Protocol
1. generation af OVCAR-3 Humane ovariekarcinomceller stabilt transducerede med Lentivirus indhold af SOX2 Regulatory Region reporterkonstruktion
- Generere lentivirale partikler ved transfektion af HEK 293T-pakkecellelinie med en reporter konstrukt genkender en SOX2 regulatorisk region som beskrevet 10,21.
BEMÆRK: reporter konstruere yderligere indeholder en destabilisering domæne af ProteoTuner Shield System foran tdTomato fluorescens protein. Shield1 binder til destabilisering domæne derved forhindre proteasom at nedbryde fluorescensprotein 22. - Transducere OVCAR-3-celler med lentivirale partikler over en periode på 24 timer. Bagefter fjernes viral supernatanten og vask cellerne med phosphatpufret saltvand (PBS) og dyrkes i komplet medium (RPMI suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin).
- 48 timer senere, 10 ug / ml puromycin blev tilsat til kulturerne og opretholdt i 5 dage for at tillade udvælgelse af korrekt transducerede celler.
2. Fremstilling af Cell Sortering og Plating
- Tilføj Shield1 ved 1: 1.000 fortynding 24 timer før cellesortering. Brug stabilt transducerede OVCAR-3-celler uden Shield1 behandling som negative kontroller (figur 1). Aspirer medier fra kolben vaskes cellerne med 1x PBS og Trypsinisér cellerne med 0,05% trypsin-EDTA i 3 minutter.
- Stop trypsin ved anvendelse af komplet medium (se ovenfor), tæller celletal, centrifugeres celler ved 300 xg ved stuetemperatur (15-25 ° C) i 5 minutter.
- Dekanteres supernatanten og resuspender cellerne forsigtigt i 0,5-1 ml sterilt PBS.
- Brug 40 um cellefilter cap filter for at opnå enkelt-celle-suspension.
- Juster celletal til 5 millioner celler pr ml.
- Forbered ultra lav-vedhæftede 96 brønde med 100 pi kugler medium (MEGM suppleret med vækstfaktorer, cytokiner og kosttilskud,B-27, heparin-natrium; eller DMEM / F12 suppleret med vækstfaktorer, cytokiner og kosttilskud, B-27, heparin-natrium med eller uden tilsætning af 1% methylcellulose, se også tabel 1). Eventuelt tilsætte antibiotika til mediet i en koncentration på 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin for at minimere risikoen for eventuel forurening.
- Sorter RFP + og RFP- celler i forberedt plader med 96 brønde fra oven, 1 celle pr brønd (enkelt cellebaseret sfærer assay) og 100 celler per brønd (multi cellebaserede sfærer assay) hhv. Udfør slags på kommercielt tilgængelige cellesorteringsapparat (se Materialer) ved anvendelse af enkelt celle funktion, Sort setup: 100 μ dyse, kappe pres 20 psi, og udbyttet maske 0, renhed maske 32, fasemaske 16.
- Vurdere udpladningseffektivitet ved mikroskopisk lave brønde, der indeholder celler (for enkelt celle-baseret assay) og ved at tælle celleantal i individuelle brønde (for multi cellebaserede assay; Figur 2
- Cellerne inkuberes under standardbetingelser i sfærer medium (sammensætning se trin 2.6) ved 37 ° C og 5% CO2. Supplement daglig bFGF (20 ng / ml) og EGF (20 ng / ml).
- Efter en uge, tælle antallet af nye tumor kugler ved hjælp af en standard mikroskop med 4X eller 10X forstørrelse og et fluorescensmikroskop til påvisning af fluorescenssignal fra det integrerede reporter system. Tæl kugler med en diameter på over 100 um som "store" kugler og kugler med en diameter fra 50 til 100 um som "små" kugler (figur 3). Sørg for, at du tæller virkelige sfærer og ikke celleklynger.
BEMÆRK: I single cellebaserede assays sfære dannelse er nemmere at score mikroskopisk efter 10 (versus 7) dages dyrkning. - Beregn andelen af kugle-dannende celler i RFP + og henholdsvis RFP- celler i enkelt cellebaserede assays (én plade med 96 brønde for hver enkelt eksperiment) eller multi-celle-baSED sfærer assays (en brønd for hver enkelt forsøg) som fremlagt af Shaw et al. 16
BEMÆRK: Andelen af kugle dannende celler (%) = (antal kugler) / (antal podet celler) x 100
3. seriepassage af kugler
- Anbring indholdet af hver brønd i en passende sterilt rør og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. For multi cellebaserede sfærer analyser, indsamle sammen kuglerne fra en brønd. Vask brønden 3-5 gange med PBS og centrifuger 2 min længere. For enlige cellebaserede sfærer analyser, indsamle individuelle sfærer. På grund af det lave antal af celler, anvender 1,5 ml rør til centrifugering og vasketrin.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet i 200 pi 0,05% trypsin-EDTA.
- For at opnå optimal celle separation, inkuber cellesuspensionen ved 37 ° C i 5 minutter i en blød shaker. Optimer trypsinering tid til din cellelinje til lavere celledød rate: hvis der ikke storkugler er synlig tritureres forsigtigt med en 100 pi pipette tip. Hvis store områder er stadig til stede, inkuberes med trypsin yderligere 3 minutter og derefter gå videre til findeling trin. I tilfælde af enkelt cellebaserede assays sørge for at optimere tidspunktet for optimal celleudbytte af levende celler under trypsinisering trin.
- At inaktivere trypsin tilsættes 500 pi komplet medium og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter, i tilfælde af encellede assays, centrifugeres i yderligere 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne forsigtigt i sfærer medium.
- Brug en 40 um cellefilter cap filter til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
- I tilfælde af anvendelse af RFP + og RFP- celler i flercellede-bassed assays vurdere procentdelen af fluorescerende celler i hver brønd efter resuspension via flowcytometer analyse.
- For serielle -genudpladning assays af enkelte celler, frø 1 celle pr godt ind i en ny ultra low-fastgørelse 96 brønde fremstillet som beskrevet ovenfor. Fra en enkelt kugle, frø ca. 20 individuelle brønde. For -genudpladning assays af multi cellebaserede primære kugler opnået frøceller fra én brønd af primære kugler i en ny 96-brønds plade og tælle celleantal næste dag ved mikroskopi.
- Vurdere andelen af kugle-dannende celler i sekundære sfærer assays under anvendelse af formlen beskrevet i trin 2.11.
4. Resultat Analyse
- Analysere resultater fra forsøg udført i selvstændige tre eksemplarer og bruge to-sidet T-test til at analysere normalfordelte værdier og ellers Mann-Whitney-test for statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I konventionelle sfærer assays, næsten 40% af RFP + OVCAR-3 celler vs. 20% af RFP- celler gav anledning til en individuel tumor kugle i den primære sfærer assay (figur 4A). Desuden kugler dannet af RFP + celler var større i størrelse end dem, der dannes ved RFP- celler.
Når udpladet i enkelte cellebaserede assays, RFP + -celler også dannes flere kugler end RFP- celler, hvilket bekræfter ovenstående resultater. Der var imidlertid en tendens til frembringelse af færre kugler pr udpladet i det indre versus multi celle-baserede assay (figur 4A, B), hvilket indikerer, at der i dette assay sfære formation kan forspændes gennem tekniske artefakter, såsom mekanisk sfære fusion eller dissociation i den ikke-klæbende dyrkningsmedium.
For yderligere at undersøge disse aspekter, sammenlignede vi indflydelsen af celle udpladningsdensitet på kugler formation. Vi udpladede celler ved hjælp af begrænsende fortynding fra 1000 celler til 1 celle pr brønd i 96-Nå plader og fandt, at antallet af nye kugler var meget afhængig af antallet af oprindeligt belagt celler. Overraskende blev højere antal sfærer talt lavere antal udpladede celler i både MGEM og DMEM / F12-baserede medier, hvilket viser, at der faktisk plating modaliteter stærkt indflydelse på resultaterne i dette assay (figur 5). I modsætning hertil, når cellerne blev immobiliseret ved tilsætning af 1% methylcellulose til DMEM / F12-baseret kugler effektiviteten af kugle formation var medium 23,24 hovedsagelig uafhængig af celledensitet.
For at undersøge indflydelsen af kugler dyrkningsbetingelser på CSC egenskaber, analyserede vi den procentdel af celler, der udtrykker rød fluorescens signal efter 7 dages inkubering i sfærer assay. Vi fandt, at omkring 35% af cellerne fra RFP + kugler i multi cellebaserede sfærer kulturer mistet deres rød fluorescens signal efter syv dages dyrkning (figur 6A), hvilket antyder, at de har undergen differentiering, mens 65% bevaret en RFP + signal tyder selvfornyelse kapacitet. I modsætning hertil celler fra kugler genereret fra begyndelsen RFP- celler forblev RFP negative (figur 6A), hvilket indikerer, at de ikke kan genetablere stamcelle potentiale under disse betingelser.
Fluorescens mikroskopi udføres på kugler genereret fra enkelte celler bekræftede disse resultater viser, at enlige kugler afledte RFP + celler indeholdt både RFP + og RFP- celler, mens kugler stammer fra RFP- celler forblev negative for det røde signal.
Lignende resultater blev observeret i -genudpladning assays fra begge betingelser.
Figur 1. Workflow af lentiviral transduktion, udvælgelse og sortering af RFP + og RFP- celler. Efter lentiviral transduktion og positiv selektion af held transducerede celler via puromycin eksponering RFP- og RPF + celler sorteres ved FACS i individuelle brønde i en plade med 96 brønde i sfærer medium. For multi cellebaserede sfærer assays, der 100 celler placeret i en brønd. Udpladningseffektivitet vurderes ved mikroskopi udføres efter sortering. Spheres blev scoret af mikroskopi efter syv til ti dage, dissocieres til enkeltceller, analyseret via flowcytometri og genudpladede til sekundære sfærer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. billeddannelse af sorterede RFP + og RFP- celler efter udpladning. Single RFP + og RFP- sorteres cellerne i hver brønd i en plade med 96 brønde analyseres for korrekt plettering ved hjælp af en (fluorescerende) mikroskop.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Analyse af kugler dannelse i enkelte cellebaserede assays. Spheres dannelse analyseres efter syv til ti dage. (A) Stor (diameter> 100 um) og (B) små (diameter 50-100 um). Kugler udmærker mikroskopisk baseret på størrelse Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Effektivitet af tumor sfærer dannelse fra RFP +og RFP- OVCAR-3 celler i multi versus encellede baserede sfærer assays. Sammenligning af primær og sekundær sfære effektivitet fra OVCAR-3-celler som analyseret i flere (A) versus enkelt cellebaserede sfærer assays (B). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Cell udpladningsdensitet kraftigt virkninger sfære tæller fra OVCAR-3-celler i multi cellebaserede sfærer assay udført i væske, men ikke i methylcellulose suppleret kulturer. Anvendelse af forskellige celledensiteter og vækstmedier er blevet rapporteret i litteraturen for ovariecancer spheres assays. For at analysere eventuelle bias som følge af disse variabler, celler udplades ved Forskelnt tætheder i 200 pi forskellige sfærer dyrkningsmedier (MGEM, DMEM / F12 med alle kosttilskud som beskrevet i protokol afsnittet eller DMEM / F12 med alle kosttilskud, og som indeholder 1% methylcellulose) og kugle dannelse er scoret efter 7 dage (A) . Vist i (B) er mikroskopi billeder af celler udpladet ved forskellige tætheder taget én dag efter udpladning i DMEM / F12 sfærer dyrkningsmedium uden methylcellulose. Bemærk celleklynger nye ved høj cellulær densitet i modsætning til enkelte celler set i lav massefylde plader. Scale bar for billeder:. 50 pm Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Analyse af RFP signal i tumor sfærer dannet af RFP + og respektively RFP- OVCAR-3-celler (A) Flowcytometrianalyse for RFP signal i dissocierede sfærer afledt fra RFP + og RFP- celler (multi cellebaseret sfærer assay).; (B) Mikroskopi af kugler stammer fra RFP + og RFP- celler (enkelt celle-baserede sfærer assay) afslører heterogen RFP signal i områder, der stammer fra RFP + men ikke fra RFP- celler. Billeder blev taget på dag 7 for konventionelle kugler og dag 10 for enlige cellebaserede sfære assays. Bemærk den større størrelse af kugler stammer fra RFP + formodede CSCS. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Humant ovariecancer cellekilde | Basisk medium | Kosttilskud | Forfattere |
| OVCAR-3, Caov-3, primært materiale | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparin, hydrocortison, insulin (SingleQuot kit) | Bareiss et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Li Ma et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 2% B-27, 0,4% BSA | Haiwei Wang et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 2% B-27, 1 ng / ml hydrocortison | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, primært materiale | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | T. Xiang et al. |
| Primær materiale | DMEM / F12 > | 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | MF Shi et al. |
| Primær materiale | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | Shu Zhang et al. |
| Primær materiale | EBM-2 eller X-VIVO | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF | Ilona Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 pg / mL heparin | Dongming Liang et al. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spheres kulturer er en udbredt metode til at analysere cancer stamceller potentiale og berige for stamceller-lignende celler i en lang række humane tumorceller 15,25,26. Under disse dyrkningsbetingelser, er kræftceller, der mangler selvfornyelse evne forventes at differentiere og til sidst undergå celledød. Selv om de i første omgang kan danne celleklynger eller endda tumor sfærer især i ubearbejdet analyser, er de ikke i stand til at opretholde sfære-dannende evne ved seriel -genudpladning grund af manglende selvfornyende egenskaber. Spheres assays anvendes som surrogat analyser til at identificere CSCS og evaluere deres frekvens i hele tumorcellepopulationer.
Dog kan observeres betydelig variation mellem sfærer analyser udført efter forskellige offentliggjorte protokoller 5,10,27-35 (tabel 1). I vores laboratorium har vi tidligere offentliggjorte sfære formation fra humane ovariekarcinomceller hjælp MEGM suppleret med B-27BFGF, Heparin og SingleQuot TM (indeholdende insulin, rEGF og hydrocortison). Andre labs bruger hele DMEM / F12 Medium, mens nogle kun tilføje B-27 og rEGF. I denne rapport blev der multi cellebaserede sfærer assay i OVCAR-3 celler derfor udføres ved hjælp af forskellige forhold. Brug MEGM eller DMEM / F12 med alle kosttilskud ingen signifikant forskel i kugle-dannelse blev observeret i disse celler (figur 5A). Desuden har nogle laboratorier spekuleret på, at EGF og FGF kan være hurtigt nedbrudt og har etableret protokoller tilføje disse vækstfaktorer dagligt til mediet. Vi har derfor sammenlignet sfærer analyser udført i et medium, hvor EGF og FGF blev først tilføjet i begyndelsen af kuglerne assays med daglige tilsætning af EGF og FGF til cellekultur, og vi finder disse assays til giver tilsvarende resultater i OVCAR-3-celler (data ikke vist), hvilket antyder, at den dyre og besværlige daglige tilskud med EGF og FGF måske ikke altid være nødvendigt. Hvorvidt disse resultatergælder for celler fra andre ovariecancer cellelinjer eller delprøver, eller under forskellige eksperimentelle betingelser er endnu ikke fastslået.
Imidlertid observerede vi en væsentlig skævhed i antallet af ridsede kugler indført ved en anden testede variable cellen udpladningsdensitet. Overraskende brønde podet med lavere antal celler udviste højere antal af kugler. Begrænsning celle mobilitet med 1% methylcellulose resulterede i den samme effektivitet sfære dannelse, uafhængig af antallet af oprindeligt udpladede celler. Disse resultater antyder, at celle sammenklumpning og sfære fusion eller opdeling kan forekomme ændring sfære numre og fører til unøjagtige resultater i multi cellebaserede sfærer assays. Når celler udplades på korrekt tæthed, multi cellebaserede assays imidlertid føre til resultater snarere sammenlignes med data indsamlet i en enkelt cellebaserede sfære assays (figur 4). For yderligere at undersøge disse resultater vi sammenlignet single og multi cellebaseredeassays under anvendelse ovariekarcinomceller sorteres i formodede CSCS via en nyligt offentliggjort lentiviral RFP udtrykker reporter for en SOX2 regulatorisk region 10. Faktisk begge assays bekræftede forbedret primær og sekundær sfære danner kapacitet RFP + versus RFP- celler (figur 4A, B). Vigtigt er det, de højere antal kugler observeret fra RFP + celler ikke var på grund af højere proliferativ kapacitet af Sox2 udtrykkende celler (data ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med tidligere resultater, der viser, at induktion af SOX2 fremmer sfærer dannelse og in vivo tumorigenicitet uden at accelerere cellecyklusprogression 10.
Tilsammen enkelt cellebaserede sfærer assays er mere besværlig og dyr, men de resulterer i mere nøjagtige data, hvilket også bekræftes af den højere reproducerbarhed af resultater mellem eksperimenter. Da udpladningsdensitet højt påvirkninger resulterer i multi celle-based suspension spheres assays, forhånd titrering af passende udpladningsdensitet er påkrævet for hver enkelt tumor celletype før analyse sfære formation ved hjælp af disse assays. Alternativt kan mere nøjagtige enkelt cellebaserede assays anvendes forhånd, eller methylcellulose tilskud for at forbedre nøjagtigheden af resultater ved at reducere mekaniske artefakter. Hvis kugle dannelse sammenlignes mellem forhold, hvor den genetiske modifikation eller medicinsk behandling kan alvorligt ændre cellernes levedygtighed og dermed mindske celledensitet, kan enkelt cellebaserede sfære assays være obligatorisk for at undgå falske positive resultater.
Sammenfattende under passende eksperimentelle betingelser både multi cellebaserede sfærer assay og enkelt cellebaserede sfærer assay er i stand til at angive forskelle i sfære potentiale mellem forskellige cellepopulationer (stamceller og ikke-stamceller). Imidlertid multi cellebaserede sfærer assays, som almindeligvis udføres i flydende kulturer er mere modtagelige for errors indført ved eksperimentel design gennem udpladningsdensitet. Supplering af methylcellulose (1%) til multi cellebaserede assays kan begrænse artefakter relateret til celle sammenklumpning og sfære fusion. Baseret på disse data, anbefaler vi, single cellebaserede sfærer analyser, der skal udføres, medmindre detaljerede titrering analyser er udført forhånd og negative virkninger af forsøgsbetingelser på cellelevedygtighed og dermed celledensitet er blevet udelukket. Men single cellebaserede sfærer analyser er mere besværlige og dyrere, og måske ikke påkrævet i hver eksperimentel indstilling. Methylcellulose-suppleret multi cellebaserede sfærer assays kan repræsentere et andet alternativ i nogle eksperimentelle indstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
