טכניקה זעיר-פולשני להזרקה לתוך עצב העכברוש אופטי

Introduction

עצב הראייה מספק מיקום אידיאלי למערכת עצבים מרכזית (CNS) מחקר משובי לרבות תנאי ophthalmologic כגון דלקת בעצב ראיה, גלאוקומה וטראומה. זריקות של מגוון רחב של תאי גזע שגם הוכיחו את יעילות או הראו הבטחה בהחלפת המיאלין האבוד, הגדלת ספירת axonal ו / או מניעת מחלות ניווניות. ^1,2

עצב הראייה האנושי מכיל כ -1.2 מיליון האקסונים מקבילים נסיעה מהרשתית אל התצלובת בקוטר של כ 3.0-3.5 מ"מ. ³ מודל מחלות בבני אדם במעבדה, החולדה כבר בשימוש לעתים קרובות. עצב הראייה החולדה הבוגרת מכיל כ -100,000 האקסונים בקוטר של כ 0.5 מ"מ. ⁴ אחת המגבלות העיקריות במערכת העצבים המרכזית מחקר משובי הוא גישה ישירה ללא עצמות. סיבוכים וסיכונים הכירורגיים לבעלי החיים הם גבוהים יותר כאשר הגולגולת או החוליות יוסרו. בדומה ליתרונות שלגישות זעירים פולשנית בעמוד השדרה, ⁵ זריקות עצב ראייה ישירות מבלי לפתוח את סיבוכי הצעה מופחתות גולגולת והתאוששות מהירה יותר.

טכניקה זו נעשתה שימוש במחקרים קודמים. ⁶ בכתב היד הזה ווידאו נלווה, אנחנו מדגימים הליך מינימאלי פולשנית להזריק תאי גזע לעצב הראייה החולדה.

Protocol

הערה: נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג'ונס הופקינס. מכונות הרדמה דורשות בדיקה שנתית וכיול כנדרש.

1. הרדמה ומיצוב

1. הרדמה.
   1. לבצע את כל הניתוחים בהרדמה עם isofluorane 2-3%. אשר רמה המתאימה של הרדמה על ידי צביטת הבוהן וקצב נשימה. בדוק שהחולדה לא נרתעה בתגובה לקמצוץ הבוהן.
      הערה: נרתע מצביע הרדמה שתהיינה מאוחר מדי ועשוי לדרוש הרדמה כבר לפני תחילתו או בריכוז גבוה יותר isofluorane. קצב נשימה פחות מנשימה 1 כל 2 שניות היא איטיות מדי מצביע ההרדמה הוא גבוה מדי ועשוי לדרוש הבהרה של ריכוז isofluorane.
   2. אבטח את בעלי החיים כנדרשים כדי למנוע תנועת הראש במהלך ההליך. מניחים ירידה של לידוקאין על העין כירורגית. השתמש דמעות מלאכותיות כל 10 דקות כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. תןהזרקה של עצירות של 0.01 מ"ג / קילוגרם כל שעות 6-8 SC מראש אופרטיבי ולאחר מכן לפי צורך.
2. מיקום.
   1. מניחים חולדות למסגרת stereotaxic ולהתחמם עם כרית חימום. להרטיב את הפרווה הקרקפת עם טיפול נטילת אלכוהול, כדי למנוע חשיפה בעיניים. השתמש בכלים סטריליים וטכניקה סטרילית כדי למזער את הסיכון של זיהומים לאחר ניתוח.

2. עין בקרה

1. מניחים תפר 4-0 בלחמית הרוחב ולקשור אותו עם מספיק תפר להתיר מתיחה עדינה.

3. Dissection

1. Dissection הראשוני.
   1. לעשות חתך אינץ '~ 1 בעור שמעל רכס מסלולית באמצעות אזמל גודל 10 כפי שמוצג באיור 1. לחזור בו העור ואת fascia הבסיסי ולנתח בזהירות את fascia. כדי למנוע דימום יתר לניתוח, להימנע מחיתוך כלי דם בזמן לנתח את fascia. השתמש אסטרטגי plטיפים כותנה aced לספק עצירת דימום.
2. Dissection עמוק יותר.
   הערה: עם מתיחה עדינה על לחמית משיכת העין כלפי מטה והחוצה מהשקע, השרירים מסלולית מעולים יבואו לעין. כדי לחשוף את עצב הראייה, שרירים זה יש לחתוך ולהסיר את שומן רטרו מסלולית. השומן יכול להיות מושלך ולא צריך להיות מוחלף לאחר הזרקה. מנקודה זו, fascia עצב הראייה צריך להיות גלוי כחבילה של עצב הראייה עצמו, יחד עם כלי דם עטופים בדורה (איור 1).
   1. לעשות חתך קטן בדורה באמצעות האזמל או מחט משופעת 31 מד לעשות פירסינג פחות טראומטי.

4. פיפטה מזרק

1. משוך micropipette זכוכית לקוטר של 50-100 מיקרומטר. כדי לספק יציבות, הר micropipette על micromanipulator ולצרף מזרק המילטון מחובר למשאבת עירוי.
2. משוך את חרוזים (או תאי גזע)מחדש ב0.5-1.0 μl נפח לmicropipette מדרדר יחד עם 0.5 μl נפח של פתרון כחול מתיל לפני ואחרי.
   הערה: קצב עירוי מוגדר 0.5-2 μl לדקה מונעת טראומה לעצב הראייה.

5. הזרקה

1. מנמיכים את קצה micropipette על עצב הראייה מעל הדורה חתוכות.
   הערה: תנועה זעירה, אך נמרצת של הקצה של הכוס לתוצאות עצב ראייה בנזק לפחות. כמשאבת העירוי מתחילה, הצבע הכחול מתיל צריך להדגיש את האזור של עצב הראייה המוזרק. הצבע צריך להישאר מקומי בעצב הראייה ללא דולף החוצה בחלל תת-העכבישים.
2. בצע את הלהקה השנייה של מתיל כחול כדי לקבוע מתי הזרקת תאי גזע היא מלאה ולכבות את משאבת העירוי כמנה השנייה של מתיל כחול מוזרקת. שמור micropipette עדיין בתוך עצב הראייה למשך 2 דקות לכל μl 1 מוזרק לתוך נפח למנוע גבוהפליטת לחץ על נסיגה של micropipette.
   הערה: גישה חלופית היא לחבר את קצה פיפטה למזרק מלא אוויר שניתן לטפל באופן ידני. כך או כך, למנוע בכוח מופרז כדי למזער את הנזק לעצבי ראייה. אנו ממליצים הזרקה לא יותר מ -2 μl של נפח בכל עצב ראייה.

6. מעקב

1. מיידי.
   1. כאשר ההזרקה היא מלאה, להסיר את micropipette יחד עם כל טיפים כותנה משמשים כדי לספק עצירת דימום. לתפור את העור עם 3-0 משי ולהסיר את התפר של הלחמית.
   2. שמור חולדות חמות על כרית חימום עד שהם יוצאים מהרדמה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא.
   3. אם בעל החיים הוא מציגים סימנים של כאב, כולל עייפות אטקסיה, נשימה מוגזמת, או מאומצתg, לנהל שיכוך כאבים מתאימים עם עצירות תוך שרירית (0.05 מ"ג / קילוגרם) עד שלוש פעמים ביום.
2. טווח ארוך.
   1. לשעה 24-48 הבאה, לבחון את החולדה לסיבוכים של ניתוח כוללים נפיחות או הפרשה מהפצע או סימנים אחרים של כאב כמו בדיבור, מראה כפוף, לא טיפוח, או לא אוכל. לשקול התייעצות עם וטרינר או המתת חסד אתי כנדרש.

Representative Results

בסיומו של הניסוי, חולדות הוקרבו וperfused עם paraformaldehyde 4%. עצבי הראייה נותחו בזהירות ורכובים על חתך cryostat. איור 2 מראה דוגמא של עצב עכברוש כל אופטי בצריכת חשמל נמוכה שבצבע הכחול אוונס שהוזרק כדי להמחיש את האתר. החץ מזהה את המיקום המדויק של ההזרקה. נתיחה זה נעשתה תוך כמה דקות של ההזרקה כפי שצוינה על ידי דיפוזיה המוגבל של הצבע לאורך העצב. בזריקות אחרות, שראינו דיפוזיה איטית של צבע לעבר התצלובת הראייה במהלך מספר שעות.

איור 1:. שדה כירורגי מבט החולדה ממוקמת עם הגישה לעין השמאל בנתון זה. מבצע חתך מעל הרכס מסלולית וfascialרקמה גזור למטה מאחורי העין. תפר הלחמית מאפשר למפעיל להחיל מתיחה עדינה שמושכת את עצב הראייה תוך גולגולתי לעין מבלי לפתוח את הגולגולת.

איור 2:. נתיחה גולמית של עצב ראייה הזריק ניצול צבע כחול אוונס, אתר ההזרקה בעצב הראייה ניתן דמיין גס תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בתמונה זו, עצב הראייה נחתך במקום ההזרקה להראות הצבע מוטבע בתוך רקמת עצב הראייה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lewis rat	Charles River	4	Any rat strain will work.
Anesthesia machine	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount
Infusion pump	Stoelting	53129
Dissection microscope	National Optical	409-411-1105
Fiber-optic light source	Fisher Scientific	12-562-21
Dissection and Stereotaxic Instrument	Stoelting	51400
Pipette Puller	Kopf	750
Pipettes	World Precision Instruments	18150-6
Disposable scalpel blades	Harvard Apparatus	810-15-021
Iridectomy scissors	Electron Microscopy Sciences	Uniband LA-4XF