Introduction
視神経は、中枢神経系（CNS）は、視神経炎、緑内障および外傷などの眼科条件を含む再生研究のための理想的なロケーションを提供します。幹細胞の種々の注射は、いずれかの軸索の数を増加させ、および/ または変性疾患を予防効果を示したか、失われたミエリンの取り付けの見込みを示している。1,2
人間の視神経が約3.0〜3.5ミリメートルの直径を有する視交叉に網膜から走行約120万平行軸索が含まれています。3、実験室でヒト疾患をモデル化するために、ラットは、頻繁に使用されています。成体ラットの視神経は、約0.5mmの直径内に約10万軸索を含んでいます。CNS再生研究の主な制限の4つは、直接骨なしアクセスです。頭蓋骨や脊椎骨が除去されたときに、動物に、合併症、手術リスクが高くなっています。の利点と同様に、頭蓋骨のオファー減少合併症、より迅速な回復を開かずに脊椎における低侵襲アプローチ、5直接視神経注射。
この技術は、以前の研究で使用されてきた。6本稿および付随ビデオでは、我々はラット視神経に幹細胞を注入するための低侵襲性の手順を示します。
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Protocol
注：すべての動物の手順は、ジョンズ·ホプキンス大学動物実験委員会によって承認されました。麻酔機は、必要に応じて毎年点検とキャリブレーションが必要です。
1.麻酔とポジショニング
- 麻酔。
- 2〜3％のイソフルラン麻酔下で、すべての外科的処置を実行します。つま先のピンチと呼吸数による麻酔の適切なレベルを確認してください。ラットはつま先のピンチに反応して尻込みしていないことを確認してください。
注：フリンチは遅すぎる麻酔を示し、開始前に長い麻酔以上イソフルラン濃度を必要とする場合があります。 2秒ごとに麻酔を示す遅すぎる1息未満の呼吸率が高すぎて、イソフルラン濃度の軽量化が必要な場合があります。 - 手順中にヘッドの移動を避けるために、必要に応じて動物を固定します。外科的な目にリドカインのドロップを置きます。麻酔下ながら乾燥を防止するために、人工涙液を10分ごとに使用します。与えます0.01ミリグラム/ kgのSC手術前にし、その後、6-8時間のブプレノルフィンの注射は、必要に応じて。
- 2〜3％のイソフルラン麻酔下で、すべての外科的処置を実行します。つま先のピンチと呼吸数による麻酔の適切なレベルを確認してください。ラットはつま先のピンチに反応して尻込みしていないことを確認してください。
- ポジショニング。
- 定位フレームにラットを配置し、加熱パッドで暖かく保ちます。目の露出を避けるために注意しながらアルコールと頭皮の毛をぬらし。術後感染症のリスクを最小限に抑えるために、滅菌ツールおよび滅菌技術を使用してください。
2. Eyeコントロール
- 横結膜に4-0縫合糸を置き、穏やかなトラクションを可能にするのに十分な縫合糸でそれを結びます。
3.解剖
- 最初の解剖。
- 図1に示すように、サイズ10メスを用いて軌道尾根の上を覆う皮膚中〜1インチの切開を行います。皮膚とその下の筋膜を引っ込め、慎重に筋膜を離れて解剖。外科的に過度の出血を防止するために、筋膜を切開しながら、血管を切断しないようにします。 PL戦略的に使用します止血を提供するために、綿のヒントを出し抜か。
- 深く解剖。
注：ダウンし、ソケットから目を引く結膜にやさしい牽引すると、優れた軌道筋肉が見えてきます。視神経を露出させるために、この筋肉を切断する必要があり、眼窩脂肪を除去しました。脂肪は破棄することができ、注入後に交換するべきではありません。この点から、視神経筋膜は、硬膜に包まれた血管（ 図1）と一緒に、視神経自体の束として表示される必要があります。- 低外傷性穿孔するためにメスまたは31ゲージベベル針を用いて硬膜内の小さな切開を行います。
4.ピペットインジェクタ
- 50〜100ミクロンの直径にガラスマイクロピペットを引き出します。安定性を提供するために、マイクロマニピュレータにマイクロピペットをマウントし、注入ポンプに接続されたハミルトンシリンジに接続します。
- ビーズを引き上げ（または幹細胞）前後のメチルブルー溶液0.5μlの体積と一緒に逆行マイクロピペットに0.5〜1.0μlのボリュームに再構成しました。
注：毎分0.5〜2μLに設定注入速度は、視神経への外傷を防ぐことができます。
5.インジェクション
- ただ、ニックの入った硬膜上記視神経にマイクロピペットの先端を下げます。
注：少なくとも損傷で視神経結果にガラスチップの小さな、しかし、活発な動き。輸液ポンプが始まると、メチル青色色素を注入視神経の領域を強調表示する必要があります。色素はくも膜下腔に漏出することなく、視神経内に局在したまま必要があります。 - 幹細胞の注入が完了すると判断し、メチルブルーの第二の用量が注入されるように注入ポンプをオフにするためにメチルブルーの第2帯域に従ってください。高い防ぐために注入し、それぞれ1μlのボリュームの2分間の視神経内にまだマイクロピペットを保ちますマイクロピペットの離脱時の圧力噴出。
注：別のアプローチは、手動で操作することができ、空気充填された注射器にピペットチップを接続することです。いずれにしても、視神経の損傷を最小限に抑えるために無理な力を避けます。私たちは、それぞれの視神経にボリュームのない2以下μLを注入することをお勧めします。
6.フォローアップ
- 即時。
- 注入が完了すると、止血を提供するために使用される任意の綿のヒントと一緒にマイクロピペットを削除します。 3-0シルクで皮膚を縫合し、結膜縫合糸を除去します。
- 彼らは麻酔から出てくるまで、加熱パッド上に暖かいラットをしてください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。
- 動物は、過度の嗜眠、運動失調、またはこじつけbreathin含む痛みの徴候を示している場合gであり、1日3回まで筋肉内ブプレノルフィン（0.05ミリグラム/ kg）で適切な鎮痛を管理します。
- 長期。
- 次の24〜48時間、腫れや放電傷から、またはそのような発声、猫背外観、非グルーミング、または食べていないような痛みの他の徴候を含む、手術の合併症のラットを観察します。必要に応じて獣医師や倫理的安楽死との協議を検討してください。
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Representative Results
実験の終わりに、ラットを屠殺し、4％パラホルムアルデヒドで灌流しました。視神経を注意深く切開し、クライオスタット切片のために取り付けられた2はエバンスブルー色素部位を可視化するために注入された低電力でラット全視神経の一例を示す図 。矢印は注射の正確な位置を特定します。神経ダウン色素の制限拡散によって示されるように、この切開は、注射の数分以内に行われました。他の注射では、数時間かけて視交叉に向けて染料の遅い拡散を観察しています。
図1：ビューの外科分野のラットは、この図では、左眼にアクセスするために配置されています。切開を軌道尾根と筋膜の上に作られて組織は、目の後ろにダウン解剖されます。結膜縫合糸は、オペレータが頭蓋骨を開くことなくビューに頭蓋内視神経を引く穏やかなトラクションを適用することができます。
図2：注入された視神経の総解剖エバンスブルー色素を利用するには、視神経における注射部位は、肉眼解剖顕微鏡下で可視化することができます。この画像では、視神経を視神経組織内に埋め込まれた染料を表示するために注射部位で切断しました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
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