fondo tondo con filtro cellulare Tappo a scatto	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumina da siero bovino (BSA)	Sigma	A4503-50G
0,5% Tripsina-EDTA	Invitrogen	15400-054	La tripsina ottenuta da un'altra azienda molto probabilmente ha un'attività diversa e la durata del digestato della tripsina deve essere regolata di conseguenza.
SYTOX Blue Dead Cell Stain per citometria a flusso	Life Technologies	S34857
Soluzione di stabilizzazione RNAlater	Life Technologies	AM7023	Altre soluzioni, ad es, Trizol possono essere utilizzate per il successivo isolamento dell'RNA Selezionatore
di cellule FACSAria II	Becton Dickinson		Accendere un'ora prima della cernita