Introduction
Il nervo ottico offre una posizione ideale per il sistema nervoso centrale (SNC) ricerca rigenerativa comprese le condizioni oftalmologiche quali neurite ottica, glaucoma e traumi. Iniezioni di una varietà di cellule staminali hanno né dimostrato l'efficacia o mostrato risultati promettenti nel sostituire persi mielina, aumentando conta assonale e / o prevenire le malattie degenerative. 1,2
Il nervo ottico umano contiene circa 1,2 milioni di assoni parallele viaggiano dalla retina al chiasma con un diametro di circa 3,0-3,5 mm. 3 Per modellare malattie umane in laboratorio, il ratto è stato utilizzato di frequente. Il nervo ottico ratto adulto contiene circa 100.000 assoni in un diametro di circa 0,5 mm. 4 Una delle maggiori limitazioni nella CNS ricerca rigenerativa è l'accesso senza osso diretto. Complicanze e rischi chirurgici per l'animale più elevati, se il cranio o vertebre vengono rimossi. Simile ai benefici dellaapprocci minimamente invasivi nella colonna vertebrale, 5 iniezioni del nervo ottico diretti senza aprire il cranio offrono ridotto complicazioni e un recupero più rapido.
Questa tecnica è stata utilizzata in studi precedenti. 6 In questo manoscritto e video che accompagna, dimostriamo una procedura minimamente invasiva per iniettare le cellule staminali nel nervo ottico topo.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato uso Johns Hopkins. Macchine per anestesia richiedono ispezione annuale e la calibrazione, se necessario.
1. Anestesia e Posizionamento
- Anestesia.
- Eseguire tutte le procedure chirurgiche in anestesia con 2-3% isofluorane. Confermare adeguato livello di anestesia da un pizzico punta e tasso di respirazione. Verificare che il topo non si muove in risposta ad un pizzico piedi.
NOTA: Un sussulto indica anestesia che è troppo tardi e può richiedere l'anestesia più lunghi prima di iniziare o una maggiore concentrazione isofluorane. Un tasso di respirazione inferiore 1 soffio ogni 2 secondi è troppo lento indica l'anestesia è troppo elevata e può richiedere alleggerimento della concentrazione isofluorano. - Fissare l'animale come necessario per evitare il movimento della testa durante la procedura. Mettere una goccia di lidocaina sull'occhio chirurgica. Utilizzare lacrime artificiali ogni 10 minuti per evitare la secchezza mentre sotto anestesia. Dareuna iniezione di buprenorfina di 0,01 mg / kg SC pre-operatorio e poi ogni 6-8 ore, se necessario.
- Eseguire tutte le procedure chirurgiche in anestesia con 2-3% isofluorane. Confermare adeguato livello di anestesia da un pizzico punta e tasso di respirazione. Verificare che il topo non si muove in risposta ad un pizzico piedi.
- Posizionamento.
- Mettere i ratti in un telaio stereotassico e tenere in caldo con una piastra elettrica. Bagnare il pelo cuoio capelluto con alcool avendo cura di evitare l'esposizione sugli occhi. Utilizzare strumenti sterili e tecnica sterile per ridurre al minimo il rischio di infezioni post-operatorie.
2. Controllo Eye
- Posizionare un 4-0 sutura nella congiuntiva laterale e legarlo con abbastanza sutura per consentire dolce trazione.
3. Dissection
- Dissezione iniziale.
- Fare un pollice un'incisione ~ 1 nella pelle sovrastante cresta orbitale utilizzando una dimensione di 10 bisturi come mostrato in Figura 1. Ritrarre la pelle e la fascia sottostante e sezionare accuratamente via la fascia. Per evitare un eccessivo sanguinamento nel chirurgica, evitare di tagliare i vasi sanguigni, mentre sezionare la fascia. Utilizzare strategicamente plpunte di cotone ACED per fornire emostasi.
- Deeper dissezione.
NOTA: Con una leggera trazione sulla congiuntiva tirando l'occhio giù e dalla presa, il muscolo orbitale superiore entrerà in vista. Al fine di esporre il nervo ottico, questo muscolo deve essere tagliato e il grasso retro-orbitale rimosso. Il grasso può essere scartato e non deve essere sostituito dopo l'iniezione. Da questo punto, la fascia nervo ottico deve essere visibile come un fascio del nervo ottico stesso, insieme con i vasi sanguigni avvolte in dura (Figura 1).- Fai una piccola incisione nella dura con il bisturi o con un ago smussato 31 calibro di rendere penetrante meno traumatico.
4. Pipetta Injector
- Estrarre una micropipetta di vetro ad un diametro di 50-100 micron. Per fornire la stabilità, montare la micropipetta su un micromanipolatore e legarsi a una siringa Hamilton collegato ad una pompa di infusione.
- Tirare le perline (o cellule staminali)ricostituito in un volume 0,5-1,0 microlitri nella micropipetta retrogrado insieme con 0,5 ml di volume di soluzione di blu di metile prima e dopo.
NOTA: Una velocità di infusione impostata 0,5-2 microlitri al minuto evita traumi al nervo ottico.
5. Iniezione
- Abbassare la punta della micropipetta sul nervo ottico appena sopra la dura intaccate.
NOTA: Un piccolo, ma vivace movimento della punta di vetro nei risultati del nervo ottico nel minor danno. All'inizio della pompa di infusione, il colorante blu di metile dovrebbe evidenziare l'area del nervo ottico iniettato. Il colorante deve rimanere localizzata all'interno del nervo ottico senza fuoriuscire nello spazio subaracnoideo. - Seguire la seconda banda di blu di metile per determinare quando l'iniezione di cellule staminali è completa e ruotare la pompa di infusione fuori come la seconda dose di blu di metile viene iniettato. Mantenere la micropipetta ancora all'interno del nervo ottico per 2 minuti per ogni volume 1 microlitri iniettato per prevenire altopressione espulsione al momento della revoca della micropipetta.
NOTA: Un approccio alternativo è quello di collegare la punta della pipetta ad una siringa riempita di aria che può essere manipolato manualmente. In entrambi i casi, evitare una forza eccessiva per ridurre al minimo i danni ai nervi ottici. Si consiglia di iniettare più di 2 ml di volume in ogni nervo ottico.
6. Follow-up
- Immediato.
- Quando l'iniezione, rimuovere la micropipetta insieme a qualche consiglio di cotone usati per fornire emostasi. Suturare la pelle con 3-0 seta e rimuovere la sutura congiuntivale.
- Tenere ratti caldo su una piastra elettrica fino a quando non emergono dall'anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
- Se l'animale sta esibendo i segni del dolore, letargia eccessiva, atassia, o Breathin affannosog, amministrare l'analgesia appropriata con buprenorfina per via intramuscolare (0,05 mg / kg) fino a tre volte al giorno.
- Lungo termine.
- Per il prossimo 24-48 ore, osservare il topo per le complicazioni di un intervento chirurgico, tra cui gonfiore o scarico dalla ferita o altri segni di dolore, come vocalizzi, aspetto curvo, non governare, o non mangiare. Considerare consultato un veterinario o l'eutanasia etico, se necessario.
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Representative Results
Al termine dell'esperimento, i ratti sono stati sacrificati e perfusi con paraformaldeide al 4%. I nervi ottici sono stati accuratamente sezionati e montate per criostato sezionamento. La Figura 2 mostra un esempio di un ratto intera nervo ottico a bassa potenza in cui Evans colorante blu è stato iniettato per visualizzare il sito. La freccia indica la posizione precisa di iniezione. Questo dissezione è stato fatto entro pochi minuti dell'iniezione come indicato dalla diffusione ristretta del colorante lungo il nervo. In altre iniezioni, abbiamo osservato una lenta diffusione di colorante verso chiasma ottico nel corso di diverse ore.
Figura 1:. Campo di vista chirurgico Il ratto è posizionato per accedere con l'occhio sinistro in questa figura. Viene praticata un'incisione sopra la cresta orbitale e il fascialeil tessuto è sezionato giù dietro l'occhio. Una sutura congiuntivale permette all'operatore di applicare lieve trazione che tira il nervo ottico intracranica in vista senza aprire il cranio.
Figura 2:. Dissezione lordo di nerve iniettato ottico Utilizzando Evans colorante blu, il sito di iniezione nel nervo ottico può essere grossolanamente visualizzato al microscopio dissezione. In questa immagine, il nervo ottico è stato tagliato al sito di iniezione per mostrare il colorante incorporato nel tessuto nervo ottico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
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