La regolazione dei nutrienti che utilizza l'alimentazione continua aggiustata per la crescita migliora i tassi di crescita degli sferoidi delle cellule di mammifero rispetto all'alimentazione intermittente per colture in bioreattori in sospensione agitata. Questo studio dimostra i metodi necessari per stabilire semplici colture alimentate a tasso aggiustato.
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Articolo metodologico
Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questa dimostrazione, gli sferoidi formati dalla linea cellulare di insulinoma β-TC6 sono stati coltivati come modello di produzione di un prodotto cellulare di isole di mammifero per dimostrare come la regolazione dei livelli di nutrienti possa migliorare la resa cellulare. In studi precedenti, i bioreattori hanno facilitato l'aumento dei volumi di coltura rispetto alle colture statiche, ma non è stato osservato alcun aumento delle rese cellulari. Le limitazioni di nutrienti chiave come il glucosio, che sono stati consumati tra le poppate in batch, possono portare a limitazioni nell'espansione cellulare. Sono state osservate grandi fluttuazioni nei livelli di glucosio, nonostante l'aumento delle concentrazioni di glucosio nei mezzi. L'uso di sistemi di alimentazione continua ha eliminato le fluttuazioni dei livelli di glucosio e ha migliorato i tassi di crescita cellulare rispetto ai metodi di coltura statica e SSB alimentati in batch. Ulteriori aumenti dei tassi di crescita sono stati osservati regolando la velocità di alimentazione in base al consumo di nutrienti calcolato, che ha permesso il mantenimento del glucosio fisiologico per tre settimane in coltura. Questo metodo può essere adattato anche ad altri tipi di cellule.
Introduzione
Al fine di generare un gran numero di cellule umane vitali e funzionali per il trapianto, la regolamentazione delle condizioni di coltura è imperativo. L'esaurimento delle sostanze nutritive, con accumulo di scorie metaboliche sono i principali contributori alla senescenza e metaboliche modifiche che riducono la qualità del prodotto cellulare 1 - 3. Questa procedura illustra un metodo per cellule di mammifero coltura in sferoidi usando un bioreattore agitata combinato con un sistema di alimentazione tasso di perfusione regolata per regolare il glucosio in un intervallo fisiologico 4 per tutta la durata della cultura. Ai....
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Protocollo
1. Cell Line e manutenzione
- Ottenere cellule beta-TC6 (o altra linea cellulare di mammifero aderenti desiderato). In preparazione per lo studio, la cultura, il passaggio, e crioconservare le cellule secondo le istruzioni del fornitore.
2. Montare il sistema di alimentazione continua
NOTA: La progettazione del sistema di alimentazione continua del seguente metodo è basata su sistemi analoghi descritti in letteratura 17 - 19,21,47 - 49. Assemblaggio del sistema usato qui è descritto in dettaglio in una precedente pubblicazione 3.
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Risultati
I livelli di glucosio medio e fluttuazioni Limitare cellulare espansione in Culture standard SSB
I livelli di glucosio fluttuano nelle culture statiche e culture SSB per tutto il periodo di coltura 3. Queste fluttuazioni intensificano con l'aumentare il numero delle cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni ed erano quasi identici in entrambe le culture statiche e SSB. Queste osservazioni sono presentati nella nostra precedente pubblicazione 3........
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Discussione
Generazione di prodotti cellulari di mammiferi per la produzione di agenti biologici e terapie cellulari richiede la cultura e monitoraggio di cellule di mammifero in grande scala 55 - 58. Inoltre, queste applicazioni richiedono condizioni di coltura definite e validate. Semplicemente aumentando il volume delle cellule che utilizzano tecnologie di ricerca non si incontreranno tutti questi requisiti. variazioni medie manuali provocando fluttuazioni di sostanze nutritive e l'accumulo d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Michael Garwood e Sam Stein per i loro utili commenti, e Kristen M. Maynard per l'assistenza nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| β TC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Linea cellulare di insulinoma di topo (tipo di cellula aderente) |
| DPBS No Ca, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144 |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | Vedi sotto per i numeri di prodotto | |
| DMEM Alto glucosio (500 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
| DMEM Basso contenuto di glucosio (100 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (notare che questo medium contiene già piruvato) |
| L-glutammina | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=prodotto-ricerca |
| Piruvato di sodio | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product |
| Siero di suino inattivato a caldo | Gibco - Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product |
| T-150 Fiasche trattate con coltura tissutale | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) & categoryname= |
| NuAire Incubatore per colture cellulari | Princeton, MN | US Autoflow. È possibile utilizzare qualsiasi incubatore per colture cellulari con regolazione CO2 con camicia d'acqua. | |
| Centrifuga | Sorvall RT 7 (Può essere utilizzata qualsiasi centrifuga da banco simile) | ||
| Frigorifero | È possibile utilizzare qualsiasi frigorifero da laboratorio (per questi studi è stata utilizzata una piccola versione da tavolo) | ||
| Bottiglia di vetro da 1 litro | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Scienze della vita) & categoryname= |
| Bottiglia di vetro da 2 L | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato |
| Bioreattori agitati da 250 ml | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Scienze della vita) & categoryname= |
| Piastra di agitazione | Fisher Scientific | 11-496-104A | È possibile utilizzare qualsiasi piastra di agitazione sicura per incubatrice, qualsiasi fornitore |
| Piastre per colture tissutali 100 mm di diametro | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Qualsiasi fornitore può essere utilizzato (ordinato tramite Fisher Sci) |
| FALCON 50 ml Tubi conici | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato |
| Delran Plastica utilizzata per parti personalizzate | McMaster Carr | Vari | Qualsiasi materiale a scelta potrebbe essere utilizzato, ma Deran è scelto perché è sicuro per l'autoclave, non reattivo e facile da lavorare. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
| Tubo in acciaio inossidabile per coperchi personalizzati | McMaster Carr | Vari | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
| Coperchi per bioreattori Delran modificati personalizzati per alimentazione continua | Realizzati su | Non a conoscenza di fornitori che producono un prodotto simile | |
| Coperchi per bottiglie in vetro modificati personalizzati per alimentazione continua | Realizzati su | Alcuni fornitori (ad es, Fischer Sci, Corning) realizzano prodotti simili nei link sottostanti. | |
| Pompa peristaltica digitale Masterflex | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | È possibile utilizzare qualsiasi pompa peristaltica di precisione. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
| Connettori per tubi PVDF (vari) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | vedere il link | Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
| Tubi BPT Pharmed L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13 |
| Membrana Millipore Millex GP PES 0.22 µ l. filtro per siringa sterile (utilizzato per lo sfiato e la filtrazione media) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Qualsiasi fornitore può essere utilizzato |
| Pipetta graduata da 25 ml | Fisher Scientific | 13-678-11 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore e possono essere utilizzate varie dimensioni |
| Pipettatore | Fisher Scientific | 13-681-15E | Qualsiasi fornitore o prodotto simile può essere utilizzato |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 02-671-6 | Qualsiasi fornitore o prodotto simile potrebbe essere utilizzato |
| Trypan Blue | Gibco - Life Technologies | 15250-061 | Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore o prodotto simile. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
| Microscopio a luce invertita | Leica | Qualsiasi fornitore o prodotto simile potrebbe essere utilizzato | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore o prodotto simile (ad es. , Bayer) |
| One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore o prodotto simile (ad es. , Bayer) |
Riferimenti
- Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
- Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production a....
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Ristampe e permessi
