Introduction
Afin de générer un grand nombre de cellules humaines viables et fonctionnelles pour la transplantation, la régulation des conditions de culture est impératif. Épuisement des nutriments, ainsi que l' accumulation de déchets métaboliques sont des contributeurs majeurs à la sénescence et métaboliques changements qui réduisent la qualité du produit de la cellule 1-3. Cette procédure présente un procédé de culture de cellules de mammifère dans sphéroïdes en utilisant un bioréacteur agité associé à un système d'alimentation de perfusion ajustée pour réguler le taux de glucose dans une gamme physiologique 4 pendant toute la durée de la culture. Aux fins de ces études, la gamme physiologique a été définie comme étant comprise entre 100 et 200 mg / dl. Les mêmes procédés peuvent être utilisés pour réguler d'autres éléments nutritifs et de déchets métaboliques tels que le lactate.
cultures statiques dans des petits volumes (1 - 30 ml) sont généralement utilisés dans le cadre du laboratoire de conserver et de différencier les lignées cellulaires pour experimefins NTAL. Cellule repiquage est réalisé avec des changements de milieu complet, au besoin, à intervalles réguliers. La plupart du milieu de culture "classique" a une concentration en glucose élevée (450 mg / dl pour DMEM utilisé dans ces études) pour permettre des changements moyens moins fréquents, sans risque de limitations en nutriments. Cependant, ce procédé par lots alimentation nécessite toujours une manipulation fréquente, présente une variabilité dans l'environnement cellulaire et augmente le risque de contamination de 5 à 9. Bioréacteurs de suspension brassés (SSB) fournissent un meilleur mélange et une diminution de la manipulation 3,10 - 20, mais comme les cultures statiques, nécessitent moyennes modifications manuelles qui contribuent aux fluctuations potentiellement dommageables dans les niveaux de produits nutritifs et des déchets. Perfusion alimentation des cultures SSB réduit ces problèmes en perfusion continue et l'élimination du milieu, mais de grands changements dans les niveaux de nutriments en raison de la croissance des cellules demeurent un problème. L'utilisation d'un ra d'alimentation ajustéete à partir de calculs de l' utilisation des éléments nutritifs en fonction des besoins cellulaires estimés peut fournir l'environnement cellulaire stable nécessaire pour optimiser la viabilité cellulaire et la fonction 21 - 24.
Il y a une abondante littérature décrivant les méthodes de cultures SSB évolutives de cellules de mammifères en particulier pour la culture et l' expansion des cellules pluripotentes 25 - 32, avec d' autres mis l' accent sur l' îlot (beta) cellules 17,33,34, ou la production de produits biologiques 24, 35-38. Beaucoup de ces types cellulaires étudiés peuvent être cultivées dans des cultures sphéroïde, et des procédures spécifiques pour le type de cellule utilisé doit être optimisé avant la mise en œuvre d'un système d'alimentation continue. Dans cette démonstration, un procédé de perfusion d'alimentation a été utilisé pour développer une lignée de cellules bêta cultivées sous forme de sphéroïdes dans un bioréacteur agité 39-43. Le procédé décrit ici fournit unla mise en œuvre directe de l'alimentation des ajustements de taux basés sur des mesures de glucose hors-ligne pour obtenir des conditions de culture ciblées. Réglage de la vitesse d'avance avec cette méthode pour maintenir un niveau de glucose physiologique est montré une augmentation des rendements de cellules. Les cellules de mammifères dépendent d'un nutriment essentiel, le glucose, la production d'énergie, de sorte que l'utilisation de cette lignée cellulaire représente un modèle pour de nombreuses cellules de mammifères cultivées 44. En outre, cette ligne illustre la complexité supplémentaire des cellules bêta, qui sont sensibles aux niveaux de glucose élevés et chroniques 45. Pour cette étude, les cellules ß-TC6 sont autorisés à former des sphéroïdes en culture pour approximer la taille moyenne des îlots de Langerhans in vivo. Le système de bioréacteur à perfusion 17 - 19,21,46 avec un taux d'alimentation adapté à la consommation de glucose, a entraîné le maintien des conditions physiologiques , et les rendements des cellules plus élevées sans modification de la viabilité.
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Protocol
1. Cell Line et maintenance
- Obtenir les cellules ß-TC6 (ou autre ligne souhaitée de cellules de mammifères adhérentes). En préparation de l'étude, la culture, le passage, et la cryoconservation des cellules selon les instructions du fournisseur.
2. Assembler le système d'alimentation en continu
NOTE: La conception du système d'alimentation en continu dans la méthode ci - dessous est basée sur des systèmes similaires décrits dans la littérature 17 - 19,21,47 - 49. Assemblée du système utilisé ici est décrit en détail dans une publication précédente 3.
- Recueillir les composants nécessaires pour le système d'alimentation qui se compose de cinq éléments principaux: un réservoir moyen, pompe péristaltique, bioréacteur agité, réservoir de déchets, et conçu sur mesure ensemble tube / échantillonnage.
- Mettre en place le réservoir de fluide en utilisant une bouteille de 1 L de verre, le réservoir de déchets à l'aide d'une bouteille en verre de 2 L, et l'stirred bioréacteur en utilisant un réacteur en verre d'un volume de 250 ml (de la version du plateau).
- Utilisez une pompe péristaltique numérique ou d'une pompe similaire avec une tête de pompe 8 canaux pour contrôler l'échange moyen.
- Fabrication du réservoir et des couvercles de bioréacteurs modifiés à partir de plastique dur et autoclavable avec tube en acier inoxydable passe-ports pour fournir une ventilation à travers des filtres stériles, et permettre le transfert moyen entre les réservoirs et les bioréacteurs. Vous pouvez également acheter des couvercles spécialisés avec des ports de différents fournisseurs de flux.
NOTE: Le couvercle du bioréacteur peut contenir des ports passe-travers supplémentaires pour l' instrumentation en option et les sondes de surveillance (par exemple, moniteur d'oxygène). - Fixer un tube de sortie (OT) fabriquée à partir de tubes d'aération en verre poreux avec une gamme moyenne de 40 um à 60 um de taille des pores, et une densité de pores de 40% au couvercle SSB modifié. Vous pouvez également choisir un autre tube de sortie en fonction des exigences spécifiques de la culture.
REMARQUE: ChoisissezLa taille des pores OT pour enlever seulement moyen et les débris cellulaires, les agrégats de cellules en culture (comme décrit dans la section 6 et publication 3 pour plus de détails).
- Assembler autoclavables ensembles de tubes de perfusion de fluorure de polyvinylidène (PVDF) connecteurs de tubes et de tubes résistant à la pompe péristaltique. La longueur de la section dépend de la distance entre les différents composants.
REMARQUE: Faites attention lors de la sélection variété de tubes pour assurer la durabilité et la fiabilité pour des expériences à long terme. - Assembler le tube fixé à partir de trois parties: une ligne d'alimentation, une ligne de déchets, et une ligne d'échantillon.
- Assembler la ligne d'alimentation en utilisant deux diamètres de tubes (L / S 14 et L / S 13). Utiliser le rapport L / S 14 pour le tube primaire qui couvrira la distance du bioréacteur au réservoir de fluide, et insérer une courte longueur de L / S 13 au milieu de la longueur du tube pour la section de pompe à l'aide des adaptateurs de PVDF appropriés.
- Utilisez standard PVDF tuyau de fer barbelé tubing d'adaptateurs pour joindre deux morceaux de L / S 14 colonne de part et d'autre de la section de pompe la plus courte (L / S 13) tubulure.
NOTE: Sinon, toute la longueur du tube pourrait être plus petit diamètre L / S 13 tubes, et sur toute la longueur du tube pourrait être remplacé lorsque l'intégrité pompe-section est en question.
- Assembler la deuxième section de tube pour l'élimination des déchets en utilisant un plus grand diamètre (L / S 16) tube et insérez une courte section de L / S 14 tube au milieu de la section de pompage. Cela se fait de la même manière que la ligne d'alimentation en utilisant l'assemblage des adaptateurs de tuyaux à barbillons-PVDF, ou encore à l'aide d'une longueur continue de la taille du tuyau de pompe souhaité, et de le remplacer si nécessaire.
NOTE: Si la même pompe et la tête de la pompe sont utilisés pour le circuit d'alimentation et le circuit des déchets, la section de la pompe des lignes de tubes d'enlèvement des déchets doit être un plus grand diamètre que la section de la pompe de la ligne d'alimentation. Cela garantit que le débit de la pompe d'évacuation est plus rapide que le débit d'alimentation, et éviter le puissantial pour les grands changements dans le volume de la culture, et de réduire le risque de débordement. - Assembler la dernière composante de l'ensemble de tubes: un ensemble de collecte d'échantillons.
- Cette procédure décrit une coutume assemblé échantillonner système portuaire; alternativement, un port d'échantillonnage stérile peut être acheté auprès de divers fournisseurs.
- Construire l'ensemble de trois courts (~ 6 cm) L / S 14 longueurs de tubes reliés entre eux avec un connecteur PVDF de type T, et deux petits colliers de serrage sur deux des longueurs de tubes.
- Fixer un filtre à gaz stérile pour l'évacuation de gaz à l'une des longueurs serrées, et l'autre est utilisé pour la connexion à une seringue d'échantillonnage stérile (filtres à gaz stériles peuvent doivent être ajoutés dans une armoire bio-sécurité après stérilisation autant de filtres stériles ne sont pas autoclavable).
- Connecter la troisième extrémité à un connecteur inoxydable échantillon d'acier fixé sur le couvercle du bioréacteur.
- Autoclave l'ensemble d'échantillonnage étant connecté au bioréacteur avant de commencerl'expérience (voir l'étape 3 ci-dessous).
- Utilisez cet ensemble pour recueillir des échantillons stériles du bioréacteur au besoin sans perturber le processus d'alimentation continue.
3. autoclaves Tous les matériaux
- Préparer tous les composants de bioréacteurs pour la stérilisation en autoclave.
- Collecter des composants individuels pour la stérilisation. Moyen et déchets réservoirs (assemblés à partir de l'étape 2.1.1), 250 ml spinner flacon (assemblé à partir de 2.1.1), les couvercles modifiés nécessaires (assemblés à partir de 2.1.3), le tube d'écoulement (décrit dans 2.1.4), trois ensembles de tubes ( assemblé dans les sections 2.2 through2.5), le tube d'écoulement (selon les besoins pour l'alimentation en continu).
- Assembler spinner flacon avec tous les composants et être sûr que le tube d'écoulement est fermement attaché à l'intérieur du flacon spinner (décrit dans la section 2.1.4), et fixer le port personnalisé assemblé d'échantillonnage (section 2.5), ou tout autre point d'échantillonnage vers le haut du couvercle .
- Enveloppez la totalité de l'ensemble spinner flacon avec automatériau clave wrap et autoclave indiquant la bande. Assurez-vous que l'enveloppe étanche à l'air. NOTE: La feuille d'aluminium ou d'un matériau similaire peuvent être utilisés pour couvrir les extrémités individuelles de chaque port d'accès dans le couvercle du bioréacteur pour préserver la stérilité du connecteur / se termine lorsque déballant et en cas de non-connectés aux ensembles de tubes à l'intérieur de l'incubateur.
- Assembler les couvercles modifiés des moyennes et des déchets des réservoirs puis attacher les bouteilles en verre respectives. Couvrez-les en utilisant une feuille d'aluminium et de l'autoclave indiquant bande.
- envelopper individuellement les ensembles de tubes (section 2.2 à 2.5) avec une pellicule autoclave et du ruban adhésif pour aider à l'assemblage final. La feuille d'aluminium ou d'un matériau similaire peuvent être utilisés pour envelopper les extrémités individuelles de chaque tube fixé pour préserver la stérilité du connecteur / se termine lorsque dépliage.
- Autoclave tous les articles emballés à l' aide d' un cycle d'autoclave sec standard (par exemple, "Gravity" réglage avec ~ 15 psi à 121 ° C pendant 30 minutes ou plus).
NOTE: Ne fixez pas stérileles filtres avant autoclavage sauf si elles sont confirmées pour être sûr autoclave.
4. Formation Spheroid
Remarque: cette technique est similaire à ceux décrits dans la littérature 17 - 19,21,50 - 52 pour d' autres cultures de cellules de mammifères. Toutes les procédures ci-après stérilisation doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire et en utilisant des gants stériles pour maintenir des conditions stériles pour la culture cellulaire.
- Pour toutes les conditions, la culture et développer des cellules β-TC6 dans des cultures adhérentes standard (décrites par le fournisseur) jusqu'à ce que des quantités suffisantes de cellules sont obtenues pour ensemencer le nombre désiré de bioréacteurs.
- Assembler le bioréacteur d'alimentation en continu avec le tube de sortie comme le montre la figure 1 et décrit dans la section 2, et connecter le port d'échantillonnage sur le couvercle d'échantillonnage. REMARQUE: le tube de sortie et de prélèvement ensemble d'orifice doivent être ajoutés à la bioreactou pour l'alimentation en continu avant la formation de sphéroïde et doit être tiré vers le haut hors du milieu de culture jusqu'à ce que l'alimentation continue est démarrée.
- Stériliser l'ensemble SSB modifiée par autoclave (décrit dans la section 3).
- Fixer les évents stériles (0,22 um ou plus petits filtres stériles) aux endroits appropriés sur les couvercles de la fiole centrifuge, et les vaisseaux moyens et déchets.
NOTE: Ceci est important pour éviter le blocage de la vapeur, et pour permettre l' échange de gaz entre l'incubateur (5% de CO 2) l' environnement et le bioréacteur. L'échange de gaz est nécessaire pour maintenir le bon pH lors de l'utilisation des médias de bicarbonate tamponnée.
- Recueillir les cellules par trypsinisation douce en utilisant 0,25% (p / v) de solution de trypsine EDTA 0,53, à température ambiante , aidée par agitation mécanique pendant 2 à 3 min, et la semence dans les bioréacteurs , à une densité d'environ 1,3 x 10 6 cellules / ml 200 dans un milieu de culture ml.
- Déplacer des flacons désignés de l'incubateur etdans une armoire Bio-sécurité.
NOTE: Toute la culture et les manipulations cellules doivent être faites dans une armoire Bio-sécurité en utilisant une technique stérile appropriée. - Éliminer le milieu de culture à partir des flacons par aspiration.
- Laver les cellules par pipetage 5 ml de solution saline tamponnée phosphate (sans Ca ++ ou Mg ++), dans le flacon et le rinçage à travers les cellules à la surface, puis aspirer le PBS.
- Ajouter 3 ml de solution de trypsine-EDTA à chaque flacon qui seront recueillies (typiquement environ 10x 175 cm 2 flacons T).
- Laisser les cellules récoltées à incuber à température ambiante pendant 2 - 3 min dans l'armoire bio-sécurité.
- Agiter doucement à la main pour desserrer les cellules de la surface du flacon et recueillir les cellules en ajoutant 6 ml de milieu de culture (avec sérum) dans le ballon, et transférer les cellules dans un tube de 50 ml. Quand on tube de 50 ml est plein, utilisez un autre tube de 50 ml jusqu'à ce que toutes les cellules nécessaires ont été recueillies (environ un tube de 50 ml sera nécessaire pour tous les 5 T-175 flaconsrecueillies).
- Doucement centrifuge (environ 50 x g), les suspensions de cellules recueillies pour sédimenter les cellules.
- Aspirer le milieu restant, laissant le culot intact.
- Recueillir toutes les cellules dans un seul tube en remettant en suspension les culots dans un (contenant du sérum), le milieu de culture à l'aide d'une pipette, et le transfert de toutes les pastilles dans le même tube.
- Compter la densité cellulaire en utilisant un hémocytomètre standard avec une coloration au bleu trypan comme décrit dans la littérature 53.
- Ajouter nombre désiré de cellules totales à stériles SSB pour chaque état (1,3 x 10 6 cellules / ml a été les densités cellulaires de départ ciblés pour cette démonstration).
- Ajouter moyen (avec la concentration de glucose souhaité, dans ce cas, le taux de glucose moyen dans la gamme physiologique, nous avons utilisé) pour SSB en utilisant une pipette pour atteindre le volume de la culture totale désirée (200 volumes ml de culture a été utilisé pour ces études).
NOTE: Pour ces alimentés en continu SSB étudie la cu ltures ont été ensemencées en utilisant un "low-glucose» version modifiée du milieu de culture (100 mg / dl). Cela a permis aux cultures de commencer à la concentration souhaitée de glucose cible plutôt que de commencer avec un milieu "haut glucose" et en attente de la consommation de glucose pour amener les niveaux de glucose vers le bas dans la gamme physiologique pour commencer l'alimentation. Tout autre support pour l'alimentation dans ces études ont utilisé la norme "haute glucose" moyen (500 mg / dl). - Déplacer SSB avec des cellules sur une plaque d'agitation dans un incubateur de culture cellulaire.
- Déplacer des flacons désignés de l'incubateur etdans une armoire Bio-sécurité.
- Les cellules de culture dans les bioréacteurs sans alimentation pendant 3 jours à 37 ° C, avec 5% de CO 2, 100% d' humidité relative, et un taux de 70 tours par minute d'agitation pour permettre sphéroïdes pour former.
NOTE: Aucune prolifération significative doit être observée pendant la période de formation de sphéroïde de trois jours. - Après la formation sphéroïde, diviser sphéroïdes entre les bioréacteurs avec des conditions de culture désirées.
- Autoclave ou de gaz stériliser tous les composants, et le montage dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant des techniques stériles (étapes 2-4).
- Après la formation sphéroïde, retirez le SSB de l'incubateur et assembler les composants du système d'alimentation en continu dans une enceinte de sécurité biologique.
- Remplissez d'abord le réservoir milieu frais avec le milieu de culture souhaitée, puis se connecter à un côté de la ligne d'alimentation. Assurez-vous également que le réservoir du milieu frais est correctement ventilé avec un filtre stérile.
- Connecter un côté de la ligne d'alimentation à l'orifice d'entrée d'alimentation sur le bioréacteur d'une façon stérile. Un filtre stérile doit être installé entre la conduite d'alimentation et l'orifice d'entrée du réacteur biologique pour filtrer le milieu avant son entrée dans le bioréacteur.
- Connectez la ligne de déchets vers le bioréacteur à tube de sortie et le réservoir de déchets moyen, et veiller à ce que le réservoir de déchets est correctement ventilé avec un sterilFiltre e.
- Déplacer l'ensemble de l'enceinte de sécurité biologique (ce sera probablement besoin de deux personnes pour transporter tous les vaisseaux et les tubes), et de mettre tous les composants pour la culture à long terme.
- Mettre le SSB sur la plaque d'agitation à l' intérieur de l'incubateur en utilisant les mêmes paramètres de culture pour la formation de sphéroïde (37 ° C, 5% de CO 2, à 100% d' humidité et à 70 tours par minute). NOTE: Il peut être nécessaire de déconnecter temporairement les segments de tube du bioréacteur si les lignes doivent fonctionner à travers des trous dans le côté de l'incubateur plutôt que par l'intermédiaire du joint de la porte. Cela peut être effectué d'une manière aseptique, en enveloppant les extrémités des ensembles de tubes avec une feuille d'aluminium avant l'autoclavage (étape 3), et l'attente pour attacher le côté bioréacteur des sections d'alimentation et le tube de déchets jusqu'à ce que le bioréacteur est à l'intérieur de l'incubateur. Les lignes de tubes peuvent être mises en place, et la feuille d'aluminium peuvent être éliminés à l'intérieur de l'incubateur et rapidement attachés au bioréacteur.
- Exécuter extrémités restantes des ensembles de tubes (ceux non connectés au couvercle du bioréacteur) à travers l'orifice d'accès de l'incubateur (pass-through), ou par l'intermédiaire d'un cran dans le joint de la porte de l'incubateur.
- En dehors de l'incubateur (dans une enceinte de sécurité biologique à proximité si possible), connecter rapidement la ligne d'alimentation vers le réservoir du milieu frais, et la ligne de déchets vers le réservoir de déchets moyen, et veiller à ce que le réservoir de déchets est correctement ventilé avec un filtre stérile. NOTE: Pour ce faire d'une manière aseptique, retirez la feuille d'aluminium à partir des tubes et des vaisseaux connecteurs et se connecter aux navires respectifs le plus rapidement possible (surtout si cette connexion doit être effectuée en dehors de l'enceinte de sécurité biologique).
- Mettez le réservoir du milieu frais (rempli de milieu d'alimentation souhaitée) à l'intérieur à proximité mini-réfrigérateur. Assurez-vous que les lignes d'alimentation et les déchets sont en mesure de sortir de l'incubateur et entrer dans le réfrigérateur sans empêcher les portes de chaque de se fermer. Il est également essentiel que l'alimentation lines ne sont pas pincés fermés par les portes de du réfrigérateur ou de l'incubateur.
NOTE: Le milieu utilisé pour ces études était le taux élevé de glucose standard (500 mg / dl) milieu de culture recommandé par le fournisseur pour ce type de cellule. Tout milieu de glucose élevé peut être utilisé en fonction des besoins spécifiques du type de cellule cultivée. La concentration en glucose du milieu d'alimentation doit être relativement élevée (2x ou plus) que la concentration souhaitée dans la culture en tant que système d'alimentation repose sur l'augmentation du taux de milieu de glucose élevé d'alimentation pour maintenir les niveaux de glucose adéquates dans les cultures, tout en maintenant les taux d'alimentation raisonnables . - Ensuite, le réservoir de milieu de déchets peut être mis sur le dessus de banc à l'extérieur de l'incubateur dans un emplacement idéal.
- Ensuite, placer la partie "pompe" des conduites d'amenée et de déchets dans la tête de pompe assurant l'orientation correcte de telle sorte que les lignes d'alimentation seront pompe à fluide à partir du réservoir de milieu frais dans le SSB, et les lignes de déchetspompera moyen de la SSB et au réservoir de fluide de déchets.
- Tourner la pompe à la vitesse d'avance souhaitée.
- Calculer le taux d'alimentation en utilisant l'équation de débit d'alimentation ajusté décrit dans la littérature 3 et dans la section prévue des résultats représentatifs ci - dessous.
- Utiliser les informations les plus récentes de comptage de cellules (mode opératoire décrit dans l'étape 5), ainsi que la prédiction de la croissance, et les mesures moyennes de glucose pour estimer la vitesse d'alimentation nécessaire pour maintenir la concentration de glucose souhaité dans la culture.
NOTE: Les taux de croissance des cellules et des taux de consommation de glucose devront être obtenus avant de faire ces procédures. - Réglez la vitesse de la pompe en fonction du débit d'alimentation calculée.
- Répétez le calcul du taux d'alimentation et d'ajuster la vitesse de la pompe pour chaque point d'échantillonnage (tous les trois jours pour la méthode décrite).
6. Comptage des cellules, la viabilité et les mesures de concentration de glucose
<ol>- En quittant le SSB alimenté en continu à l'intérieur du bioréacteur, fixer une seringue stérile (un volume seringue de 5 ml a été utilisée pour ces études) pour une connexion non-filtrée de l'orifice d'échantillonnage.
- Déplacer le tube d'échantillonnage vers le bas dans le milieu de culture.
- Débrider la section de tube allant à la seringue, et de retirer le volume total souhaité de l'échantillon.
- Déplacer le tube d'échantillonnage de façon à ce qu'il ne soit plus immergée dans la culture, et de continuer à retirer la seringue jusqu'à ce que l'air est enlevé.
- Fixer le tube qui alimente la seringue, et retirer la seringue contenant l'échantillon, et mettre de côté.
- Pré-charger une seconde seringue stérile fraîche avec de l'air, et l'attacher sur le côté du filtre stérile de l'orifice d'échantillonnage.
- Débrider le tube va du côté seringue-filtrel'orifice d'échantillonnage, puis purger l'orifice d'échantillonnage en chassant l'air doucement dans la seringue à travers le filtre stérile. Cela garantit que le port d'échantillonnage sera clair de tout milieu résiduel.
- Re-serrer le tube passe au filtre, débrancher la seringue stérile et le jeter.
- Ajouter du milieu (avec sérum) àl'échantillon pour la dilution si nécessaire.
- Compter les cellules, et calculer la viabilité des cellules en enregistrant des cellules vivantes (non colorées), et les cellules mortes (colorées) indépendamment (viabilité% = cellules vivantes / cellules au total).
- Prendre des mesures de glucose comme décrit par les instructions de compteurs de glucose en substituant le milieu de culture pour le sang.
- Trempez la bandelette de test dans le milieu à tester (collectées à partir d'échantillons de comptage ci-dessus), et répéter pour le nombre désiré de répétitions (trois répétitions sont recommandées).
- Testez aussi bien le milieu frais et moyenne des déchets pour les concentrations de glucose.
NOTE: Pour certains compteurs, des mesures inférieures à 20 mg / dl (seuil détectable de l'appareil de mesure), peut être observée comme une erreur dans la sortie du compteur.
7. Spheroid Mesures Tassement de taux
- Pour veiller à ce que cell grappes ne sont pas éliminées par le système d'alimentation en continu, mesurer la vitesse de sédimentation des sphéroïdes ß-TC6 en observant leur sédimentation dans un grand diamètre de pipette en plastique.
- la culture des cellules ß TC6 dans des bioréacteurs SSB pour former des sphéroïdes comme décrit ci-dessus.
- Après 3 jours de culture, prendre 30 ml des échantillons de la suspension sphéroïde et placer dans un tube de 50 ml.
- Pipeter doucement vers le haut et vers le bas en utilisant une grande pipette diamètre de 25 ml pour répartir uniformément en suspension, puis arrêter pipetage avec la suspension à un niveau connu dans la pipette (par exemple, 20 ml marque), puis enregistrer le temps pour tous les sphéroïdes à régler 5 cm.
- Répétez cette procédure suffisamment de fois pour atteindre la confiance statistique (généralement n> 3).
NOTE: Pour les études biologiques, une valeur p inférieure à 0,05 est considérée comme statistiquement significative lorsque l'on compare les mesures. L'erreur standard de la moyenne a été utilisée pour les erreurs de déclaration, et l'étudiant-t test non apparié les deux taileda été utilisé pour comparer les conditions pour les données présentées.
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Representative Results
Les niveaux et les fluctuations de la glycémie moyenne Limiter l' expansion des cellules dans les cultures standard SSB
Les niveaux de glucose dans des cultures statiques varient et les cultures SSB pendant toute la période de culture de 3. Ces fluctuations intensifient avec l'augmentation du nombre de cellules au cours de la période de culture de 21 jours et étaient presque identiques dans les deux cultures statiques et SSB. Ces observations sont présentées dans notre précédente publication 3. Les taux de glucose peuvent être super-physiologiques pendant la durée de la période de culture pour les deux méthodes. Parce que cette exposition chronique peut inhiber la croissance des cellules 54, un système d'alimentation en continu a été développé pour éliminer les fluctuations de la glycémie et d' améliorer le contrôle des nutriments pendant la culture sphéroïde.
Système d'alimentation continue pour la culture Spheroid
l'addition en continu du milieu frais et en enlevant le vieux médium pendant la durée de la période de culturepeut être accompli en utilisant un système de réapprovisionnement moyen simple. Le système décrit dans le Procédé 2 et représenté sur la figure 1 utilise une pompe et un tube fixé à réapprovisionner en continu moyen et un tube de sortie séparé pour éliminer en continu le milieu , tout en empêchant le retrait de sphéroïdes de la culture. L'entrée du milieu était au côté opposé du réacteur afin de minimiser tout risque d'interférer avec le bon fonctionnement de l'AT, et pour permettre un mélange complet. Du milieu frais (avec taux élevé de glucose, 450 mg / dl) a été maintenue à la température du réfrigérateur pour assurer une stabilité à long terme et ajouté en continu à la culture à travers une entrée de fluide avec un taux de remplacement complet milieu tous les trois jours pour reconstituer les éléments nutritifs. Ce système limite les manipulations et les interventions nécessaires au cours de la période de culture en remplaçant le processus manuel de remplacement moyen par lot avec un processus continu 3,22,23. Le milieu froid est entré dans le bioréacteur en petits volumes sur time (0,046 ml / min) par rapport au volume total de culture (200 ml), donnant à chaque "goutte" de temps moyen ajouté pour équilibrer la température avec le milieu de culture environnante qui était à 37 ° C. Cela a assuré que le milieu froid ajouté ne pas réduire la température globale de la culture étant maintenue dans l'incubateur. L'agitation du milieu de culture a également augmenté l'efficacité du transfert de chaleur et à une meilleure homogénéité de température dans ces cultures. l'entretien de la température pourrait être un problème si les taux d'alimentation très élevés ont été utilisés avec de petits volumes de culture, mais ces conditions improbables ont pas été testées pour ces études. Le volume de la culture a été maintenue à un niveau constant dans le système d'alimentation en continu en faisant en sorte que le taux moyen de retrait moyenne est égale à la vitesse d'alimentation. Le système utilisé pour ces études ont effectivement supprimé milieu à un débit supérieur au débit d'alimentation, car la section de tube d'extraction utilisé des tubes de plus grand diamètre pour la section de pompe. En dépit de la plus rapide removal taux, le volume de culture a été maintenue en ajustant le niveau du tube d'écoulement à l'intérieur du réacteur au niveau du volume de la culture désirée. ajoutant en continu du milieu frais à la SSB a entraîné une légère augmentation du niveau moyen dans le réacteur, et lorsque le milieu a atteint le niveau de l'OT, le milieu a été retiré du réacteur à un rythme plus rapide. Le milieu a été retiré à travers le verre poreux OT, en laissant les sphéroïdes de cellules en culture jusqu'à ce que le niveau moyen est tombé en dessous du fond de l'AT. Ce système évite la complexité de l' utilisation de débit et de volume des capteurs ténus pour contrôler les vitesses de pompe, et est la norme pour une utilisation avec un appareil de culture à base de nombreux SSB 47,48. L'AT a été conçu pour faire en sorte que les sphéroïdes sont retirées de la culture à travers le circuit d'évacuation, et la taille des pores et la densité dans le tube en verre fritte étaient assez grandes (40% et 40 - 60 um, respectivement) afin de faire en sorte que la vitesse d'écoulement linéaire était inférieure à la vitesse de sédimentation des sphéroïdes noused pour ces études de culture. Le flux linéaire a été calculé comme décrit en détail 3. La vitesse moyenne linéaire moyenne à travers les pores dans l'AT a été calculée à 0,17 cm / min, ce qui était beaucoup plus lente que la vitesse de sédimentation sphéroïde observée le plus lent. La vitesse de sédimentation moyenne a été mesurée comme décrit dans la méthode 7 et était de 2,53 ± 0,26 cm / min pour les sphéroïdes utilisés dans ces études. Les sphéroïdes ont été observées à augmenter en taille que la culture progresse, et ces sphéroïdes grandes réglées plus rapidement en raison de l'augmentation de leur rapport masse-traînée, ce qui diminue encore la possibilité d'enlèvement par l'OT. Certains sphéroïdes ont été piégés dans les pores plus bas sur les bords extérieurs de l'Ancien Testament, mais cela a été principalement due à des chocs mécaniques lorsque le tube d'écoulement plonge dans le milieu agité. Cela n'a pas empêché le bon fonctionnement de l'OT, et n'a pas contribué à une perte mesurable de sphéroïdes dans les cultures testées. L'OT pour ces études a été nettoyé après chaque étude, (avec chasse d'eau DI), et remplacé après utilisation pour deux études de culture afin d'éviter le risque de diminution de la fonction. L'OT pourrait être remplacé après chaque étude si sphéroïdes sont observées à obstruer les pores au cours d'une étude spécifique (cela n'a pas été observée dans les travaux présentés). En raison de la suppression cyclique du milieu à l'aide de cette méthode, le volume de milieu de culture fluctue d'autant que 6%. Les fluctuations sont causées par la tension superficielle du milieu qui a permis à l'AT pour éliminer un peu plus après que le niveau moyen moyen moyen est tombé au-dessous du fond de l'AT.
L' élimination Fluctuations des nutriments Amélioration de la croissance cellulaire dans les cultures SSB
le remplacement en continu du milieu dans les cultures de SSB en utilisant le système décrit ci-dessus une augmentation des rendements de culture au cours de la période de culture de 21 jours, par rapport aux cultures standards SSB. Le taux d'alimentation a été maintenue constante pendant toute la période de culture à un taux qui a remplacé l'ensemble volu de culturemoi tous les trois jours pour être comparable aux cultures SSB lots nourris. L' élimination des fluctuations de nutriments ont donné lieu à une augmentation des rendements de cellules (figure 3) en dépit de la forte concentration de glucose 3. Taille Spheroid a également été mesurée à la fin de la période de culture par évaluation microscopique 2D (microscopie optique standard décrit dans la littérature 3), et les sphéroïdes dans les cultures CF-SSB ont été significativement plus importante (p <0,02, test t de Student) que statique ou de cultures SSB standards tel que rapporté dans la littérature 3. Ces observations confirment les données de cellule comptage suggérant un taux de croissance plus élevé dans les cultures CF-SSB tandis que la viabilité a été maintenue au même niveau élevé (96,23 ± 0,85%), indépendamment de l'état de la culture. Le SSB alimenté en continu (CF-SSB) système de culture a éliminé les fluctuations des éléments nutritifs dans les cultures sphéroïde, et l'amélioration des taux de croissance cellulaire, mais les taux de glucose est resté super-physiologique qui peut avoir empêché encore imp rovement dans l' expansion des cellules (figure 2). Pour améliorer encore sur le système de culture CF-SSB, un algorithme a été utilisé pour régler le débit d'alimentation pendant la période de culture dans le but d'améliorer le contrôle des niveaux de glucose dans les cultures SSB.
Calcul du taux ajusté RSS
Plusieurs facteurs peuvent être pris en compte pour le calcul du taux d'alimentation pour maintenir les niveaux de glucose cohérents. Les facteurs spécifiques d'intérêt peut être modifié pour une étude donnée et pour une lignée cellulaire particulière. Aux fins de cette démonstration, nous avons étudié le taux de croissance et la consommation de glucose déterminée à partir des cultures précédentes, ainsi que les niveaux de glucose réels au moment de l' ajustement 3. les ajustements de taux d'alimentation peuvent être effectués à tout intervalle dans le temps. Pour cette démonstration, les échantillons ont été prélevés et le débit d'alimentation a été ajusté à tous les trois jours sur la base des calculs séquentiels décrits de la manière suivante.
t "> Calcul du taux de croissance prévueL' équation 1 indique la croissance des cellules pendant une certaine période de la culture, avec le nombre de cellules prédite (N 2) qui représente le nombre total estimé de cellules en culture à un certain moment dans le futur. Cette méthode utilise une approximation linéaire du taux de croissance où le nombre de cellules en cours (N 1) est ajoutée au taux de croissance estimé des cellules dans les cultures sphéroïde (R g) , multiplié par la durée de la culture (t 2 -t 1).
(1)
Calculé de base Débit d' alimentation
Le débit d'alimentation de référence (R F) a été calculée en utilisant l' équation 2 en estimant la consommation de glucose dans la culture pendant la période de culture (numérateur) et en divisant par la concentration en glucose dans le milieu d'alimentation (C F 1) par la moyenne pondérée de N 1 et N 2 d'après l' équation 1. Ce taux de consommation a ensuite été divisée par la concentration en glucose (C F) , dans le milieu d'alimentation pour calculer le taux d'alimentation moyen moyen nécessaire pour remplacer le glucose consommé au cours de la même période de culture.
(2)
Réglage de débit d'alimentation avec des niveaux de glucose observés
D' autres ajustements ont été apportés à la vitesse d'alimentation de base pour tenir compte des niveaux de glucose mesurés (C 1) au point de temps choisi en utilisant l' équation 3. Ce débit d'alimentation de glucose ajusté (GAFR) peut être utilisé pour maintenir les niveaux lorsque les changements imprévus dans la croissance ou la mort se produire dans la culture. Cette equatio n a incorporé une constante de commande (X) et une valeur de 0,5 a été utilisé pour ces données 3. C 1 représente la concentration en glucose mesurée dans le milieu de culture le jour de l' échantillon, et C , D représente la concentration en glucose du milieu cible. La valeur finale ajuste la vitesse d'avance prédite à partir du deuxième calcul.
(3)
Figure 1: Schéma du système d'alimentation en continu avec Outflow Tube. (A) Schéma du système démontrée. (B) filtre en verre fritté placé sur le tube d'écoulement pour permettre au milieu d'être retiré de la culture sans perte de cellules. Figure reproduite avec la permission. 3
/files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
Figure 2:. Les mesures de glucose pour SSB, CF-SSB, et ajusté Cultures CF-SSB (A) des mesures de glucose moyen de cultures de sphéroïdes ß-TC6 utilisant, SSB et CF-SSB méthodes de culture statiques et d' alimentation avec un milieu standard élevé de glucose. L'alimentation en continu est en mesure d'éliminer les fluctuations de la glycémie, mais les taux de glucose moyen dans le changement de milieu de façon spectaculaire au cours de la période de culture, et bien au-dessus la plage physiologique (indiquée par la barre grise). L'alimentation ajustée est capable d'éliminer les fluctuations ainsi que de maintenir les concentrations de glucose à proximité des niveaux physiologiques pendant la durée de la période de culture. Les barres d'erreur pour les mesures de glucose sont trop petits pour être visibles sur l'échelle indiquée (erreur standard ≤ 4% pour toutes les mesures). Les données des chiffres sont présentés dans la publication précédente avec la permission. 3
Figure 3: le nombre de cellules de SSB, CF-SSB, et ajusté Cultures CF-SSB avec la croissance ajusté Flux Taux croissance cellulaire rapporté comme facteur de variation du nombre de cellules pendant la période de culture de 21 jours comparant SSB avec des changements moyennes régulières contre débit d'alimentation constant. cultures SSB et taux d'alimentation ajusté cultures SSB. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne, et les valeurs p rapportées sont pour un test statistique non apparié bilatéral étudiant-t. Reproduit avec la permission. 3
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Discussion
Générer des produits de cellules de mammifères pour la production d'agents biologiques et des thérapies cellulaires nécessite la culture et la surveillance des cellules de mammifères à grande échelle 55-58. En outre, ces applications nécessitent des conditions de culture définies et validées. Il suffit d'augmenter le volume des cellules en utilisant des technologies de recherche ne sera pas répondre à toutes ces exigences. moyennes modifications manuelles causant des fluctuations en nutriments et l'accumulation des déchets réduisent la qualité des cellules, la viabilité et le rendement. L'utilisation de bioréacteurs est bien établie pour la culture commerciale de micro-organismes pour des applications bio-pharmaceutiques et des stratégies similaires ont été appliquées à des cultures de cellules de mammifères. L'interaction complexe de cellules de mammifères avec leur environnement nécessite des modifications spécifiques pour réguler les niveaux de nutriments afin d'optimiser le potentiel d'expansion cellulaire.
Pour répondre à ces questions, nous avons développé un straightfométhode rward pour maintenir les niveaux de glucose dans une fourchette cible spécifique, se rapprochant des niveaux physiologiques dans un bioréacteur de suspension agité avec un mécanisme perfusion d'alimentation à taux variable. Pour ce faire, les sphéroïdes d'une lignée de cellules bêta ont été obtenues dans un bioréacteur de suspension agité. Un système de perfusion d'alimentation a été utilisé pour fournir un mécanisme d'alimentation en continu pour remplacer les procédés d'alimentation en discontinu standard. Les taux de croissance cellulaire ont été observées, et utilisées pour prédire approximativement les taux d'utilisation du glucose. le taux de glucose réel ont été également mesurés au cours du temps dans la culture pour ajuster les débits d'alimentation en réponse aux nutriments réels consommés et produits métaboliques déposés dans le milieu par les cellules. Cette méthode empêche les fluctuations des taux de glucose observés avec d' autres systèmes statiques et SSB 3 où les niveaux de glucose ont fluctué de façon spectaculaire avec changements de milieu tous les 3 jours. En utilisant les stratégies batch-alimentation, les concentrations de glucose a chuté jusqu'à 275 mg / dl sur trois jours, au stade avancés dans l'expansion de 21 jours. Ces fluctuations des taux de glucose limités rendement cellulaire.
Calcul du taux moyen de remplacement pour la démonstration du système d'alimentation ajusté incorporé un taux de croissance établi et le taux de consommation de glucose pour la lignée cellulaire, ainsi que les observées (mesurées) densités de culture et les niveaux de glucose à chaque tétée point de temps. Pour différents types de cellules, ou pour plus de systèmes de culture de tissus complexes, ces hypothèses peuvent ne pas être vrai. Pour assurer un contrôle plus précis du glucose, l'algorithme comprend également un système de commande de rétroaction pour tenir compte de la variabilité des cultures individuelles. Limitations d'une méthode de perfusion en fonction du taux de croissance à elle seule, y compris l'impact de l'hétérogénéité dans l'utilisation du glucose pour les cellules à travers les sphéroïdes et les changements dans la consommation de glucose en fonction de paramètres tels que les cellules souches de différenciation, peuvent être atténués par un système de contrôle de rétroaction. Selon l'application, les cellules qui présentent Exponetaux de croissance ntial ou des profils de croissance plus complexes pourraient être mises en œuvre pour améliorer les performances de l'algorithme. Les hypothèses et les valeurs utilisées pour le calcul du débit d'alimentation peuvent être modifiés pour se conformer aux conditions de culture réelles.
Les méthodes présentées sont destinées à produire des cellules pour une application thérapeutique dans laquelle l'expansion et la culture de sphéroïdes serait pour une durée limitée, et les cellules elles-mêmes sont le produit .. Il peut être souhaitable que certains chercheurs pour développer en continu ou des cellules de culture en utilisant un procédé similaire, mais cela présenterait d'autres difficultés rencontrées pas pour ces études. Si cultivée pendant des périodes prolongées, les sphéroïdes continueraient à croître en taille, et la viabilité de certaines cellules dans le noyau du sphéroïde peuvent subir en raison de l'augmentation des éléments nutritifs et de diffusion de l'oxygène limitations. Ces cultures peuvent nécessiter d'autres manipulations de dissocier les grandes sphéroïdes pour éviter cette limitation lorsque les cultures à long terme sont souhaitées.Aucune diminution de la viabilité n'a été observée pour les sphéroïdes générées par ce protocole, ce qui suggère que cette limite n'a pas été atteinte au cours de la période de l'étude de la culture de 21 jours.
Pour les thérapies cellulaires, ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec des systèmes de régulation supplémentaires pour améliorer le rendement de la cellule, la fonction et la viabilité. Par exemple, le procédé SSB pourrait être combinée avec les technologies facilitant notamment des cultures en surface des micro-porteurs pour les cellules adhérentes pour améliorer le taux de croissance des cellules, ou l'encapsulation de cellules ou de sphéroïdes. En outre, des algorithmes d'ajustement plus complexes pourraient être mises en œuvre pour assurer un contrôle plus strict de la culture. L' ajustement d' alimentation pourrait être combiné avec le contrôle de plusieurs autres paramètres, tels que le pH, la concentration en oxygène dissous, la température et l' injection de réactifs pour apporter d' autres améliorations 59,60. Pour améliorer les résultats dans d' autres applications, cette méthode pourrait être automatisé 15,24, et les taux d'alimentation peut être calculée mle minerai ou moins souvent, d'autres conditions de culture de raffinage.
Processus de fabrication 61 - 63 doit être défini et soigneusement contrôlé pour fabriquer des produits biologiques reproductibles. L'utilisation d'un remplacement milieu continu peut être utilisé pour atténuer les fluctuations des nutriments critiques observés dans la production à grande échelle de cellules, et l'incorporation d'un système d'alimentation réglable peut mettre en oeuvre un plus grand contrôle sur l'environnement de la cellule, afin de maintenir les niveaux de nutriments souhaités. Le procédé décrit peut être utilisé avec d'autres cellules de mammifères pour les produits cellulaires et pharmaceutiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β TC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
| DPBS No Ca, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
| DMEM High Glucose (500 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
| DMEM Low Glucose (100 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
| L-glutamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
| Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco - Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
| T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
| NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used. | |
| Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
| Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
| 1 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
| 2 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
| 250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
| Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
| Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
| FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
| Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
| Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
| Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
| Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below. | |
| Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
| PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
| Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
| 25 ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
| Trypan Blue | Gibco - Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
| Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
| One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
References
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