ラットの視神経への直接注射は、再生研究に役立ちます。私たちは、頭蓋骨を開くことなくラットの視神経に直接注射する低侵襲技術を示しています。この方法を使用すると、外科的合併症が最小限に抑えられ、回復が迅速になります。
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この記事について
サマリー
要約
ラットの視神経は幹細胞再生研究のための有用なモデルです。ラット視神経への直接注射により、骨を切除することなく低侵襲手術で中枢神経系に送達することができます。この技術は、眼窩隆起からの軽度の筋膜解剖後の視神経の視覚化と直接注入へのアプローチを説明しています。結膜牽引縫合糸を使用して、眼球を穏やかに引き下げて引き抜きます。視神経を注入した代表的な例は、染色したビーズの注入が成功したことを示しています。
概要
視神経は、中枢神経系（CNS）は、視神経炎、緑内障および外傷などの眼科条件を含む再生研究のための理想的なロケーションを提供します。幹細胞の種々の注射は、いずれかの軸索の数を増加させ、および/ または変性疾患を予防効果を示したか、失われたミエリンの取り付けの見込みを示している。1,2
人間の視神経が約3.0〜3.5ミリメートルの直径を有する視交叉に網膜から走行約120万平行軸索が含まれています。3、実験室でヒト疾患をモデル化するために、ラットは、頻繁に使用されています。成体ラットの視神経は、約0.5mmの直径内に約10万軸索を含んでいます。CNS再生研究の主な制限の4つは、直接骨なしアクセスです。頭蓋骨や脊椎骨が除去されたときに、動物に、合併症、手術リスクが高くなっています。の利点と同様に、頭蓋骨のオファー減少合併症、より迅速な回復を開かずに脊椎における低侵襲アプローチ、5直接視神経注射。
この技術は、以前の研究で使用されてきた。6本稿および付随ビデオでは、我々はラット視神経に幹細胞を注入するための低侵襲性の手順を示します。
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プロトコル
注：すべての動物の手順は、ジョンズ·ホプキンス大学動物実験委員会によって承認されました。麻酔機は、必要に応じて毎年点検とキャリブレーションが必要です。
1.麻酔とポジショニング
- 麻酔。
- 2〜3％のイソフルラン麻酔下で、すべての外科的処置を実行します。つま先のピンチと呼吸数による麻酔の適切なレベルを確認してください。ラットはつま先のピンチに反応して尻込みしていないことを確認してください。
注：フリンチは遅すぎる麻酔を示し、開始前に長い麻酔以上イソフルラン濃度を必要とする場合があります。 2秒ごとに麻酔を示す遅すぎる1息未満の呼吸率が高すぎて、イソフルラン濃度の軽量化が必要な場合があります。 - 手順中にヘッドの移動を避けるために、必要に応じて動物を固定します。外科的な目にリドカインのドロップを置きます。麻酔下ながら乾燥を防止するために、人工涙液を10分ごとに使用します。与えます0.01ミリグラム/ kgのSC手術前にし、その後、6-8時間のブプレノルフィンの注射は、必要に応じて。
- 2〜3％のイソフルラン麻酔下で、すべての外科的処置を実行します。つま先のピンチと呼吸数による麻酔の適切なレベルを確認してください。ラットはつま先のピンチに反応して尻込みしていないことを確認してください。
- ポジショニング。
- 定位フレームにラットを配置し、加熱パッドで暖かく保ちます。目の露出を避けるために注意しながらアルコールと頭皮の毛をぬらし。術後感染症のリスクを最小限に抑えるために、滅菌ツールおよび滅菌技術を使用してください。
2. Eyeコ....
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結果
実験の終わりに、ラットを屠殺し、4％パラホルムアルデヒドで灌流しました。視神経を注意深く切開し、クライオスタット切片のために取り付けられた2はエバンスブルー色素部位を可視化するために注入された低電力でラット全視神経の一例を示す図 。矢印は注射の正確な位置を特定します。神経ダウン色素の制限拡散によって示されるように、この切開は、注射の数分以内に行われました。他の注射では、数時間かけて視交叉に向けて染料の遅い拡散を観察しています。
図1：ビューの外科分野のラットは、この図では、左眼にアクセスするために配置されています。切開を軌道尾根と筋膜の上に作られて組織は、目の後ろにダウン解剖されます。結膜縫合糸は、オペレータが頭蓋骨を開くことなくビューに頭蓋内視神経を引く穏やか.......
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ディスカッション
幹細胞または再生を促進することを目的とした他の製品の視神経への直接注射は、CNSへの他の注射手段と比較して便利なモデルを提供します。この技術は、時間がかからず、全麻酔が少なくて済み、頭蓋骨や骨組織の穴あけや除去を回避し、合併症の発生率を減らし、手術後のより迅速な回復を可能にします。
このプロトコルの最も重要なステップには、次のものが含まれます: 1. 視神経束を明確に視覚化できるようにするための手術野での適切な止血、2. 最小限の外傷で視神経に簡単に挿入できるピペットチップの正確な測定、3. 視神経の最適な露出を可能にする結膜縫合糸を使用した眼の厳密な制御。
視神経への代替の側方アプローチは以前に説明されており、頭蓋骨を解剖することなく視神経に直接注射することもできます。6 私たちの経験では、側視は網膜のすぐ後ろの極近位視神経に限定されています。私たちの優れたアプローチでは、視神経の大部分が見えるため、近位視神経と中視神経の両方に注射できます。
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開示事項
著者らは報告すべき有意義な開示を持っていません。
謝辞
この研究は、NeuralStem, Inc.とJohns Hopkins Project RESTOREの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ルイスラット | チャールズリバー4 | ラット株でも機能します。 | |
| 麻酔器 | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 小動物麻酔器 - ポールマウント |
| 輸液ポンプ | Stoelting | 53129 | |
| 解剖顕微鏡 | National Optical | 409-411-1105 | |
| 光ファイバー光源 | フィッシャーサイエンティフィック | 12-562-21 | |
| 解剖および脳定位固定装置 | Stoelting | 51400 | |
| ペットプー | ラーKopf | 750 | |
| ピペット | 世界精密機器 | 18150-6 | |
| 使い捨てメスブレードハーバー | ド装置 | 810-15-021 | |
| 虹彩切除はさみ | 顕微鏡科学 | ユニバンドLA-4XF |
参考文献
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S.
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再版と許可
