Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التقطير السريع وعزل مكونات الدم الكامل في عينات تم الحصول عليها من إعداد المجتمعية

Published: November 30, 2015 doi: 10.3791/52227
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 5, 6, 7, 6, 1,2
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

Abstract

جمع ومعالجة عينات دم كاملة في وضع غير سريري يوفر فرصة فريدة لتقييم الأفراد التي تعيش في المجتمع مع ودون شروط قبل الإيجاد على حد سواء. معالجة سريعة من هذه العينات ضروري لتجنب تدهور المكونات الخلوية الرئيسية. وشملت هنا هي طرق في وقت واحد الطرفية الدم وحيدات النوى الخلية (PBMC)، DNA، RNA والعزلة المصل من سحب الدم واحد يؤديها في بيوت توافق المشاركون في منطقة العاصمة، مع معالجة شرع في غضون 2 ساعة من جمعها. وقد استخدمنا هذه التقنيات لمعالجة أكثر من 1600 عينات الدم العائد متسقة، مواد ذات جودة عالية، والتي تمت بعد ذلك استخدمت في نجاح مثيلة الحمض النووي، والتنميط الجيني والتعبير الجيني والتدفق الخلوي التحليلات. بعض الأساليب المستخدمة هي المعيار. ومع ذلك، عند دمجها في طريقة وصفها، أنها تمكن معالجة فعالة لعينات من المشاركين من بالسكان و / أو المجتمع المحليدراسات تستند الذين لن عادة يتم تقييمها في عملية إعداد سريرية. لذلك، هذا البروتوكول لديه القدرة على الحصول على عينات (وبعد البيانات) التي هي أكثر تمثيلا لعموم السكان.

Introduction

ووصفت دراسات متعددة الاختلافات في التعبير الجيني، الحامض النووي وفرعية الخلايا في الدم بين الأفراد مع وبدون العقلية (أو غيرها) الأمراض ل4/1. هذه الدراسات، ولكن قد تم الحصول عليها من المرافق الصحية التي يمكن أن يتعاظم الخلافات المرتبطة المرض نظرا لطبيعة عموما أشد من الأمراض التي مرضى يبحثون عن العلاج. بسبب التقدم في "OMICS" النهج، شهد العقد الماضي انفجار مصلحة في الحصول على عينات بيولوجية من المجتمع و / أو إعدادات الوبائية 5-7، من أجل توفير التقديرات القائمة على السكان من انتشار المرض وصورة أوسع لل المحددات البيئية لهذه الأمراض النفسية و / أو البدنية.

ويتمثل التحدي الرئيسي في هذا الصدد هو شرط للتجهيز السريع للعينات التي تم جمعها. تدهور الخلايا وحيدة النواة، مكونات الجهاز المناعي الرئيسية التي تواتراذ المستخدمة لتقييم صحة الفرد، ويبدأ فور سحب الدم مع انخفاض ملحوظ في الانتعاش بعد 2 ساعة من جمع 10/08. لمواجهة هذا التحدي، فإننا نقدم بروتوكول الأمثل في المكونات التي متعددة من الدم الكامل البشري يتم عزل في وقت واحد من العينات التي تم الحصول عليها في المنازل من الموضوعات يعيشون في منطقة حضرية كبيرة. ويستند هذا البروتوكول على لدينا تجميع وتعديل التقنيات الحالية، بما في ذلك تخزين جميع الكسور "إضافية" في حال تقنيات المستقبل تسمح لمزيد من العزلة / التحليلات. بينما وسائل أو أدوات بديلة يمكن أن تستخدم بدلا من الأساليب الفردية وصفها هنا، تلك التي وردت أثبتت أنها وسيلة موثوقة وفعالة لمعالجة العينات بطريقة عالية الإنتاجية. الكسور ذات جودة عالية (PBMCs، DNA، المصل، وRNA) من دم جديد يمكن أن تنتج في غضون 2 ساعة من جمع وجميع العينات-فحص جاهزة يمكن أن تكون متاحة في غضون 2 أيام (الشكل 1).

وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتمكين معالجة فعالة من العينات التي تم جمعها من المجتمع التي تعيش والمقيمين البالغين في مدينة ديترويت للاختبار في حي دراسة صحة ديترويت (DNHS؛ DA022720، RC1MH088283، DA022720-05-S1)، ومقرها السكان دراسة المحددات الاجتماعية والبيولوجية من اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) والأمراض النفسية الأخرى. انتشار اضطرابات ما بعد الصدمة في ديترويت هو أكثر من ضعف المعدل الوطني 11،12. تحديد المحددات البيولوجية للاضطراب ما بعد الصدمة في هذه الفئة من السكان قد يساعد على تطوير الدوائية المناسبة و / أو التدخلات المعرفي السلوكي لمساعدة أولئك الذين يعانون من هذا الاضطراب، سواء في هذه الفئة من السكان في المناطق الحضرية، والسكان عالية المخاطر الأخرى (على سبيل المثال، جنود العائدين من الحرب العسكرية). مختبرنا، وتقع سابقا في جامعة واين ستيت في مدينة ديترويت بولاية ميشيغان، واختير للمعالجة بناء على خبرتنا في التعامل مع عينات أنسجة جديدة مستمدة من مجموعة متنوعةمن المصادر، على ضرورة أن يبدأ تجهيز العينات في غضون 2 ساعة من جمع، ونحن على مقربة من مواقع تجميع. مع هذه الفرصة الفريدة في متناول اليد، كان هدفنا هو تحسين لتجهيز أكبر محصول DNA، RNA، في الدم وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) من كل عينة (أي ما مجموعه N = 1639 عينات أكثر من 5 موجات من جمع العينات). لا يمكن أن يؤديها الإجراءات الموضحة هنا في وقت واحد في وضع غير سريري، وبالتالي إنتاج بدءا المواد (انظر الجدول رقم 1 لمتوسط ​​الغلة) للعديد من التطبيقات المصب بما في ذلك ميكروأري، جينية، في الوقت الحقيقي RT-PCR، والتدفق الخلوي التحليلات.

الشكل 1
الشكل 1. عموما تدفق العمل. وتشمل العملية الشاملة يصور هنا لوجستيات الحصول على عينات الدم من تحديد بالتراضي participants لدماء رسم نفسه. يمكن أن تنتج من الدم الطازج كامل في غضون 2 ساعة لجمع ويمكن لجميع العينات مقايسة استعداد تكون متاحة في غضون أيام 2، ذات جودة عالية، والكسور (PBMCs، DNA، المصل، وRNA خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية). وعلاوة على ذلك، فإن الكسور إعدادها من خلال هذه الطريقة هي مناسبة للتخزين على المدى الطويل إذا عينات ليست لفحصها على الفور. الجدول الزمني كامل المذكورة هنا يمكن أن تكتمل في يوم واحد (~ 5 ساعة المجموع). ومع ذلك، فإن مثل هذا اليوم سيكون عمالة كثيفة للغاية خاصة لفني واحد لديه خبرة كبيرة مع التقنيات. وبالتالي، فإننا نوصي بتقسيم الإجراءات في يوم 1 بين اثنين على الاقل من الفنيين واستكمال تجهيز RNA في يوم 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد استعرضت دراسة صحة ديترويت الجوار والتي وافق عليها مجلس جامعة المؤسسي ميشيغان الاستعراضي. قدم كل المشاركين موافقة مستنيرة قبل مشاركتهم في الدراسة.

1. نظرة عامة

  1. صحيح توثيق جميع مراحل من التوظيف من خلال تحليل البيانات نقطة النهاية. أداء بروتوكولات يوم 1 في وقت واحد، والتحول مراحل ومتداخلة كما سمح الوقت. هو مكتوب في سلسلة من المراحل لتحسين كفاءة الأداء. الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن العملية برمتها.
    ويستخدم مصطلح "مشارك" في جميع أنحاء لدلالة على عينة الدم التي تم تحديدها دي مستمدة من فرد بالتراضي: مذكرة. الأوقات بين قوسين تشير أدناه اليدين في الوقت المحدد. أمثلة على ورقة تتبع وسجل عينة يمكن العثور عليها في الجداول التكميلية S1 و S2، على التوالي. يتم جمع عينات من قبل المختص بأخذ في المنازلمن الأشخاص الذي تعتبرهم بالتراضي المشاركين من قبل منسق الدراسة ونقلها إلى المختبر بواسطة ساعي (انظر المعلومات التكميلية (SI) 1 لمزيد من التفاصيل قبل المعالجة).

2. يوم 1 الإعداد

  1. إعداد المالحة 1X الفوسفات مخزنة (PBS).
  2. سخن كتلة الحرارة إلى 56 درجة مئوية.
  3. إعداد البروتيني (انظر SI 2) من خلال aliquoting 20 ميكرولتر إلى العدد المناسب من أنابيب microcentrifuge لتسليم هذا اليوم (2 لكل مشارك).
  4. ضمان المخازن AW1 وAW2 (مخازن غسل المنصوص عليها في عدة عزل الحمض النووي التي تزيد من نقاء DNA) تكون جاهزة للاستخدام، إضافة الإيثانول بنسبة 100٪ كما هو موضح على الملصق، إذا لزم الأمر.
  5. تهدئة الطرد المركزي المبردة إلى 4 درجات مئوية.
  6. استبدال الغطاء على زجاجة من برنامج تلفزيوني 1X مع المقدمة المطاط غطاء الحاجز واختراق الحاجز المطاطي مع تصاعد نقل، والإبقاء على سقف المسمار على رأس الصبان نقلكه لمنع التبخر. كرر مع زجاجة من حل استقرار RNA.
  7. وبعد إعداد المخازن المؤقتة، الطرد المركزي والحرارة كتلة، وتوثيق وقت التسليم vacutainer على ورقة تتبع عينة (انظر الجدول SI).

3. يوم 1: تجهيز عينة دم كامل لDNA، RNA PBMCs وخلايا الدم البيضاء (2 ساعة)

  1. نظرة عامة
    1. تخصيص وقت كاف للحد من التأخير بين سحب الدم ووقت بدء المعالجة. بدء تجهيز vacutainers تحتوي على Ficoll في غضون 2 ساعة من سحب الدم لتجنب زيادة في تلوث أحمر خلايا الدم وانخفاض في الانتعاش خلية الوحيدات.
    2. تحمل مجموعة من 2 vacutainers تحتوي على Ficoll جل الانحدار، 2 K 2 ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) vacutainers، و1 vacutainer المصل لكل مشارك الكبار. عند تسليم vacutainers إلى المختبر، لديها فني يوقع على ورقة تتبع القبول يدل على العينات. تضرعفي معالجة فورا مع وقت بدء موثقة على أساس لكل vacutainer على سجل العينة.
  2. مصل عزل المرحلة 1 (1 دقيقة)
    1. توثيق وقت البدء في سجل العينة (انظر الجدول SI 2). الطرد المركزي (مع الفرامل والتسارع OFF) 7.0 مل مصل (الأحمر) vacutainer (1 لكل مشارك) باستخدام الدوار الدلو المتأرجح مع قبعات الهباء الجوي (مستوى السلامة الحيوية 2؛ BSL2 معتمدة) لمدة 20 دقيقة، 1300 x ج، 4 درجة مئوية.
  3. عزل DNA المرحلة 1 (15 دقيقة)
    ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء العزلة، انظر بروتوكول الشركة الصانعة 13.
    1. توثيق وقت البدء. في ثقافة غطاء الخلية BSL2، عكس vacutainers التي تحتوي على هلام Ficoll 5 مرات ثم إضافة 200 ميكرولتر الدم كله من أعلى أحد vacutainers في كل من اثنين من 20 مكل من البروتيني (400 مجموع ميكرولتر لكل مشارك). ترك البروتيني + microcentrifuge لأنابيب الدم في غطاء محرك السيارة، انتقل إلى centrifugation من Ficoll تحتوي على vacutainers في الخطوة 3.4.1.
      ملاحظة: استخدم vacutainer مع أكبر حجم المجموعة، مع الأخذ في الاعتبار ضرورة تحقيق التوازن بين أجهزة الطرد المركزي (أي أنه قد يكون من الضروري إزالة 200 ميكرولتر من كل من vacutainers اثنين) عندما الغزل vacutainers في الخطوة 3.4.1. بالإضافة إلى ذلك، لضمان الفصل السليم أثناء تجهيز vacutainers الزرقاء، لا ينبغي أن يكون مستوى الدم المتبقية في vacutainer أقل من 2.5 بوصات فوق طبقة Ficoll.
  4. PBMC العزلة المرحلة 1 (1 دقيقة)
    1. توثيق وقت البدء (يجب أن يكون في حدود 2 ساعة من سحب الدم لتجنب زيادة في تلوث أحمر خلايا الدم وانخفاض في الانتعاش خلية الوحيدات) .Invert في Ficoll تحتوي على vacutainers 8-10 مرات. الطرد المركزي (مع الفرامل والتسارع OFF) وvacutainers (2 لكل مشارك) باستخدام الدوار الدلو المتأرجح مع قبعات الهباء الجوي (BSL2 معتمدة) لمدة 30 دقيقة، 1600 x ج، 22 ° C.
  5. العودة إلى غطاء محرك السيارة وإضافة 200 ميكرولتر العازلة AL إلى كل من أنابيب البروتيني + الدم microcentrifuge ل(الخطوة 3.3.1). كأب، وإزالة من غطاء محرك السيارة، دوامة 15 ثانية وفلاش زيادة ونقصان.
  6. احتضان 56 درجة مئوية في كتلة الحرارة، و10 دقيقة.
  7. إزالة أنابيب من كتلة الحرارة. فلاش زيادة ونقصان. العودة إلى غطاء محرك السيارة BSL2. إضافة 200 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪. كأب، وإزالة من غطاء محرك السيارة، دوامة 15 ثانية وفلاش زيادة ونقصان. الخطوات المتبقية يمكن أن تكتمل خارج غطاء محرك السيارة.
  8. تطبيق المحللة (في غضون 30 دقيقة من الخطوة 3.5.3) إلى عمود الدوران المسمى (في أنبوب جمع 2 مل). إغلاق الغطاء لتجنب التلوث المتبادل عن طريق الرذاذ الصادر. الطرد المركزي 6000 x ج، 1 دقيقة.
  9. تجاهل أنبوب جمع يحتوي على الترشيح ووضع عمود الدوران في الجديد 2 مل أنبوب جمع.
  10. إضافة 500 ميكرولتر العازلة AW1 إلى العمود دون تبليل المطلة، وأغلق الغطاء، وأجهزة الطرد المركزي 6000 x ج، 1 دقيقة.
  11. تجاهل أنبوب جمع يحتوي على ترشيحالشركة المصرية للاتصالات ووضع عمود الدوران في الجديد 2 مل أنبوب جمع.
  12. إضافة 500 ميكرولتر العازلة AW2 إلى العمود دون تبليل المطلة، وأغلق الغطاء، وأجهزة الطرد المركزي 20000 x ج، 3 دقيقة.
  13. تجاهل أنبوب جمع يحتوي على الترشيح ووضع عمود الدوران في الجديد 1.5 مل أنبوب جمع (غير المدرجة في المجموعة)، وأجهزة الطرد المركزي 20000 x ج، 1 دقيقة.
  14. تجاهل أنبوب جمع يحتوي على الترشيح ووضع عمود الدوران في الجديد 1.5 مل أنبوب جمع (غير المدرجة في المجموعة).
  15. إضافة 200 ميكرولتر الواق AE أو الماء لكل عمود واحتضان في RT لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي 6000 x ج، 1 دقيقة.
  16. كرر الخطوة 3.5.11 يبلغ حجمه في نفس أنبوب جمع.
  17. تجميع الحمض النووي مزال من الأعمدة 2 لكل مشارك. المحصول الكلي ~ 800 ميكرولتر لكل مشارك.
  18. تحديد العينات باستخدام مقياس الطيف الضوئي عندما يسمح الوقت.
  19. الحمض النووي قسامة كما هو مطلوب في 2 مل cryovials، وتوثيق تركيز كل على specimeن السجل. نقل cryovials إلى cryobox ومكان في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. توثيق وقت البدء الفريزر.
  • الكريات البيض عزل الحمض النووي الريبي المرحلة 1 (30 دقيقة)
    ملاحظة: إجراء في السلامة الأحيائية المستوى 2 شهادة الثقافة خلية غطاء محرك السيارة. للحصول على مزيد من التفاصيل حول هذه العزلة نرى تعليمات الشركة الصانعة 15.
    1. يخترق الحاجز المطاطي من EDTA vacutainer K 2 مع تصاعد نقل. الإبقاء على غمد والمسمار غطاء للاستخدام في الخطوة 3.6.11. وبعد الممارسات القياسية BSL2، واتخاذ الحذر لتجنب التعرض لمسببات الأمراض التي ينقلها.
    2. إرفاق موصل زلة الأبيض إلى أعلى ارتفاع النقل.
    3. تسمية مرشح مع المقابلة معرف مشارك ثم ربط مدخل (نهاية اشتعل) من مرشح للموصل زلة الأبيض.
    4. إرفاق 25⅝ G إبرة مغلفة إلى منفذ (نهاية مدبب) للمرشح. إعداد مرشح التجمع قبل تسليم تعجيل عملية إلى حد كبير، وبالتالي،ربط موصل زلة الأبيض إلى ارتفاع نقل، مشيرا الى التصفية، ثم إبرة مغمد ووضع التجميع في رف أنبوب الثقافة حتى استخدامها، فمن المستحسن.
    5. وبعد تجميع EDTA نظام أنبوب K 2، استل بأمان الإبرة (استخدم نهاية ملعقة معدنية). طعن الإبرة في فارغة 10 ملليتر دم اجلاء أنبوب جمع (المصل أنبوب المتلقي) وعكس أنبوب التجميع K 2 EDTA vacutainer / فلتر / استقبال. وبعد الممارسات القياسية BSL2، واتخاذ الحذر لتجنب التعرض لمسببات الأمراض التي ينقلها.
    6. السماح الدم إلى تصفية من خلال حتى مسح المقاطع على شكل وتد من تصفية الدم. الترشيح يستغرق حوالي 2 دقيقة، ويمكن وضعها في رفوف أنبوب الاختبار خلال الترشيح.
    7. إزالة عامل التصفية من التجمع. ترك الإبرة في الأنبوب الذي يحتوي على الترشيح والتخلص من التجمع بأكمله في حاوية الأدوات الحادة.
    8. نعلق حقنة 5 مل إلى ارتفاع نقل على زجاجة من برنامج تلفزيوني 1X، فيفير الزجاجة، وسحب 3 مل.
    9. نعلق المحقنة مع PBS إلى مدخل للتصفية وطرد مرشح (3-5 قطرات في الثانية الواحدة). جمع من خلال تدفق في حاوية النفايات البيولوجية. فصل حقنة من مرشح دون التراجع المكبس.
    10. وبعد الترشيح ويغسل PBS، سحب 3 مل من وكيل استقرار RNA باستخدام جديدة حقنة 5 مل والطريقة الموضحة في الخطوة 3.6.8. طرد مرشح كما في الخطوة 3.6.9. وينبغي أن يظل عامل استقرار RNA على التصفية. فصل حقنة من مرشح دون التراجع المكبس.
    11. اغلاق مدخل ومخرج فلتر مع غطاء غمد والمسمار المدورة من ارتفاع نقل مغادرة مرشح المشبعة مع وكيل استقرار RNA. يمكن تخزين مرشح في هذه المرحلة. تخزين مرشح في -80 درجة مئوية حتى سمح الوقت (~ 2 ساعة) لإكمال الخطوات 5.3 إلى 5.4.7.
      وقد تم تجهيز مرشحات المخزنة في -80 درجة مئوية لمدة تصل الى عام بعد جمع بدون decrea: مذكرةفي حد ذاتها جودة RNA.
  • PBMC العزلة المرحلة 2 (30 دقيقة)
    1. إزالة vacutainers تحتوي على Ficoll من أجهزة الطرد المركزي (الخطوة 3.4.1) والاستمرار في غطاء BSL2. يجب Vacutainers عرض الانفصال كما في الشكل (2). وإذا لم يكن كذلك، انظر الجدول 2.
    2. مرة واحدة يتم إرجاع vacutainer إلى غطاء محرك السيارة BSL2، وإزالة سدادة وسحب 1.5 مل من أعلى، والصفرة، وطبقة البلازما (الشكل 2) باستخدام ماصة المصلية دون الاقتراب من وحيدات النوى (واضحة / أبيض) طبقة. نقل البلازما إلى 5 مل cryovial - (بركة من 2 vacutainers - 1 مشارك). تسجيل الصوت التي تم جمعها. راجع الخطوة 3.7.6 للحصول على تعليمات التخزين.
      ملاحظة: أفضل فصل وأكبر غلة PBMC تأتي من المشاركين الذين صاموا لا يقل عن 12 ساعة قبل جمع الدم.
    3. نقل البلازما المتبقية وبيضاء، وطبقة وحيدات النوى (كل شيء فوق طبقة جل - الشكل 2) شالغناء ماصة المصلية، إلى أنبوب 15 مل مخروطي الشكل، وتجميع طبقة وحيدة النواة من كل من Ficoll اثنين تحتوي على vacutainers لكل مشارك في أنبوب مخروطي واحد.
    4. إضافة برنامج تلفزيوني 1X لجلب الحجم الإجمالي في أنبوب مخروطي 15 مل. أنبوب الغطاء وعكس 5 مرات. الطرد المركزي (مع الفرامل والتسارع OFF) 15 دقيقة، 300 x ج، 22 ° C.
    5. العودة إلى تحتوي على vacutainers Ficoll في غطاء محرك السيارة وجمع خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) باستخدام 5¾ "باستور الماصة لتحوم حول وتخفيف خارج طبقة جل Ficoll وإزالته إذا كان ذلك ممكنا. استخدام الماصة المصلية لجمع ونقل كرات الدم الحمراء (~ 4.5 مل) إلى 5 مل cryovial. تسجيل الصوت التي تم جمعها.
    6. نقل كلا 5 مل cryovials (البلازما في الخطوة 3.7.2 وكرات الدم الحمراء في الخطوة 3.7.5) إلى أن يصل حاوية تجميد للرقابة وضعت في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل بعد الوقت الذي يمكن نقله إلى cryobox وعاد إلى -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    7. العودة المشاركأنبوب nical إلى غطاء محرك السيارة، عندما الطرد المركزي في خطوة 3.7.4 كاملة، ونضح جميع ولكن ~ 500 ميكرولتر من PBS دون إزعاج بيليه. PBMC العائد أكبر إذا ~ 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ويترك فوق بيليه في هذه المرحلة.
    8. إضافة جديدة برنامج تلفزيوني 1X لتبرزي حجم 10 مل. resuspend الكرية بلطف. أنبوب الغطاء وعكس 5 مرات. الطرد المركزي (مع الفرامل والتسارع OFF) 10 دقيقة، 300 x ج، 22 ° C.
  • مصل عزل المرحلة 2 (10 دقيقة)
    ملاحظة: إجراء في غطاء BSL2.
    1. قسامة طبقة المصل أعلى من vacutainer مصل، وبعد الطرد المركزي (الخطوة 3.2.1)، في 2 مل cryovials كما تريد. العائد النموذجي هو 2.5 مل (الجدول 1). تسجيل الصوت. على سبيل المثال، استخدام 4 cryovials aliquoting 200 ميكرولتر إلى cryovial 1، 1000 ميكرولتر إلى cryovial 2 ومن ثم تقسيم المتبقية في cryovials 3 و 4.
    2. نقل cryovials إلى cryobox ومكان في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. توثيق بداية الفريزروقت.
  • PBMC العزلة المرحلة 3 (15 دقيقة)
    1. العودة إلى غطاء محرك السيارة، وبعد الطرد المركزي (الخطوة 3.7.8)، ونضح كما الكثير من طاف / PBS ممكن من دون إزعاج بيليه. بيليه resuspend قبل pipetting في 2.5 مل PBMC تجميد المتوسطة 1 (انظر SI 2).
    2. إضافة 2.5 مل PBMC تجميد المتوسطة 2 (انظر SI 2) إلى الخلية / حل المتوسط ​​في خطوة 3.9.1. دوامة بلطف.
    3. قسامة 10 ميكرولتر من الحل خلية إلى 0.65 مل أنبوب microcentrifuge (مزيد من التخفيف قد يكون ضروريا). إضافة 10 ميكرولتر من 0.4٪ وصمة عار الأزرق التريبان في أنبوب microcentrifuge 0.65 مل ومزيج من قبل pipetting عدة مرات. لمزيد من التفاصيل راجع كتيب الشركة المصنعة 16.
    4. الماصة 10 ميكرولتر من الخليط في خلية العد شريحة غرفة ومكان الشريحة في مكافحة الخلايا في غضون 3 دقائق من الخلط. التكبير والتركيز الخلايا. اضغط على "عدد خلايا" للحصول على PBMC العد.
    5. قسامة، إذا كانت قابلة للتطبيقPBMC العدد أكثر من 3 مليون خلية لكل مليلتر (MC / مل)، كما هو مطلوب في cryovials وانتقل إلى الخطوة 3.9.9. متجر PBMCs في ما يصل إلى 5 cryovials بتركيز لا يقل عن 3 MC / مل لكل منهما.
    6. وإذا كان عدد PBMC قابلة للحياة هو أقل من 3 MC / مل، وحساب العدد الكلي للخلايا بضرب قابلة للحياة MC / مل بنسبة 5 مل. تقسيم هذا العدد من 4، 3، 2 أو 1 مل بحيث سيكون هناك أنبوب واحد على الأقل مع 3 MC / مل.
    7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا / تجميد الحل متوسطة لمدة 5 دقائق في 300 x ج (الفرامل والتسارع OFF). بعد الطرد المركزي، ونضح حجم مناسب لتجميد المتوسطة (طاف) ترك حجم المحسوبة أعلاه (4، 3، 2 أو 1 مل).
    8. Resuspend وبيليه في طاف المتبقية وقسامة لا يقل عن 3 MC / مل إلى العدد المناسب من cryovials (1-4) في 1 مل / cryovial. النهائي المتوسطة تجميد 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) / 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) / 70٪ معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640.
    9. Documوالأنف والحنجرة من عدد خلايا في cryovial. نقل cryovials إلى معدل الحاويات تجميد للرقابة وضعت في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل بعد ذلك الوقت يمكن نقل cryovials إلى cryobox وضعت في خزان النيتروجين السائل (مرحلة البخار) للتخزين على المدى الطويل. الفريزر ثيقة وقت البدء.

    • 4. يوم 2 الإعداد

    1. حرارة قسامة (220 ميكرولتر لكل مرشح) من نوكلياز مجانا 0.1 ملي EDTA في أنبوب nuclease خالية إلى 80 درجة مئوية في كتلة الحرارة.
    2. استعد حلول غسل 1 و 2 (انظر SI 2).

    5. يوم 2: على المدى الطويل تخزين العينات وخلايا الدم البيضاء تجهيز تصفية (3 ساعات)

    1. نظرة عامة.
      1. تنفيذ هذا الإجراء في غضون 6 أشهر من تطبيق الكريات البيض إلى التصفية.
        ملاحظة: بشكل عام، يوم 2 التجهيز يستغرق حوالي 3 ساعات وبينما هو المسمى عليه "يوم 2"، والشرط الرئيسي هو أن الجزء تصفية تجهيز ينبغي أن يقوم على اليوم الذيليس هناك معالجة يوم 1 التي تحدث في المختبر.
    2. تخزين العينات المدى الطويل (15 دقيقة)
      1. تنفيذ هذا الإجراء في كل يوم، وذلك قبل تسليم vacutainers جديدة إلى المختبر ليوم 1 المعالجة. نقل cryovials التي تم تخزينها O / N في التحكم حاويات معدل التجميد في يوم 1 إلى cryoboxes المسمى بشكل مناسب وإعادتها إلى -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل (مرحلة البخار) للتخزين على المدى الطويل. تنظيم cryovials على أساس نوع العينة (على سبيل المثال، DNA، PBMC، كرات الدم الحمراء، وغيرها) للإسراع موقع عينة تتبع لفحوصات نقطة النهاية.
    3. الكريات البيض RNA مرشحات تجهيز (45 دقيقة).
      ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول هذا الإجراء راجع تعليمات الشركة الصانعة 17.
      1. تقديم مرشح لRT (ذوبان حوالي 5 دقائق).
      2. إزالة غمد والمسمار غطاء من مرشح. سحب المكبس من حقنة 5 مل وتوصيله إلى مدخل (نهاية اشتعل) من مرشح، وكساد الغطاسطرد وكيل استقرار RNA من موانئ مرشح في حاوية النفايات البيولوجية.
      3. تحميل 5 مل جديدة المحاقن مع 4 مل من الفينول وغوانيدين حل ثيوسيانات لعزل الحمض النووي الريبي ونعلق عليه إلى مدخل للمرشح، تضغط على المكبس لطرد الحل من خلال مرشح، وجمع المحللة في المسمى أنبوب 15 مل المخروطية (2 لكل مشارك).
      4. قطع المحقنة من مرشح، وسحب الغواص، إعادة نعلق عليه إلى التصفية، وتضغط على المكبس لطرد العينة المتبقية المحاصرين في القرص مرشح في نفس أنبوب مخروطي 15 مل. تجاهل تصفية وحقنة.
      5. إضافة 800 ميكرولتر BCP إلى أنبوب مخروطي الشكل، أغلق أنبوب بإحكام ويهز بقوة الإعدادية لمدة 30 ثانية.
      6. في احتضان RT لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2000 ز س.
      7. نقل (أعلى) المرحلة المائية إلى المسمى حديثا 15 مل أنبوب مخروطي (~ 2.5 مل).
      8. إضافة 0.5 أضعاف حجم المرحلة المائية من nuclease خالية من المياهد تخلط جيدا. ثم إضافة 1.25x حجم مائي من الإيثانول بنسبة 100٪ وتخلط مرة أخرى.
        ملاحظة: للحصول على 2.5 مل حجم مائي، إضافة 1.25 مل من الماء مجانا نوكلياز المزيج، ثم يضاف 4.7 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ (2.5 مل س 0.5 = 1.25 مل المياه nuclease مجانا THEN 2.5 مل + حجم مائي 1.25 مل = 3.75 مل الجديد THEN 3.75 مل س 1.25 = 4.7 مل 100٪ من الإيثانول). هذه الخطوة تتيح لعزل الحمض النووي الريبي مجموع يتضمن جزء RNA الصغيرة. وهناك طريقة لحذف الرنا صغيرة من العزلة يمكن العثور عليها في دليل ال 17.
      9. إزالة المكبس من حقنة 5 مل وإدراج خرطوشة تدور في مكانها. إرفاق خرطوشة / حقنة لمشعب فراغ. للاتصال أكثر أمنا لمشعب فراغ، ضع مجموعة خرطوشة / حقنة داخل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع الجزء السفلي قطع.
      10. تطبيق عينة من الخطوة 5.3.8 لخرطوشة تدور ببطء مع الفراغ على، مضيفا بعناية المزيد من العينة كما يتم سحبها من خلال خرطوشة.
        ملاحظة: إذا لم يكن هناك فراغالوقت الحاضر، نرى طريقة الطرد المركزي في http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
      11. نقل خرطوشة تدور لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإضافة 750 ميكرولتر من غسل 1. الطرد المركزي خرطوشة تدور / الجمعية أنبوب 5-10 ثانية في 12000 ز س.
      12. تجاهل الراشح من الأنبوب وإعادة خرطوشة تدور لنفس أنبوب microcentrifuge.
      13. إضافة 750 ميكرولتر من غسل 2 وأجهزة الطرد المركزي خرطوشة تدور / أنبوب ل5-10 ثانية في 12000 ز س. تجاهل الترشيح كما في الخطوة 5.3.12. العودة خرطوشة تدور لنفس أنبوب microcentrifuge.
      14. كرر مع 750 ميكرولتر آخر من غسل 2 و الطرد المركزي كما في الخطوة 5.3.13. رشح تجاهل. العودة خرطوشة تدور لنفس أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي خرطوشة تدور / أنبوب في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة حتى يجف التصفية.
      15. نقل خرطوشة تدور لالطازجة، وصفت 1.5 ميكرولتر أنبوب microcentrifuge.
      16. إضافة 200 ميكرولتر من nuclease خالية من 0.1 ملي EDTA (مسخن إلى 80 & #176؛ C) إلى مركز للتصفية خرطوشة تدور (2 لكل مشارك). في احتضان RT لمدة 1 دقيقة.
      17. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي. الإبقاء على الترشيح. تجاهل خرطوشة زيادة ونقصان.
      18. تقسيم كل الراشح 200 ميكرولتر إلى قسمين، 100 مكل إلى الطازجة 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، والتسمية والحفاظ على الجليد. في هذه المرحلة، بدءا من 2 مرشحات لكل مشارك سوف تسفر عن اربعة 100 مكل من الحمض النووي الريبي لكل مشارك.
    4. العلاج الدناز (1 ساعة)
      ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل حول هذا العلاج ترى بروتوكول الشركة المصنعة 18.
      1. إنشاء مزيج الرئيسي من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من الدناز أنا العازلة و 2 ميكرولتر rDNase أنا في قسامة + 1 (لحساب pipetting لخطأ).
        ملاحظة: للحصول على أربع عينات، 100 مكل استخدام 50 ميكرولتر الدناز أنا العازلة + 10 ميكرولتر rDNase I.
      2. قسامة 12 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في الخطوة 5.4.1 في كل من قسامات RNA من الخطوة 5.3.18 وتخلط بلطف. في احتضان 37° C لمدة 30 دقيقة في كتلة الحرارة.
      3. دوامة التعطيل الدناز الكاشف وإضافة 11.2 ميكرولتر لكل قسامة، وتخلط جيدا. في احتضان RT لمدة 2 دقيقة vortexing ل2-3 مرات خلال الحضانة.
      4. أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1.5 دقيقة.
      5. نقل طاف (RNA) إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة. قسامات من نفس المشارك يمكن تجميعها هنا.
      6. تشغيل كل عينة على معمل للحصول على التركيز. ويوصى بإجراء تحليل نوعية RNA باستخدام Bioanalyzer (راجع الخطوة 5.5).
      7. قسامة الحمض النووي الريبي في cryovials كما تريد. إذا لن يتم إجراء تحليل Bioanalyzer على الفور، قسامة 1.5 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب microcentrifuge لتحليلها لاحقا. توثيق تركيزات ووقت بدء التجميد. عينات في مخزن -80 ° C.
    5. تحليل Bioanalyzer (1 ساعة)
      1. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة 19. عندما المدى الكامل، يتم تخزين البيانات تلقائيا، ولكن حفظه مرة أخرى ثإيث أصغر، اسم الملف أكثر التعرف عليه. النتائج المتوقعة (الشكل 3): سلم يجب أن يكون 6 القمم، يجب أن يكون عينات 3 قمم (2 قمم الريباسي في 44 ثانية و 50 ثانية على التوالي و 1 في وقت مبكر ذروة علامة في 25 ثانية).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    ومن الضروري أن الإجراء الشامل إنتاج مواد عالية الجودة للتحليل في العديد من التطبيقات المصب بما في ذلك التعبير الجيني عن طريق ميكروأري وتحليل RT-PCR، والكشف عن تعديلات جينية، والاختلافات فرعية الخلية. ويبين الجدول 1 متوسط ​​المحصول وجودة المواد من كل من هذه العمليات. الشكل يوفر 3 مثال على جودة الانتاج من العزلة الكريات البيض RNA ومرشح طرق المعالجة. الصورة على اليسار العلوي من الشكل (3) هي صورة هلام الناتجة عن الكهربي الشعري. كل حارة يجب أن ينتج شريطين متميزة مع الحد الأدنى من التظليل التي من شأنها أن تشير إلى تدهور. والاستشرابية تحت هلام توفر نظرة إضافية على مستوى ونوع من التدهور التي يمكن تحديدها استنادا إلى موقع وحجم القمم. النزاهة عدد RNA (رين) هو مقياس آخر الجودة التي يتراوح من 1 (منخفض؛ المتدهورة) ل10 (عالية، نقية، وحسن جودة RNA).

    هذه المنهجية إنتاجية عالية يفسح المجال لوجود خطأ في بعض الأحيان، ولكن هناك العديد من نقاط التفتيش في جميع أنحاء مراحل مختلفة من التجهيز لضمان مراقبة الجودة. الشكل 2 يعرض الفصل السليم التالية الطرد المركزي لتحتوي على vacutainer Ficoll. هناك أسباب عدة لvacutainer قد لا يتم عرض هذا الفصل بما في ذلك خطأ في سرعة الطرد المركزي، وانخفاض حجم جمع، أو عدم وجود أحد المشاركين الصوم كما هو مبين في الجدول رقم 2.

    وقد تم تحليل مجموعات فرعية (ن = 100) من العينات المعزولة من خلال هذا الإجراء مع النجاح الذي HumanMethylation27 (HM27) DNA تحليل BeadChips بما في ذلك التحقق من صحة تلك النتائج وفقا لpyrosequencing 11. التنميط الجيني، استهدف pyrosequencing بيسلفيت، وقد تم تنفيذ الوقت الحقيقي RT-PCR بنجاح في يلدمان والدين مختبرات 20،21،22،23. مصل، معزولة في المساواة علال مع عزل الحمض النووي لكل من Beadchip والتنميط الجيني التحليلات، تم تحليل بنجاح لIL-6 و C-رد الفعل نشاط البروتين 24. وقد تم تحليل مجموعات فرعية T-خلية من PBMCs معزولة بنجاح من قبل التدفق الخلوي 25-28. بالإضافة إلى ذلك، قد تعرض RNA من الإجراء الكريات البيض تعديلها لالجينوم التعبير الجيني على نطاق واسع التنميط 29.

    الرقم 2
    الشكل 2. طبقة الانفصال بعد الطرد المركزي من Ficoll تحتوي على vacutainer. A التصور للفصل مكونات الدم المتعددة التالية الطرد المركزي. طبقة وحيدة النواة هي كذلك النقاء في حين يتم تخزين الطبقات الأخرى في -80 ° C. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
    الشكل 3. النتائج المتوقعة من معالجة الكريات البيض RNA. النتائج Bioanalyzer عرض شريطين متميزة تمثل 18S 28S و RNA الريباسي مع الأرقام سلامة الحمض النووي الريبي (RINs) أعلاه 8 معزولة مع وسائل الكريات البيض وصفها عزل الحمض النووي الريبي وفلتر معالجة (انظر بروتوكول 3.6 و 5.3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    إجمالي متوسط ​​العائد (N≈500) متوسط ​​الجودة
    مصل الدم 2.30 مل N / A
    DNA من الدم الكامل 39.97 ميكروغرام الامتصاصية في 260/280 = 1.74
    PBMC 22250000 خلايا قابلة للحياة على الأقل 95٪ جدوى من العزلة الشاملة
    RNA من الكريات البيضاء 44.09 ميكروغرام الامتصاصية في 260/280 = 2.01
    RNA النزاهة عدد (رين) = 6.48

    الجدول 1. المتوقعة الغلة. متوسط ​​كمية ونوعية العينات التي تمت معالجتها باستخدام أساليب وصفها.

    مشكلة حل محتمل
    لا فصل بعد Ficoll تحتوي على vacutainer الطرد المركزي لا شغل Vacutainer للقدرة - حجم جمع الحد الأدنى للتجهيز الكافي 6 مل.
    تحقق من إعدادات أجهزة الطرد المركزي، تأكد من أن السرعة هي في ز قوة. إذا كان غير صحيح، لتعيين ز قوة وrespin.
    انخفاض PBMC المشتركالاتحاد الوطني للعمال حجم الدم رسم منخفض جدا.
    يستنشق قريبة جدا من بيليه في الخطوة 3.7.8
    مشارك غير الصيام.
    لا فصل بعد vacutainer المصل الطرد المركزي تحقق من إعدادات أجهزة الطرد المركزي، تأكد من أن السرعة هي في ز قوة. إذا كان غير صحيح، لتعيين ز قوة وrespin.
    تركيز غير متوقع باستخدام معمل NanoDrop 1000 التأكد من قياس هو نوع العينة المناسب (على سبيل المثال، DNA أو RNA).

    الجدول 2. استكشاف الأخطاء وإصلاحها. المشاكل المشتركة التي تواجهها مع الأساليب المذكورة والحلول المحتملة.

    الجدول S1
    التكميلية ورقة تتبع الجدول 1. ومثال لتتبع vacutainers جيئة وذهاباجمع الدم متر لتسليم المختبر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الجدول.

    الجدول S2
    التكميلي الجدول 2. سجل العينة. مثال على وثيقة تستخدم لتوثيق تجهيز vacutainers عند تسليمها للمختبر. اضغط هنا لمشاهدة هذه الطاولة.

    الجدول S3
    الجدول التكميلي 3. Cryovial نظام الترقيم. مثال على نظام الترقيم المستخدمة لكل مشارك. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الجدول.

    معلومات تكميلية 1. تفاصيل تجهيزها التفاصيل واجبات منسق الدراسة، الساعي وفصاد. الرجاء انقر هنا لعرض معلومات تكميلية 1.

    الرقم S2
    معلومات تكميلية 2. وصفات. قائمة الوصفات لالكواشف اللازمة. الرجاء انقر هنا لعرض المعلومات التكميلية 2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    وصفناها بروتوكول مبسطة الذي تم تطبيقه بنجاح لمعالجة أكثر من 1600 عينة دم كاملة في دراسة صحة ديترويت الجوار. على الرغم من أن العديد من هذه التقنيات متوفرة في الأدبيات الموجودة، لدينا خطوة بخطوة تجميع، بما في ذلك التعديلات توقيتها بالضبط بين كل خطوة، يعكس الأمثل، بروتوكول الفعال الذي ينتج بنجاح مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية مع مجموعة واسعة من التطبيقات المصب، بما في ذلك الحامض النووي، مرنا التعبير والتحليل المناعي. وقد تم بالفعل اختبار هذه العينات في مجموعة متنوعة من التجارب، نتائج التي تم نشرها في الأدب لاستعراض الأقران و / أو قدمت في الاجتماعات الوطنية 11،20،21،23،24،29. ومن ثم ينبغي أن يكون هذا البروتوكول التي تهم الباحثين الآخرين تسعى لجمع العينات البيولوجية في الدراسات السكانية على غرار DNHS.

    عند معالجة العينات في مثل هذا throughp عاليةالتحرير الطريقة، فإنه من الأهمية بمكان الاحتفاظ بسجلات دقيقة في جميع المراحل. ونحن نوصي بوضع قاعدة بيانات لتخزين كافة المعلومات cryovial في البداية. وينبغي أن تشمل قاعدة البيانات هذه جميع جوانب العينة داخل كل cryovial بما في ذلك حجم، والتركيز، والجودة، الباركود، وموقع تخزين (تخزين عدد مربع وموقع داخل منطقة الجزاء). نوصي إعداد cryovials قبل صفت وصناديق التخزين التي تحتوي على الباركود. وعلاوة على ذلك، فقد وجدنا أنه من المناسب أن يكون وثيقة "سيد" الذي يحتوي على الباركود لكل أنبوب، محددة لكل مشارك (الجدول S3). وهذا يتيح إدخال السريع للبيانات cryovial في قاعدة البيانات بدون معالجة المفرط من العينات، لا لزوم لها تقديم دورات تجميد / الذوبان للعينات ويلغي احتمال الخطأ البشري في الدخول في الباركود يدويا. ومن الضروري أيضا أن تلتزم التسميات في تطرفا (على سبيل المثال، مرحلة البخار من النتروجين السائل -178 إلى -150درجة مئوية) درجات الحرارة. يمكن أن تكون الوثائق تستغرق وقتا طويلا، ومع ضرورة معالجة فعالة عند التسليم، وجدنا أن وجود فنيين اثنين على الأقل تقسيم العمليات تنتج أكبر قدر من الكفاءة.

    وجود قيود على هذا الأسلوب هو القرب من المختبر إلى موقع المجموعة. لPBMC العزلة على وجه الخصوص، يجب أن تتم معالجة العينات في غضون 2 ساعة من جمع لتجنب زيادات كبيرة في تلوث أحمر خلايا الدم ويقلل في الخلايا وحيدة النواة قابلة للحياة. على هذا النحو، ينبغي أن يكون المختبر لا يزيد عن 30 دقيقة من موقع جمع لحساب أي مشاكل حركة المرور ذات الصلة التي قد تنشأ. بالإضافة إلى ذلك، أي مختبر اقتراح لإجراء بروتوكول الموجزة هنا يتطلب اثنان من الفنيين في متناول اليد لضمان تجهيز العينات الأمثل. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكون كل مختبر الحصول على المعدات اللازمة لكل خطوة المبينة أعلاه. وهكذا، مختبرات بعدد أقل من الموظفين و / أو معدات محدودة ثولد تكون قادرة على القيام بهذا البروتوكول احتمالا.

    ميزة من هذا البروتوكول هو القدرة على جمع العينات مباشرة في منازل الأفراد بالتراضي. وهذا يسمح للدراسة للوصول إلى الأفراد الذين يعانون من مشاكل الصحة العقلية أو غيرها من الذين لن يسعى عادة المساعدة الطبية، وربما بسبب عدم وجود التأمين أو النقل. فإنه أيضا يمكن المقارنة بين الأفراد المتضررين ويتأثر الذين يعيشون داخل المجتمع نفسه الذي شهدت مشغلات مماثلة، ولكنها تختلف من حيث الأعراض صحتهم العقلية. الحصول على عينات بهذه الطريقة يتطلب التوقيت والتنسيق الدقيق للالمختص بأخذ في هذا المجال. لأنه يقع المختبر لدينا داخل المجتمع الذي كانوا يدرسون، يمكن أن فصاد عادة بجمع عينات 2-3 المنازل وتسليم العينات إلى المختبر ضمن إطار 2 ساعة من المجموعة الأولى. الكفاءة هي المفتاح لتجهيز العينات لدينا، وعلى هذا النحو، كان لدينا المختص بأخذ متعددة فيالمجال، وزيادة الحاجة إلى التنسيق الدقيق. تلقى المختبر تسليم الدم متعددة مع ما يصل الى ثمانية مشاركين في تسليم متباعدة 2 ساعة على حدة. اجتمعت المختص بأخذ في مكان معين والجمع بين مجموعاتها مع فصاد واحد فقط تسليم العينات إلى المختبر ودفعة واحدة. الأساليب المذكورة هنا يمكن بسهولة أن تتكيف لدراسة العديد من الظواهر الأخرى والعينات البيولوجية التي تم جمعها يمكن استخدامها في العديد من المقايسات المصب.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Day 1: DNA isolation
    Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P5493-1L Day 1: PBMC isolation
    5 ¾” Pasteur pipets Fisher 13-678-6A Day 1: PBMC isolation
    Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated Life Technologies 10082147 Day 1: PBMC isolation
    Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-500ml Day 1: PBMC isolation
    RPMI Medium 1640, liquid Invitrogen 11875119 Day 1: PBMC isolation
    0.4% trypan blue stain  Invitrogen T10282 Day 1: PBMC isolation
    Countess Cell Counting Chamber Invitrogen C10283 Day 1: PBMC isolation
    Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer Invitrogen C10281 Day 1: PBMC isolation
    LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit  Ambion 1933 Day 1: Leukocyte RNA isolation
    25 G x 5/8 in. needles Becton Dickinson 305122 Day 1: Leukocyte RNA isolation
    Syringes (5 ml) Becton Dickinson 309646 Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation
    Denaturing Lysis Solution  Ambion 8540G Day 2: Leukocyte RNA isolation
    5 M NaCl Life Technologies 24740011 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    TRI Reagent Ambion 9738 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    Bromo-3-chloro-propane (BCP) Sigma B-9673 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    spin cartridges  Ambion 10051G Day 2: Leukocyte RNA isolation
    0.1 mM EDTA Ambion 9912 Day 2: Leukocyte RNA isolation
    DNA-free Kit Ambion AM1960 Day 2: DNase treament
    RNA 6000 Ladder  Agilent 5067-1529 Day 2: Bioanalyzer analysis
    RNA 6000 Nano Series II Kit  Agilent 5067-1511 Day 2: Bioanalyzer analysis
    RNaseZAP Ambion AM8782 Day 2: Bioanalyzer analysis
    Ethanol >99% Sigma E7023-500ml
    Isopropanol >99%  Sigma I9516-500ml
    Nuclease-free ultra pure water  Invitrogen 9938
    Pipette tips (nuclease-free) Eppendorf 22491253
    Pipetter (serological) Eppendorf 2223020-4
    Pipetters (for volumes under 1 ml) Eppendorf 3120000-054
    Pipettes (serological) Fisher 13-678-27E
    Controlled rate freezing containers Nalgene 5100-0001
    Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) Fisher 03-395-464
    Test tube rack Thermo Scientific 14-804-134
    15 ml polypropylene tubes Fisher 14-959-49D
    1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes Fisher 07-200-534 and 07-200-185
    2 ml and 5 ml cryovials Fisher 10-500-26 and 10-269-88F 
    8 ml CPT vacutainer BD Biosciences 362761 2 tubes
    6 ml K2 EDTA vacutainer BD Biosciences 367863 2 tubes
    8.5 ml SST vacutainer BD Biosciences 367988 1 tube
    Vortexer Fisher 2215365
    Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes Fisher 11-715-1250
    Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood Fisher 01-257-87
    Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid Eppendorf 22637002
    Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes Eppendorf 22628157 2, one does not need to be refrigerated
    Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device Fisher 13-400-411
    Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies G2940CA
    Liquid nitrogen tank Thermo Scientific 11-676-56
    Sharps container Fisher 22-037-970
    Biological waste container Thermo Scientific 1223P52
    Biosafety Level 2  certified cell culture hood Thermo Scientific 13-261-315

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
    2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
    3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
    4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
    5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
    6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
    7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
    8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
    9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
    10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
    11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
    12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
    13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
    14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
    15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
    16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
    17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
    18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
    19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
    20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
    21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
    22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
    23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
    24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
    25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
    26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
    27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
    28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
    29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

    Tags

    الطب، العدد 105، PBMC العزلة، والدم كله، عزل الحمض النووي، والعزلة RNA، دراسة مجتمعية، ووضع غير السريرية
    التقطير السريع وعزل مكونات الدم الكامل في عينات تم الحصول عليها من إعداد المجتمعية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weckle, A., Aiello, A. E., Uddin,… More

    Weckle, A., Aiello, A. E., Uddin, M., Galea, S., Coulborn, R. M., Soliven, R., Meier, H., Wildman, D. E. Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting. J. Vis. Exp. (105), e52227, doi:10.3791/52227 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter