Abstract
Insamling och behandling av helblod i en icke-klinisk miljö erbjuder en unik möjlighet att utvärdera samhällslevande personer både med och utan tidigare villkor. Snabb behandling av dessa prover är avgörande för att undvika nedbrytning av viktiga cellulära komponenter. Här ingår metoder för samtidig perifert blod mononukleära celler (PBMC), DNA, RNA och serum isolering från en enda blodprovstagning utförs i hemmen av samtycke deltagare över ett storstadsområde, med bearbetning inletts inom två timmar för insamlingen. Vi har använt dessa tekniker för att bearbeta över 1600 blodprover ger jämn och hög kvalitet material, som sedan har använts i framgångsrik DNA-metylering, genotypning, genuttryck och flödescytometri analys. Några av de metoder som används är standard; emellertid när de kombineras på det beskrivna sättet, de möjliggör effektiv bearbetning av prover från deltagarna i populations och / eller gemenskapen-baserade studier som normalt inte skulle utvärderas i en klinisk miljö. Därför har detta protokoll potential att erhålla prover (och därefter data) som är mer representativa för befolkningen i allmänhet.
Introduction
Flera studier har präglat skillnader i genuttryck, DNA-metylering och cellgrupp i blod bland personer med och utan mentala (eller annat) sjukdomar 1-4. Dessa studier har emellertid erhållits från kliniska miljöer där sjukdomsassocierade skillnader kan förstoras på grund av den generellt allvarligare typ av sjukdomar för vilka patienter som söker behandling. På grund av framsteg inom "omik" metoder, har det senaste decenniet sett en explosion av intresse av att få biologiska prover från samhället och / eller epidemiologiska inställningar 5-7, i syfte att tillhandahålla befolkningsbaserade uppskattningar av sjukdomarnas utbredning och en bredare bild av miljömässiga faktorer som påverkar dessa mentala och / eller fysiska sjukdomar.
En viktig utmaning i detta avseende är kravet på en snabb behandling av de insamlade proverna. Nedbrytning av mononukleära celler, viktiga immunsystemkomponenter som är frequently används för att bedöma en persons hälsa, börjar omedelbart efter blodprovstagning med en signifikant minskning av återhämtning efter två timmar för insamling 8-10. För att möta denna utmaning, presenterar vi en optimerad protokoll där flera komponenter av humant helblod samtidigt isolerade från prover som erhållits i hemmen av individer som lever i ett stort storstadsområde. Protokollet bygger på vår sammanställning och modifiering av befintliga tekniker, inklusive lagring av alla "extra" fraktioner i händelse framtida teknik möjliggör ytterligare isolering / analyser. Även alternativa metoder eller kit kan användas i stället för de enskilda metoder som beskrivs här, som beskrivs har visat sig vara en pålitlig och effektiv metod för behandling av prover i en hög genomströmning sätt. Högkvalitativa fraktionerna (PBMC, DNA, serum och RNA) av färskt blod kan produceras inom 2 h av uppsamling och alla analysfärdiga prover kan vara tillgängliga inom 2 dagar (figur 1).
Detta protokoll har utvecklats för att möjliggöra en effektiv hantering av prover som samlats in från community-bostad, vuxna invånare i staden Detroit för att testa i Detroit området Health Study (DNHS, DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), en populationsbaserad studie av de sociala och biologiska faktorer för posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) och andra psykiska sjukdomar. Förekomsten av PTSD i Detroit är mer än dubbelt riksgenomsnittet 11,12. Identifiera biologiska faktorer för PTSD i denna population kan bidra till att utveckla lämpliga farmakologiska och / eller kognitiv beteende insatser för att hjälpa dem som lider av sjukdomen, både i denna urbana befolkningen, och i andra högriskgrupper (t.ex. återvänder krigsveteraner). Vårt laboratorium, tidigare belägen vid Wayne State University i Detroit, Michigan, valdes för bearbetning på grundval av vår kompetens för att hantera nya vävnadsprover som härrör från en mängdkällor, nödvändigheten börja bearbeta proven inom två timmar av insamling, och vår närhet till insamlingsplatser. Med denna unika möjlighet till hands, vårt mål var att optimera behandlingen för störst utbyte av DNA, RNA, serum och perifera mononukleära blodceller (PBMC) från varje prov (totalt N = 1,639 prover över 5 vågor av provtagningen). De förfaranden som beskrivs här kan utföras samtidigt i en icke-klinisk miljö, vilket ger utgångsmaterial (se tabell 1 för genomsnittliga avkastningen) för en mängd olika tillämpningar i efterföljande led, inklusive microarray, epigenetiska, realtids-RT-PCR, och flödescytometri analys.
Figur 1. Övergripande arbetsflödet. Den övergripande processen som avbildas här inkluderar logistiken att få blodprover från att identifiera samtycke participants till blodet dra sig själv. Hög kvalitet, fraktioner (perifera mononukleära blodceller; PBMC, DNA, serum och RNA) av färskt helblod kan produceras inom 2 h av uppsamling och alla analysfärdiga prover kan vara tillgängliga inom 2 dagar. Dessutom fraktionerna framställda genom denna metod är lämplig för långtidsförvaring, om proven inte ska testas omedelbart. Hela tidslinjen som beskrivs här kunde slutföras på en enda dag (~ 5 h totalt). Men skulle en sådan dag vara mycket arbetskrävande, särskilt för en enda tekniker med stor erfarenhet med teknikerna. Därför rekommenderar vi att dela förfarandena Dag 1 mellan åtminstone två tekniker och slutföra RNA-bearbetning Dag 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detroit Neighborhood Health Study granskades och godkändes av University of Michigans Institutional Review Board. Alla deltagare förutsatt informerat samtycke innan de deltar i studien.
1. Översikt
- Korrekt dokumentera alla stadier från rekrytering genom analys av endpoint data. Utför protokollen Dag 1 samtidigt, omkopplingsstegen och överlappning i mån av tid. Sekvensen av faser är skriven för att optimera prestanda effektivitet. Figur 1 ger en översikt av hela processen.
Obs: Termen "deltagare" används genomgående för att beteckna blodprovs de identifierade dras från en samtyckande individ. Tiderna inom parentes nedan visar hands-on tid. Exempel på spårningsarket och prov loggen kan hittas i kompletterande tabeller S1 och S2, respektive. Prover samlas genom provtagare i hemav personer som identifierats som samtyckande deltagare med studiekoordinator och transporteras till labbet med en kurir (se kompletterande information (SI) 1 för ytterligare pre-bearbetning av detaljer).
2. Dag 1 Inställning
- Bered 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Värm en värmeblock till 56 ° C.
- Förbered proteaset (se SI 2) genom alikvotering 20 pl i rätt antal mikrocentrifugrör för dagens leveranser (2 per deltagare).
- Se till Buffert AW1 och AW2 (tvättbuffertar som finns i DNA-isoleringskit som ökar renheten hos DNA) är klara för användning, lägga till 100% etanol som anges på etiketten, om det behövs.
- Kyl ner kyld centrifug till 4 ° C.
- Sätt på locket på flaskan med 1x PBS med den medföljande gummi septumlock och genomborra gummiseptumet med en överförings spik, behålla skruvkork ovanpå överförings spike för att förhindra avdunstning. Upprepa med flaskan av RNA stabiliseringslösning.
- Efter framställning av buffertar, centrifug och värmeblock, dokumentera tidpunkten för Vacutainern leverans på provspårningsbladet (se tabell SI).
3. Dag 1: Bearbetning av helblod Prov för DNA, PBMC och Leukocyt RNA (2 tim)
- Översikt
- Tilld tillräcklig tid att minimera fördröjningen mellan bloddragningen och bearbetning starttid. Börja behandlingen av Ficoll innehåller Vacutainers inom 2 timmar av blodprovstagning för att undvika en ökning av röda blodsmitta cell och en minskning av mononukleära cellåterhämtning.
- Antag samling av 2 Vacutainers innehållande Ficoll gel gradient, 2 K 2 etylendiamintetraättiksyra (EDTA) Vacutainers och ett serum Vacutainer per vuxen deltagare. Vid leverans av Vacutainers till laboratoriet, har en tekniker underteckna spårningsbladet betecknar acceptans av proverna. Tiggai behandlingen omedelbart med starttiden dokumenteras på ett per vacutainer grund provet loggen.
- Serum Isolation Steg 1 (1 min)
- Dokumentera starttid på provet loggen (se tabell SI 2). Centrifug (med broms och acceleration OFF) 7,0 ml serum (röd) vacutainer (1 per deltagare) med hjälp av en svängig hink rotor med aerosol lock (skyddsnivå 2, BSL2 certifierad) under 20 min, 1300 xg, 4 ° C.
- DNA-isolering Steg 1 (15 min)
Obs: För ytterligare information om detta isoleringsförfarande, se tillverkarens protokoll 13.- Dokumentera starttid. I en BSL2 cellkultur huva, invertera Vacutainers innehållande Ficoll gel 5 gånger sedan lägga 200 pl helblod från toppen av en av de Vacutainers i var och en av två 20 pl alikvoter av proteas (400 ul totalt per deltagare). Lämnar proteas + blod mikrocentrifugrör i huven, fortsätter till centrifugation av Ficoll innehåller Vacutainers i steg 3.4.1.
Obs! Använd Vacutainer med den största samlingen volymen, med tanke på att det är nödvändigt att balansera centrifugen (dvs, kan det vara nödvändigt att ta bort 200 pl från vardera av de två Vacutainers) när snurra på Vacutainers i steg 3.4.1. Dessutom, för att säkerställa korrekt separation under bearbetningen av de blå Vacutainers bör nivån av blod kvar i vacutainer inte vara mindre än 2,5 inches ovanför Ficoll skiktet.
- Dokumentera starttid. I en BSL2 cellkultur huva, invertera Vacutainers innehållande Ficoll gel 5 gånger sedan lägga 200 pl helblod från toppen av en av de Vacutainers i var och en av två 20 pl alikvoter av proteas (400 ul totalt per deltagare). Lämnar proteas + blod mikrocentrifugrör i huven, fortsätter till centrifugation av Ficoll innehåller Vacutainers i steg 3.4.1.
- PBMC Isolering Steg 1 (1 min)
- Dokumentera starttid (måste vara inom 2 timmar av blodprovstagning för att undvika en ökning av röda blodsmitta cell och en minskning av mononukleära cellåterhämtning) .Invert Ficoll innehåller Vacutainers 8-10 gånger. Centrifug (med broms och acceleration OFF) de Vacutainers (2 per deltagare) med hjälp av en svängig hink rotor med aerosol lock (BSL2 certifierad) för 30 minuter, 1600 xg, 22 ° C.
- Återgå till huven och tillsätt 200 l Buffer AL till var och en av proteas + blod mikrocentrifugrör (steg 3.3.1). Cap, ta bort från motorhuven, virvel 15 sek och blixt spinn.
- Inkubera 56 ° C i ett värmeblock, 10 min.
- Ta bort rören från värmeblocket. Flash spinn. Återgå till BSL2 huven. Lägg 200 | il 100% etanol. Cap, ta bort från motorhuven, virvel 15 sek och blixt spinn. De återstående stegen kan genomföras utanför huven.
- Applicera lysat (inom 30 min av steg 3.5.3) till en märkt spinnkolonn (i en 2 ml uppsamlingsrör). Stäng locket för att undvika korskontaminering via aerosoler. Centrifug 6000 xg, 1 min.
- Kassera uppsamlingsröret med filtratet och placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör.
- Tillsätt 500 l Buffer AW1 till kolonnen utan fukta kanten, stäng locket och centrifugera 6000 xg, 1 min.
- Kasta samlingen röret med Filtreringste och placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör.
- Tillsätt 500 l Buffer AW2 till kolonnen utan fukta kanten, stäng locket och centrifugera 20.000 xg, 3 min.
- Kassera uppsamlingsröret med filtratet och placera spinnkolonn i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör (ingår inte i kitet) och centrifugera 20 tusen xg, 1 min.
- Kassera uppsamlingsröret med filtratet och placera spinnkolonn i ett nytt 1,5 ml uppsamlingsrör (ingår ej i satsen).
- Lägg 200 pl buffert AE eller vatten till varje kolonn och inkubera vid RT i 5 min. Centrifug 6000 xg, 1 min.
- Upprepa steg 3.5.11 eluering i samma provrör.
- Pool eluerat DNA från 2 kolumner per deltagare. Totalt utbyte ~ 800 | il per deltagare.
- Kvantifiera proverna med hjälp av en spektrofotometer när tiden tillåter.
- Alikvotera DNA som önskas i 2 ml cryovials, dokumentera koncentrationen av varje på specimen log. Överföring kryokärl till en cryobox och rum vid -80 ° C för långtidsförvaring. Dokumentera frys starttid.
Obs: Utför i ett biosäkerhetsnivå 2 certifierade cellkultur huva. För ytterligare detaljer om denna isolering se tillverkarens anvisningar 15.
- Borra gummiseptumet i K 2 EDTA Vacutainer med en överförings spik. Behåll manteln och skruvlock för användning i steg 3.6.11. Efter BSL2 standardmetoder, noga med att undvika exponering för blodburna patogener.
- Fäst den vita slip kontakten till toppen av överföringsnålen.
- Märk filtret med motsvarande deltagaren ID sedan ansluta inloppet (utsvängda änden) av filtret till den vita slip kontakten.
- Fäst en mantlad 25⅝ G nål till utloppet (avsmalnande ände) av filtret. Framställning av filteraggregatet före leverans påskyndar processen avsevärt och därför,fästa vita slip kontakten till överföringsspetsen, lägga filtret, då skaftet nålen och ställa enheten i en kultur provrörsställ fram till användning, rekommenderas.
- Efter sammansättning av K 2 EDTA-rör-system, på ett säkert sätt unsheathe nålen (använd i slutet av en metallspatel). Sticka nålen i en tom 10 ml evakuerade bloduppsamlingsröret (serum-mottagare rör) och vänd röraggregatet K 2 EDTA Vacutainer / filter / mottagare. Efter BSL2 standardmetoder, noga med att undvika exponering för blodburna patogener.
- Låt blodet att filtrera igenom tills de kilformade sektionerna hos filtret har rensat av blod. Filtrering tar ca 2 min och kan placeras i ett provrörsställ under filtrering.
- Ta bort filtret från församlingen. Låt nålen i röret med filtratet och kasta hela enheten i en avfallsbehållare.
- Bifoga en 5 ml spruta till överförings spetsen på flaska 1x PBS ivert flaskan och dra ut 3 ml.
- Sätt fast sprutan med PBS till inloppet av filtret och spola filtret (3-5 droppar per sekund). Samla genomströmning i en biologisk avfallsbehållare. Lossa sprutan från filtret utan att dra tillbaka kolven.
- Efter filtrering och en PBS-tvätten, återkalla 3 ml av RNA-stabilisering medlet med hjälp av en ny 5 ml spruta och den metod som beskrivs i steg 3.6.8. Spola filtret som i steg 3.6.9. RNA stabiliseringsmedel bör förbli på filtret. Lossa sprutan från filtret utan att dra tillbaka kolven.
- Täta filterinloppet och utloppet med höljet och skruvlocket kvarhålles från överföringsnålen lämnar filtret mättad med RNA-stabilisering medel. Filtret kan lagras vid denna punkt. Förvara filtret vid -80 ° C tills tiden tillåter (~ 2 timmar) för att slutföra steg 5,3 till 5.4.7.
Obs: Filter lagrade vid -80 ° C i upp till ett år efter samling har bearbetats utan decrease inom RNA kvalitet.
- Ta bort Ficoll innehåller Vacutainers från centrifugen (steg 3.4.1) och fortsätter i en BSL2 huva. Vacutainers bör visa separation som visas i figur 2. Om inte, se tabell 2.
- När Vacutainer återförs till BSL2 huva, ta bort proppen och dra 1,5 ml toppen, gulaktig, plasmaskikt (Figur 2) med hjälp av en serologisk pipett utan att få nära till mononukleära (klar / vit) skikt. Överför plasman till en 5 ml cryovial - (Pool från 2 Vacutainers - en deltagare). Logga volymen samlats. Se steg 3.7.6 för förvaringsanvisningar.
Obs: Den bästa separation och bästa PBMC avkastning kommer från deltagare som har fastat minst 12 timmar före bloduppsamling. - Överför den återstående plasma och vitaktig, mononukleära skiktet (allt över gelskiktet - Figur 2) usjunga en serologisk pipett, till en 15 ml koniskt rör, slå samman det mononukleära skiktet från vart och ett av de två Ficoll innehåller Vacutainers per deltagare i ett koniskt rör.
- Lägg 1x PBS för att få den totala volymen i den koniska röret till 15 ml. Cap röret och invertera 5 gånger. Centrifug (med broms och acceleration AV) 15 min, 300 x g, 22 ° C.
- Återgå till Ficoll innehållande Vacutainers i huven och samla in de röda blodkropparna (RBC) genom användning av en 5¾ "Pasteurpipett att virvla runt och lossa utsidan av Ficoll gelskiktet och ta bort den om möjligt. Använd en serologisk pipett för att samla in och överföra RBC (~ 4,5 ml) till en 5 ml cryovial. Logga volymen samlats.
- Överför båda 5 ml cryovials (plasma i steg 3.7.2 och de röda blodkropparna i steg 3.7.5) till en kontrollerad hastighet frysbehållaren och sätt vid -80 ° C under minst 24 timmar efter vilken tid de kan överföras till en cryobox och återvände till -80 ºC för långtidsförvaring.
- Återgå coniska röret till huven, när centrifugeringen i steg 3.7.4 är klar och aspirera alla utom ~ 500 | il av PBS utan att störa pelleten. PBMC avkastning är större om ~ 200 pl PBS kvar ovanför pelleten i detta skede.
- Lägg färsk 1x PBS för att bringa volymen till 10 ml. Suspendera pelleten försiktigt. Cap röret och invertera 5 gånger. Centrifug (med broms och acceleration AV) 10 min, 300 x g, 22 ° C.
Obs: Utför i ett BSL2 huva.
- Alikvotera toppserumskiktet från serum Vacutainer, efter centrifugering (steg 3.2.1), i 2 ml cryovials som önskas. Typiskt utbyte är 2,5 ml (Tabell 1). Logga volymen. Till exempel, använd 4 cryovials alikvotering 200 pl i cryovial 1, 1000 il till cryovial 2 och sedan dela resterande i cryovials 3 och 4.
- Överför cryovials till en cryobox och plats vid -80 ºC för långtidslagring. Dokumentera frys starttid.
- Återgå till huven, efter centrifugering (steg 3.7.8), och aspirera så mycket supernatant / PBS som möjligt utan att störa pelleten. Resuspendera pellet genom pipettering i 2,5 ml PBMC Frysning Medium 1 (se SI 2).
- Lägg 2,5 ml PBMC frysmedium 2 (se SI 2) till cellen / mediumlösning i steg 3.9.1. Vortex försiktigt.
- Alikvotera 10 ul av cellen lösningen i en 0,65 ml mikrocentrifugrör (ytterligare utspädning kan behövas). Tillsätt 10 | il 0,4% trypan blånad i 0,65 ml mikrocentrifugröret och blanda genom att pipettera flera gånger. För ytterligare information hänvisas till tillverkarens handbok 16.
- Pipett 10 ul av blandningen i en cell räknekammare slide och plats glida in i cellräknaren inom 3 min av blandning. Zooma in och fokusera cellerna. Tryck på "Räkna celler" för att få PBMC räknas.
- Alikvot, om den livsdugligaPBMC antal är över 3 miljoner celler per milliliter (mc / ml), såsom önskas i cryovials och fortsätta till steg 3.9.9. Förvara PBMC i upp till 5 kryokärl vid en koncentration av vardera åtminstone tre mc / ml.
- Om den viabla PBMC nummer är lägre än 3 mc / ml, beräkna det totala antalet celler genom att multiplicera livskraftig mc / ml genom 5 ml. Dela det talet med 4, 3, 2 eller 1 ml, så att det kommer att finnas åtminstone ett rör med 3 mc / ml.
- Centrifugera det koniska röret innehållande celler / frysmediumlösning under 5 minuter vid 300 x g (broms och acceleration AV). Efter centrifugering, aspirera lämplig volym av frysmedium (supernatant) lämnar volymen beräknats ovan (4, 3, 2 eller 1 ml).
- Återsuspendera pelleten i den återstående supernatanten och delprov minst 3 mc / ml i ett lämpligt antal av kryokärl (1-4) vid 1 ml / cryovial. Slutlig frysmediet är 10% dimetylsulfoxid (DMSO) / 20% fetalt bovint serum (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Dokument celltal per cryovial. Överför cryovials till en kontrollerad hastighet frysbehållaren och sätt vid -80 ° C under minst 24 timmar varefter cryovials kan överföras till en cryobox och sätta i en vätsketank kväve (ångfas) för långtidsförvaring. Dokument frys starttid.
4. Dag 2 Setup
- Värm en alikvot (220 | il per filter) av nukleasfritt 0,1 mM EDTA i en nukleasfritt röret till 80 ° C i ett värmeblock.
- Förbered tvättlösningar 1 och 2 (se SI 2).
5. Dag 2: Långsiktig Prov Lagring och Leukocyt Filter Processing (3 h)
- Översikt.
- Utför den här proceduren inom 6 månader efter det att tillämpningen av leukocyter till filtret.
Obs: Sammantaget tar Dag 2 bearbetning ca 3 timmar och även om det är märkt "Dag 2", den viktigaste kravet är att den del filterbearbetning bör utföras på en dag närdet finns ingen Dag 1 behandling förekommer i labbet.
- Utför den här proceduren inom 6 månader efter det att tillämpningen av leukocyter till filtret.
- Långtidsprovförvaring (15 min)
- Utför denna procedur varje dag, innan leveransen av nya Vacutainers till labbet för Dag 1 behandling. Överför cryovials som lagrats O / N i kontrollerade hastigheten fryscontainrar på dag 1 i lämpligt märkta cryoboxes och returnera dem till -80 ºC eller flytande kväve (ångfas) för långtidsförvaring. Organisera cryovials baserat på typ av prov (t.ex. DNA, PBMC, RBC, etc.) för att påskynda prov plats spårning för endpoint analyser.
- Leukocyt RNA Filter Processing (45 min).
Obs: Mer information om detta förfarande se tillverkarens instruktioner 17 för.- Ta filtret till RT (upptining ca 5 min).
- Avlägsna höljet och skruvlock från filtret. Dra tillbaka kolven i en 5 ml spruta och anslut den till inloppet (utsvängda änden) av filtret, tryck in kolvenatt utvisa RNA stabiliseringsmedel från filterportarna i ett biologiskt avfallsbehållare.
- Sätt i ett nytt 5 ml spruta med 4 ml av en fenol och guanidinisotiocyanat lösning för RNA-isolering och koppla den till inloppet av filtret, tryck in kolven att spola lösningen genom filtret, samla lysatet i en märkt 15 ml koniska rör (2 per deltagare).
- Koppla sprutan från filtret, dra tillbaka kolven, åter fästa den till filtret, och tryck in kolven att utvisa rest prov fastnar i filtret disk i samma 15 ml koniska rör. Släng filter och spruta.
- Tillsätt 800 pl BCP till den koniska rör, förslut röret tätt och kraftfullt skaka prep i 30 sekunder.
- Inkubera vid rumstemperatur under 5 minuter. Centrifugera i 10 minuter vid 2000 x g.
- Överför vatten (överst) fas till en nyligen märkt 15 ml koniskt rör (~ 2,5 ml).
- Tillsätt 0,5 gånger volymen av den vattenhaltiga fasen i nukleasfritt vatten end blanda väl. Sedan till 1,25 gånger den vattenhaltiga volymen av 100% etanol och blanda igen.
Obs: För en 2,5 ml vattenvolym, tillsätt 1,25 ml nukleas fritt vatten, blanda och tillsätt därefter 4,7 ml av 100% etanol (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml nukleas fritt vatten DÅ 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml ny vattenvolym DÅ 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% etanol). Detta steg möjliggör för isolering av totalt RNA som innefattar den lilla RNA-fraktion. En metod för att utelämna de små RNA från isoleringen kan hittas i handboken 17. - Avlägsna kolven från en 5 ml spruta och sätt i en spinn patron i dess ställe. Fäst kassetten / sprutenheten till en vakuumgrenrör. För en mer säker anslutning till vakuumgrenröret, placera patronen / sprutenheten inuti en 1,5 ml mikrocentrifugrör med botten avskurna.
- Applicera provet från steg 5.3.8 till spinnpatronen långsamt med vakuum på, försiktigt tillsätta mer prov när den dras genom patronen.
Obs: Om inget vakuumnärvarande, se centrifugeringsmetoden på http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Överför spinnpatronen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 750 pl tvätt 1. Centrifugera spinnkassetten / röraggregatet 5 - tio sek vid 12000 x g.
- Kassera filtrat från röret och returspinn patronen till samma mikrocentrifugrör.
- Lägg 750 pl tvätt 2 och centrifugera spin kassetten / rör 5 - 10 sekunder vid 12.000 x g. Kasta filtrat som i steg 5.3.12. Återgå spinnkassetten till samma mikrocentrifugrör.
- Upprepa med ytterligare 750 il Wash 2 och centrifugering som i steg 5.3.13. Släng filtrat. Återgå spinnkassetten till samma mikrocentrifugrör. Centrifugera spinnkassetten / rör vid maximal hastighet under 1 min för att torka filtret.
- Överför spinn patronen till en färsk, märkt 1,5 pl mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 200 pl nukleasfritt 0,1 mM EDTA (förvärmd till 80 & #176; C) till mitten av spinnpatronfilter (2 per deltagare). Inkubera vid rumstemperatur under 1 minut.
- Centrifugera under 1 min vid 12 tusen xg för att eluera RNA. Behåll filtratet. Kassera spinnpatron.
- Split varje 200 pl filtrat i två, 100 l alikvoter i nya 1,5 ml mikrorör, etikett och hålla på is. Vid denna punkt kommer att börja med 2 filter per deltagare ge fyra 100 il portioner av RNA per deltagare.
- DNas-behandling (1 h)
Obs: För mer information om denna behandling se tillverkarens protokoll 18.- Skapa en masterblandning genom att kombinera 10 il DNas I buffert och 2 pl rDNase I per portion + 1 (till svars för pipettering fel).
Obs: För fyra prover, 100 ul alikvoter använder 50 pl DNas I buffert + 10 pl rDNase I. - Alikvotera 12 ul av Master Mix i steg 5.4.1 i var och en av RNA-prover från steg 5.3.18 och blanda försiktigt. Inkubera vid 37° C under 30 minuter i ett värmeblock.
- Vortex DNas Inaktive Reagens och tillsätt 11,2 il till varje portion, blanda väl. Inkubera vid rumstemperatur under två minuter vortexa 2-3 gånger under inkubation.
- Centrifugera vid 10000 x g under 1,5 min.
- Överför supernatanten (RNA) till ett nytt 1,5 ml rör. Alikvoter från samma deltagare kan slås samman här.
- Kör varje prov på en spektrofotometer för att få koncentrationen. En kvalitetsanalys av RNA rekommenderas användning av en Bioanalyzer (se steg 5.5).
- Alikvotera RNA till cryovials såsom önskas. Om en Bioanalyzer analysen inte kommer att genomföras omedelbart, portion 1,5 il prov i ett mikrocentrifugrör för senare analys. Dokumentera koncentrationerna och frys starttid. Förvara proverna vid -80 ° C.
- Skapa en masterblandning genom att kombinera 10 il DNas I buffert och 2 pl rDNase I per portion + 1 (till svars för pipettering fel).
- Bioanalyzer Analys (1 timme)
- Följ tillverkarens protokoll 19. När körningen är klar, är data lagras automatiskt, men spara det igen wed en mindre, mer igenkännbar filnamn. Förväntade resultat (Figur 3): stegen ska ha 6 toppar, prover ska ha 3 toppar (2 ribosomala toppar vid 44 sek och 50 sek, respektive och en tidig markör topp vid 25 sek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det är viktigt att det övergripande förfarandet producera högkvalitativa material för analys i en mängd olika applikationer nedströms inklusive genuttryck via microarray och RT-PCR-analys, detektion av epigenetiska förändringar, och cell delmängd variationer. Tabell 1 visar den genomsnittliga avkastningen och kvalitet på material från var och en av processerna. Figur 3 ger ett exempel på utskriftskvalitet av bearbetningsmetoderna leukocyter RNA isolering och filter. Bilden på övre vänstra delen av figur 3 är den bild av gelen som följer av kapillärelektrofores. Varje bana ska producera två distinkta band med minimal skuggning som tyder nedbrytning. Kromatogrammen nedanför gelén tillhandahålla en ytterligare titt på den nivån och typen av nedbrytning som kan bestämmas baserat på placeringen och storleken av topparna. RNA Integrity Number (RIN) är en annan kvalitetsmått som sträcker sig från 1 (låg, nedbruten) till10 (hög, ren, god kvalitet-RNA).
En så hög genomströmning metod lämpar sig för en tillfällig fel, men det finns flera kontrollpunkter i hela de olika stadierna av behandling för att garantera kvalitetskontroll. Figur 2 visar den rätta separations efter centrifugering av Ficoll innehåller Vacutainer. Det finns flera skäl en vacutainer kan inte visa denna separation, inklusive ett fel i centrifugeringshastighet, låg samling volym, eller avsaknaden av en fasta deltagare enligt tabell 2.
Delmängder (n = 100) av exemplaren som isolerats med hjälp av detta förfarande har analyserats med framgång genom HumanMethylation27 (HM27) DNA-analys BeadChips inklusive validering av dessa resultat genom att Pyrosequencing 11. Genotypning, riktade bisulfit pyrosekvensering, och realtids-RT-PCR har utförts med godkänt resultat i Wildman och Uddin laboratorier 20,21,22,23. Serum, isolerade i parallelen med DNA-isolering för både Beadchip och genotypning analyser, lyckades analyserades för IL-6 och C-reaktivt protein-aktivitet 24. T-cell-underuppsättningar från de isolerade PBMC har framgångsrikt analyserades med flödescytometri 25-28. Dessutom har RNA från den modifierade leukocyter förfarandet utsatts för Genome Wide profilering av genuttryck 29.
Figur 2. skiktseparation efter centrifugering av Ficoll innehåller Vacutainer. En visualisering av separationen av flera blodkomponenter efter centrifugering. Det mononukleära skiktet renas ytterligare, medan de andra skikten lagras vid -80 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Förväntade resultat från leukocyter RNA-bearbetning. Bioanalyzer resultat visar två distinkta band som representerar 18S och 28S ribosomalt RNA med RNA integritet nummer (Rins) över 8 isolerade med de metoder som beskrivs leukocyter RNA-isolering och filter bearbetning (se protokoll 3.6 och 5.3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Totalt Genomsnittlig Avkastning (N≈500) | Genomsnittlig kvalitet | |
| Serum | 2,30 ml | N / A |
| DNA från helblod | 39.97 ^ ig | Absorbans vid 260/280 = 1,74 |
| PBMC | 22.25 miljoner levande celler | Minst 95% livsduglighet av den totala isolering |
| RNA från Leukocyter | 44,09 ^ g | Absorbans vid 260/280 = 2,01 RNA Integritet Number (RIN) = 6,48 |
Tabell 1. Den förväntade avkastningen. Genomsnittlig kvantitet och kvalitet prover bearbetas med de beskrivna metoder.
| Problem | Potentiell lösning |
| Ingen separation efter Ficoll innehållande Vacutainer centrifugering | Vacutainer är inte fyllda - den lägsta insamlingsvolymen för adekvat behandling är 6 ml. |
| Kontrollera centrifug inställningar, vara säker på att hastigheten är i g-kraft. Om den är felaktig, inställd på g-kraft och respin. | |
| Låg PBMC count | Volym av blod rita för lågt. |
| Aspireras för nära pelleten i steg 3.7.8 | |
| Icke-fastande deltagare. | |
| Ingen separation efter serum Vacutainer centrifugering | Kontrollera centrifug inställningar, vara säker på att hastigheten är i g-kraft. Om den är felaktig, inställd på g-kraft och respin. |
| Oväntad koncentration med användning av Nanodrop 1000 | Se till att mätningen är för det aktuella provtypen (t.ex. DNA eller RNA). |
Tabell 2. Felsökning. Vanliga problem med de beskrivna metoder och möjliga lösningar.
Kompletterande Tabell 1. Spårning ark. Ett exempel på spåra Vacutainers tillbakam blodinsamling laboratorie leverans. Klicka här för att se tabellen.
Kompletterande tabell 2. Provloggen. Ett exempel på det dokument som används för att dokumentera behandlingen av Vacutainers vid leverans till labbet. Klicka här för att se tabellen.
Kompletterande Tabell 3. cryovial numreringssystem. Ett exempel på det numreringssystem som används för varje deltagare. Klicka här för att se tabellen.
Tilläggsinformation 1. förbearbetning detaljer. Detaljer plikter studiekoordinator, Courier och Phlebotomist. Klicka här för att se kompletterande information 1.
Tilläggsinformation 2. recept. En lista över recept för nödvändiga reagens. Klicka här för att se kompletterande information 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit en strömlinjeformad protokoll som har framgångsrikt tillämpats för att behandla mer än 1600 helblodsprover i Detroit området Health Study. Även om många av dessa tekniker finns i befintlig litteratur, vår steg-för-steg sammanställning, inklusive exakt tidsinställda förändringar mellan varje steg, speglar en optimerad, effektiv protokoll som framgångsrikt producerar en mängd olika biologiska prover med ett brett spektrum av tillämpningar nedströms, inklusive DNA-metylering, mRNA-expression och immunologisk analys. Dessa prover har redan testats i en mängd olika experiment, resultat som har publicerats i expertgranskade litteratur och / eller presenteras på nationella möten 11,20,21,23,24,29. Detta protokoll bör därför vara av intresse för andra forskare som vill samla in biologiska prover i populationsbaserade studier som liknar DNHS.
Vid bearbetning av prover i en sådan hög-throughput sätt, är det av yttersta vikt att föra korrekta journaler på alla stadier. Vi rekommenderar att utveckla en databas för att lagra all cryovial informationen från början. Denna databas bör omfatta alla aspekter av provet inom varje cryovial inklusive volym, koncentration, kvalitet, streckkod, och lagringsplats (förvaringsbox antal och placering i rutan). Vi rekommenderar förbereder pre-märkta cryovials och förvaringsboxar som innehåller en streckkod. Vidare har vi funnit det lämpligt att ha en "master" dokument som innehåller streckkoder för varje rör, som är specifika för varje deltagare (tabell S3). Detta möjliggör snabb inmatning av de cryovial data i databasen utan överdriven hantering av proverna, införa onödiga frysning / upptiningscykler till proverna och eliminerar risken för mänskliga fel att gå in i streckkoder manuellt. Det är också viktigt att etiketterna fastnar vid extrema (t.ex. ångfasen av flytande kväve -178 till -150ºC) temperaturer. Dokumentationen kan vara tidskrävande, och nödvändigheten av en effektiv behandling vid leverans, har vi funnit att ha åtminstone två tekniker dela processerna ger störst effektivitet.
En begränsning med denna metod är närheten till laboratoriet till uppsamlingsstället. För PBMC isolering i synnerhet måste proverna bearbetas inom 2 timmar insamling för att undvika betydande ökningar av röda blodsmitta cell och minskar i livskraftiga mononukleära celler. Som sådan bör laboratoriet inte vara mer än 30 minuter från en insamlingsplats för att ta hänsyn till eventuella trafikrelaterade problem som kan uppstå. Förutom att alla laboratorier föreslå genomföra det protokoll som beskrivs här kommer att kräva två tekniker på plats för att säkerställa en optimal prov behandling. Dessutom måste varje laboratorium ha tillgång till nödvändig utrustning för varje steg som beskrivs ovan. Således, laboratorier med färre personal och / eller begränsad utrustning wOuld sannolikt inte att kunna genomföra detta protokoll.
En fördel med detta protokoll är förmågan att samla prover direkt i hemmen av samtyckande personer. Detta gör studien att nå personer med psykiska eller andra hälsoproblem som inte skulle normalt söker medicinsk hjälp, kanske på grund av bristande försäkrings- eller transport. Det också möjligt att jämföra drabbade och ej drabbade individer som lever i samma gemenskap som har upplevt liknande triggers, men skiljer sig i fråga om deras psykiska symtom. Erhålla prover på detta sätt kräver noggrann timing och samordning av phlebotomists inom området. Eftersom vårt laboratorium var beläget inom gemenskapen vi studerade, skulle en phlebotomist typiskt samla in prover från två-tre bostäder och levererar proverna till laboratoriet inom 2 timmar fönster den första samlingen. Effektivitet är nyckeln till vår prov bearbetning, och som sådan, hade vi flera phlebotomists ifält, ökar behovet av exakt samordning. Laboratoriet fått leveranser flera blod med upp till åtta deltagare per leverans avstånd 2 h mellanrum. De phlebotomists träffades på en anvisad plats och kombinerade sina samlingar med endast en phlebotomist leverera prover till laboratoriet som ett enda parti. De metoder som beskrivs här kan lätt anpassas för att studera många andra fenotyper och de biologiska prover som tagits kan användas i en mängd olika analyser i senare led.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
- Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
- Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
- Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
- Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
- Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
- Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
- Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
- Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
- Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
- Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
- Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
- Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
- Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
- Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
- Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
- Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
- Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
- Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
- Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
- Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
- Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
- Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
- Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
- Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).
