Introduction
Зрительный нерв представляет собой идеальное место для центральной нервной системы (ЦНС) регенеративной исследований, включая офтальмологических заболеваний, таких как неврит зрительного нерва, глаукома и травмы. Инъекции различных стволовых клеток либо продемонстрировали эффективность или показали обещание в замене потерянного миелина, увеличение аксонов счет и / или профилактики дегенеративных заболеваний. 1,2
Человек зрительного нерва содержится приблизительно 1,2 млн параллельных аксоны путешествия от сетчатки к перекреста с диаметром приблизительно 3,0-3,5 мм. 3 Для моделирования заболеваний человека в лаборатории, крысы часто использовался. Взрослой крысы зрительного нерва содержится приблизительно 100 000 аксонов в диаметре примерно 0,5 мм. 4 Одним из основных ограничений в ЦНС регенеративной исследования прямой доступ без костей. Осложнения и хирургические риски к животным выше, когда череп или позвонки удаляются. Подобно преимуществминимально инвазивные подходы в позвоночнике, 5 прямых зрительного нерва инъекции без открытия черепа предложение сводится осложнений и более быстрое восстановление.
Этот метод был использован в предыдущих исследованиях. 6 В этой рукописи и сопровождающей видео, мы демонстрируем порядок минимально инвазивной, чтобы придать стволовых клеток в крысиных зрительного нерва.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были одобрены Комитетом Джонса Хопкинса уходу и использованию животных в. Анестезия машины требуют ежегодной проверки и калибровки как необходимо.
1. Анестезия и позиционирование
- Анестезия.
- Выполните все хирургические процедуры под наркозом с 2-3% изофлуораном. Подтвердите соответствующий уровень анестезии пальца щепоткой и частоты дыхания. Убедитесь, что крысы не дрогнул в ответ на носок щепотку.
ПРИМЕЧАНИЕ: вздрогнул указывает, что анестезия уже слишком поздно, и, возможно, требуют более длительного наркоза перед началом или более высокой концентрации изофлуораном. Частота дыхания менее 1 дыхание каждые 2 сек слишком медленно указанием анестезии является слишком высоким и может потребовать осветление изофлуораном концентрации. - Безопасный животное, как необходимо, чтобы избежать движения головы во время процедуры. Поместите каплю лидокаина на хирургическом глаза. Используйте искусственные слезы каждые 10 минут, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Датьинъекция бупренорфина 0,01 мг / кг подкожно перед операцией и затем каждые 6-8 часа по мере необходимости.
- Выполните все хирургические процедуры под наркозом с 2-3% изофлуораном. Подтвердите соответствующий уровень анестезии пальца щепоткой и частоты дыхания. Убедитесь, что крысы не дрогнул в ответ на носок щепотку.
- Позиционирование.
- Поместите крыс в стереотаксической рамы и согреться с грелку. Смочите кожу головы мех с алкоголем, заботясь, чтобы избежать воздействия на глаза. Используйте стерильные инструменты и стерильных чтобы свести к минимуму риск послеоперационных инфекций.
2. Контроль глаз
- Поместите 4-0 шва в боковой конъюнктивы и связать его с достаточно шва, чтобы обеспечить нежный тягу.
3. Вскрытие
- Первоначальный рассечение.
- Сделайте ~ 1 дюйм разрез в коже, покрывающей глазницы, используя размер 10 скальпель, как показано на рисунке 1. Уберите кожи и основной фасции и тщательно отсечь фасции. Чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение в хирургическое, избежать сокращения кровеносных сосудов, а рассекает фасцию. Используйте стратегически плAced советы хлопка для обеспечения гемостаза.
- Глубже рассечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: С нежным тяги на конъюнктиву глаз, потянув вниз и из розетки, превосходит орбитальный мышцы придут в поле зрения. Для того, чтобы разоблачить зрительный нерв, эта мышца должны быть сокращены и ретро-орбитального жира удаляются. Жир может быть отброшен и не должны быть заменены после инъекции. С этой точки, зрительного нерва панель должна быть видна в виде пучка самого зрительного нерва, а также кровеносных сосудов, завернутые в твердой мозговой оболочки (рис 1).- Сделайте небольшой надрез в твердой мозговой оболочки, используя скальпель или 31 калибра скошенный иглу, чтобы сделать пирсинг менее травматично.
4. Внесите Инжектор
- Вытяните стекла микропипетки с диаметром 50-100 мкм. Для обеспечения стабильности, смонтировать микропипетку на микроманипулятора и присоединить к шприцу Hamilton, подключенного к инфузионный насос.
- Потяните вверх шарики (или стволовых клеток)восстановленного в объеме 0,5-1,0 мкл в микропипетки ретроградной вместе с 0,5 мкл объем метилового синего раствора до и после.
ПРИМЕЧАНИЕ: скорость инфузии устанавливается на 0,5-2 мкл в минуту предотвращает травмы зрительного нерва.
5. Инъекции
- Опустите кончик микропипетки на зрительный нерв чуть выше никированной твердой мозговой оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: крошечный, но оживленным движением кончика стеклянной в оптических результатов нерва наименьшим ущербом. Когда начинается инфузионный насос, метил синий краситель должен выделить область впрыскиваемого зрительного нерва. Краситель остаются локализованными в зрительном нерве без утечки в субарахноидальное пространство. - Последующие второй полосы метил-синего, чтобы определить, когда инъекции стволовых клеток, является полной и превратить инфузионного насоса от а вторая доза метилового синего вводят. Держите микропипетки еще в зрительном нерве в течение 2 мин для каждого тома 1 мкл впрыскивают в, чтобы предотвратить высокоевыброса давление на выводе микропипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный подход заключается в подключении пипетки с воздушным заполненный шприц, которым можно управлять вручную. В любом случае, во избежание чрезмерной силы, чтобы минимизировать ущерб зрительных нервов. Мы рекомендуем инъекционных не больше, чем 2 мкл объема в каждом зрительного нерва.
6. Последующие
- Немедленное.
- При инъекции завершается, удалить микропипетки вместе с любыми ватные палочки, используемых, чтобы обеспечить гемостаз. Шовный кожу 3-0 шелка и снимите конъюнктивы шов.
- Держите крыс тепло на грелку, пока они не выходят из наркоза. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, претерпела операцию на компании других животных до полного восстановления.
- Если животное проявляет признаки боли в том числе чрезмерной вялости, атаксии, или трудился дышуг, управлять соответствующую обезболивание с внутримышечного бупренорфина (0,05 мг / кг) до трех раз в день.
- Длительный срок.
- Для следующего 24-48 часов, наблюдать крысу осложнений после операции, включая отек или выписки из раны или другие признаки боли, такие как вокализации, сгорбившись внешний вид, не-ухода, или не ест. Рассмотрим консультации с ветеринаром или этической эвтаназии как надо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
По завершении эксперимента крыс забивали, и перфузию 4% параформальдегидом. Зрительные нервы были тщательно рассечены и установлен для криостата срезов. Рисунок 2 показывает пример крыс всей зрительного нерва при низкой мощности, в котором синий краситель Эванса вводили для визуализации сайт. Стрелка указывает точное местоположение инъекции. Это было сделано рассечение в течение нескольких минут после инъекции, как указано в ограниченной диффузии красителя вниз нерва. В других инъекций, мы наблюдали медленной диффузии красителя к зрительных нервов на протяжении нескольких часов.
Рисунок 1:. Хирургическое поле зрения крысы позиционируется с для доступа левый глаз на этом рисунке. Надрез над глазницы и фасциальныеткани рассекают вниз за глаза. Конъюнктивы шов позволяет оператору нежный тягу, которая тянет внутричерепного зрительный нерв в целях, не открывая череп.
Рисунок 2:. Брутто рассечение впрыскиваемого зрительного нерва Используя синий краситель Эванса, место инъекции в зрительном нерве может быть грубо визуализируется под микроскопом рассечение. На этом изображении, зрительный нерв был вырезан в месте инъекции, чтобы показать краситель встроенный в ткани зрительного нерва.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
- Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
- Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
- Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
- Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
- Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
- Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
