Protocol
1. Generazione di Ovcar-3 umane cellule di carcinoma ovarico stabilmente trasdotte con lentivirus contenente il Reporter Construct SOX2 Regione Regulatory
- Generare particelle lentivirali trasfettando la linea cellulare 293T-imballaggi HEK con un costrutto giornalista riconoscere una regione regolatoria SOX2 come descritto 10,21.
NOTA: Il giornalista costruire inoltre contiene un dominio destabilizzazione del sistema Shield ProteoTuner avanti della proteina tdTomato fluorescenza. Shield1 lega al dominio destabilizzazione impedendo così il proteasoma a degradare la proteina fluorescente 22. - Trasdurre OVCAR-3 celle con particelle lentivirali per un periodo di tempo di 24 ore. Successivamente, rimuovere il surnatante virale e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) e coltivate in mezzo completo (RPMI supplementato con 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina).
- 48 ore più tardi, 10 ug / ml puroMycin sono stati aggiunti alle culture e mantenuto per 5 giorni per consentire la selezione di cellule trasdotte correttamente.
2. Preparazione di cellule Ordinamento e placcatura
- Aggiungi Shield1 a 1: 1.000 diluizione 24 ore prima della separazione delle cellule. Utilizzare stabilmente trasdotte Ovcar-3 celle senza trattamento Shield1 come controlli negativi (Figura 1). Aspirare i media da pallone, lavare le cellule con PBS 1x e trypsinize cellule con 0,05% tripsina-EDTA per 3 min.
- Smettere di tripsina utilizzando terreno completo (vedi sopra), contare il numero di cellule, le cellule centrifugare a 300 xg a RT (15 - 25 ° C) per 5 min.
- Decantare il surnatante e risospendere le cellule con cura in 0,5 - 1 ml di PBS sterile.
- Utilizzare 40 micron filtro cap filtro cella per ottenere cella singola sospensione.
- Regolare conta delle cellule a 5 milioni di cellule per ml.
- Preparare basso attaccamento piastre ultra 96 pozzetti con 100 microlitri sfere medio (MEGM completato con fattori di crescita, citochine, e supplementi,B-27, eparina di sodio; o DMEM / F12 addizionato con fattori di crescita, citochine e integratori, B-27, eparina di sodio, con o senza l'aggiunta di 1% metilcellulosa, vedi anche tabella 1). Facoltativamente aggiungere antibiotici per il mezzo ad una concentrazione di 100 U / ml penicillina e 100 ug / ml di streptomicina per minimizzare il rischio di possibili contaminazioni.
- Ordina RFP + e cellule RFP- in preparati piastre a 96 pozzetti dall'alto, 1 cella per pozzetto (single cell-based sfere test) e di 100 cellule per bene (più saggio sfere a base di cellule), rispettivamente. Eseguire sorta su disponibile in commercio cell sorter (vedi Materiali) utilizzando la modalità singola cella, Sort installazione: 100 μ ugello, pressione della guaina 20 psi, e la resa maschera 0, maschera purezza 32, maschera di fase 16.
- Valutare placcatura efficienza microscopicamente segnando pozzetti contenenti cellule (per il saggio basato su cellule singole) e contando il numero di cellule in singoli pozzetti (per il dosaggio più basato su cellule; Figura 2
- Incubare le cellule in condizioni standard in ambito di media (per la composizione vedi punto 2.6) a 37 ° C e 5% di CO 2. Supplemento giornaliero bFGF (20 ng / ml) e EGF (20 ng / ml).
- Dopo una settimana, contare il numero di emergenti sfere tumorali utilizzando un microscopio standard 4X o 10X di ingrandimento e un microscopio a fluorescenza per rilevare il segnale di fluorescenza dal sistema reporter integrato. Contare sfere con un diametro superiore a 100 micron come "grandi" sfere e sfere di diametro 50 - 100 micron come "piccole" sfere (Figura 3). Essere sicuri che si contano sfere reali e non CELL cluster.
NOTA: In saggi cellulari singola formazione sfera è più facile segnare microscopicamente dopo 10 (contro 7) giorni di coltura. - Calcolare la percentuale di cellule che formano sfera in RFP + e cellule rispettivamente RFP- in saggi cellulari singoli (una piastra a 96 pozzetti per ogni singolo esperimento) o più cellule-basfere sed saggi (uno anche per ogni singolo esperimento) presentato dalla Shaw et al. 16
NOTA: Percentuale di cellule che formano sfera (%) = (numero di sfere) / (numero di cellule seminate) x 100
3. Passaging seriale di sfere
- Posizionare il contenuto di ciascun pozzetto in un idoneo tubo sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Per il multi-cellulari sfere saggi, raccogliere insieme le sfere di un bene. Lavare il ben 3 - 5 volte con PBS e centrifugare 2 min più. Per i singoli cellulari-sfere saggi, raccogliere le singole sfere. A causa del basso numero di cellule, utilizzare 1,5 ml tubi per centrifugazione e lavaggio passi.
- Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 ml di 0,05% tripsina-EDTA.
- Per realizzare la separazione cellulare ottimale, incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 5 minuti in un agitatore morbido. Ottimizzare tripsinizzazione tempo per la vostra linea cellulare a basso tasso di morte cellulare: se no grandesfere è visibile triturare delicatamente con un puntale 100 microlitri. In caso di grandi sfere sono ancora presenti, incubare con tripsina altri 3 minuti e poi procedere al passo triturazione. In caso di singolo saggi cellulari assicurarsi di ottimizzare i tempi per la resa ottimale delle cellule delle cellule viventi durante la fase di tripsinizzazione.
- Per inattivare la tripsina, aggiungere 500 microlitri mezzo completo e centrifugare a 300 xg per 10 min, in caso di saggi cellulari singoli, centrifugare per altri 2 minuti.
- Rimuovere accuratamente le cellule surnatante e risospendere in sfere di media.
- Utilizzare un filtro tappo filtro cella 40 micron per ottenere una cella singola sospensione.
- In caso di utilizzo RFP + e le cellule RFP- in saggi di multi-cellulari bassed, valutare la percentuale di cellule fluorescenti in ogni pozzetto dopo risospensione tramite citofluorimetro analisi.
- Per i saggi replating serie di singole cellule, di semi 1 cella per bene in un nuovo minimo attaccamento piastra a 96 pozzetti ultra preparati come sopra. Da una sfera individuale, seminare circa 20 singoli pozzi. Per i saggi replating di multi-sfere primarie a base di cellule, le cellule di semi ottenuti da un pozzetto di sfere primarie in una nuova piastra a 96 pozzetti e contano i numeri cellulari giorno successivo al microscopio.
- Valutare la proporzione di cellule che formano sfera in sfere secondarie test utilizzando la formula descritta al punto 2.11.
Analisi 4. Risultato
- Analizzare i risultati di esperimenti condotti in triplicato indipendenti e utilizzare Test t su due lati per analizzare i valori normalmente distribuiti e altrimenti Mann-Whitney-test per l'analisi statistica.
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Representative Results
In sfere convenzionali saggi, quasi il 40% delle RFP + OVCAR-3 celle contro il 20% delle cellule RFP- ha dato luogo a una sfera singolo tumore nel primario test sfere (Figura 4A). Inoltre, sfere formate da RFP + cellule erano di dimensioni maggiori di quelle formate da cellule RFP-.
Quando placcato in saggi cellulari singoli, cellule RFP + anche formati più sfere di cellule RFP-, confermando i risultati di cui sopra. Tuttavia, c'è stata una tendenza verso un minor numero di generazione di sfere per placcato nel singolo contro il cell-based test multi (4A, B), indicando che in questa formazione test sfera può essere prevenuto attraverso artefatti tecnici, come la fusione sfera meccanica o dissociazione nel mezzo di coltura non aderente.
Per esplorare ulteriormente questi aspetti, abbiamo confrontato l'influenza della densità di placcatura delle cellule sulla formazione sfere. Abbiamo placcato cellule utilizzando diluizione limite dalle cellule 1.000 a 1 cella per pozzetto in 96piastre -well e ha scoperto che il numero di sfere emergenti erano altamente dipendenti dalle numero di cellule inizialmente placcato. Sorprendentemente, i numeri più alti di sfere sono stati contati da un numero inferiore di cellule placcato sia MGEM e DMEM / supporti basati F12, dimostrando che le modalità effettivamente placcatura altamente risultati in eccesso in questo saggio (Figura 5). Al contrario, quando le cellule sono state immobilizzate con l'aggiunta di 1% di metilcellulosa DMEM / F12 sfere base medio 23,24 l'efficienza di formazione di sfera era principalmente indipendente densità cellulare.
Per esplorare l'influenza delle condizioni di coltura sfere su proprietà CSC, abbiamo analizzato la percentuale di cellule che esprimono segnale di fluorescenza rossa dopo 7 giorni di incubazione nel test sfere. Abbiamo scoperto che in base cellulare sfere culture multi-circa il 35% delle cellule di RFP + sfere perso il loro segnale di fluorescenza rossa dopo sette giorni di coltura (figura 6A), suggerendo che essi hanno underguna differenziazione, mentre il 65% ha mantenuto una RFP + segnale suggerendo la capacità di auto-rinnovamento. Al contrario, le cellule provenienti da sfere generate da cellule inizialmente RFP- rimasti negativi RFP (figura 6A), indicando che non possono ristabilire il potenziale delle cellule staminali in queste condizioni.
Microscopia a fluorescenza eseguita su sfere generate da singole cellule confermato questi risultati dimostrano che singoli ambiti derivano RFP + cellule contenevano sia RFP + e cellule RFP- mentre sfere derivate da cellule RFP- rimasti negativi per il segnale rosso.
Risultati simili sono stati osservati in saggi replating da entrambe le condizioni.
Figura 1. Flusso di lavoro di lentivirali trasduzione, selezione e ordinamento di RFP + e cellule RFP-. Dopo trasduzione lentivirali e selezione positiva di cellule trasdotte con successo attraverso l'esposizione puromicina, RFP- e cellule RPF + sono ordinati per FACS in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti in sfere di media. Per il multi-cellulari sfere saggi, 100 celle vengono inseriti in un pozzetto. Placcatura efficienza viene valutata mediante microscopia eseguite dopo la cernita. Sfere sono stati segnati al microscopio dopo sette-dieci giorni, dissociate in singole cellule, analizzate tramite citofluorimetria e ripiastrate in sfere secondarie. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Imaging di ordinata RFP + e cellule RFP- dopo la placcatura. Singolo RFP + e cellule RFP- ordinati in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti vengono analizzati per la corretta placcatura utilizzando un (fluorescente) microscopio.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Formazione Figura 3. Analisi della formazione di sfere in saggi cellulari singoli. Sfere viene analizzato dopo sette a dieci giorni. (A) grande (diametro> 100 micron) e (B) di piccole dimensioni (diametro 50 - 100 micron). Sfere si distinguono microscopicamente basano sulla dimensione Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Efficienza di tumore sfere formazione da RFP +e RFP- OVCAR-3 celle in più rispetto a base di cellule singole sfere saggi. Confronto tra primaria e secondaria efficienza sfera da Ovcar-3 celle come dosati in multi (A) rispetto a singole sfere saggi cellulari (B). Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. cellulare densità di placcatura fortemente impatti sfera conta da Ovcar-3 celle in multi cell-based sfere test eseguito in un liquido, ma non nelle culture metilcellulosa integrato. L'utilizzo di diverse densità cellulari e mezzi di crescita sono stati riportati in letteratura per il cancro ovarico sfere saggi. Per analizzare le possibili distorsioni introdotte da queste variabili, le cellule sono placcati in differedensità nt in 200 ml di diversi terreni di coltura sfere (MGEM, DMEM / F12 con tutti gli integratori come dettagliato nella sezione del protocollo, o DMEM / F12 con tutti gli integratori e contenenti 1% metilcellulosa) e la formazione di sfera è ottenuto dopo 7 giorni (A) . Mostrato in (B) sono le immagini di microscopia di cellule placcato in diverse densità presi un giorno dopo placcatura in DMEM / F12 sfere con terreno di coltura senza metilcellulosa. Notare i raggruppamenti cellulari emergenti ad alta densità cellulare rispetto a cellule singole visto in piastre a bassa densità. Bar Scala per le immagini:. 50 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Analisi di RFP segnale in sfere tumorali formata da RFP + e respectively RFP- OVCAR-3 celle (A) citometria a flusso di analisi per il segnale RFP in ambiti dissociate derivati da cellule RFP + e RFP- (a base di cellule più saggio di sfere).; (B) Microscopia di sfere derivati da RFP + e cellule RFP- (basato su singola cellula test sfere) rivela segnale RFP eterogenea in settori derivati da RFP +, ma non dalle cellule RFP-. Le foto sono state scattate al giorno 7 per le sfere convenzionali e giorno 10 per singoli saggi sfera a base di cellule. Si noti la dimensione più grande di sfere derivati da RFP + putativi CSC. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Fonte di cellule di cancro ovarico umano | Supporto di base | Supplementi | Autori |
| OVCAR-3, Caov-3, materiale primario | MEGM | 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 mg / ml di eparina, idrocortisone, l'insulina (kit SingleQuot) | Bareiss et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml di insulina, 10 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Li Ma et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 mg di insulina / ml, 20 ng / ml REGF, 2% B-27, 0,4% BSA | Haiwei Wang et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml di insulina, 20 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 2% B-27, 1 ng / ml idrocortisone | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, materiale primario | DMEM / F12 | 5 ug / ml di insulina, 20 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | T. Xiang et al. |
| Materiale primario | DMEM / F12 > | 5 ug / ml di insulina, 10 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml di insulina, 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml di insulina, 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | MF Shi et al. |
| Materiale primario | DMEM / F12 | 5 ug / ml di insulina, 20 ng / ml REGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | Shu Zhang et al. |
| Materiale primario | EBM-2 o X-VIVO | 5 ug / ml di insulina, 20 ng / ml REGF | Ilona Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml REGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 mg / mL di eparina | Dongming Liang et al. |
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Discussion
Sfere culture sono un metodo ampiamente utilizzato per saggiare il potenziale delle cellule staminali del cancro e arricchire per le cellule staminali, come in una vasta gamma di cellule tumorali umane 15,25,26. In queste condizioni di coltura, le cellule tumorali che non hanno la capacità di auto-rinnovamento sono tenuti a differenziare e infine sottoposti a morte cellulare. Anche se possono inizialmente formare gruppi di cellule o persino sfere tumorali soprattutto a dosaggi primarie, non sono in grado di sostenere la capacità sfera formando su replating serie a causa della mancanza di proprietà di auto-rinnovamento. Sfere test sono utilizzati come test sostitutivi per identificare CSC e valutare la loro frequenza in tutta la popolazioni di cellule tumorali.
Tuttavia, sostanziale variabilità può essere osservata tra sfere saggi eseguita seguendo diversi protocolli pubblicati 5,10,27-35 (Tabella 1). Nel nostro laboratorio, abbiamo già pubblicato formazione sfera da cellule di carcinoma ovarico umano utilizzando MEGM completati con B-27, BFGF, eparina e SingleQuot TM (contenente insulina, REGF e idrocortisone). Altri laboratori utilizzano tutta DMEM / F12 media, mentre alcuni aggiungono solo B-27 e REGF. In questo rapporto, più sfere cellulari-test in OVCAR-3 cellule sono state quindi eseguita con condizioni diverse. Utilizzando MEGM o DMEM / F12 con tutti gli integratori alcuna differenza significativa nella formazione ambito è stato osservato in queste cellule (Figura 5A). Inoltre, alcuni laboratori hanno ipotizzato che EGF e FGF possono essere rapidamente degradato e hanno stabilito protocolli aggiungendo questi fattori di crescita giornaliera al mezzo. Abbiamo quindi confrontato sfere esperimenti eseguiti in un mezzo in cui EGF e FGF è stato aggiunto solo all'inizio delle sfere saggi con aggiunta giornaliero di EGF e FGF per la coltura cellulare, e troviamo questi metodi per produrre risultati equivalenti in cellule OVCAR-3 (dati non mostrati), suggerendo che la supplementazione giornaliera costosa e laboriosa con EGF e FGF può non essere sempre necessario. Se questi risultatisono applicabili alle cellule da altre linee di cellule di cancro ovarico o campioni elementari, o in differenti condizioni sperimentali Resta da stabilire.
Tuttavia, abbiamo osservato una tendenza sostanziale del numero di sfere segnati introdotte da un'altra variabile testato, la densità di placcatura delle cellule. Sorprendentemente, pozzi seminati con numeri più bassi di cellule hanno mostrato un numero maggiore di sfere. Limitazione mobilità cella 1% di metilcellulosa comportato la stessa efficienza di formazione di sfera, indipendente dal numero di cellule inizialmente placcato. Questi risultati suggeriscono che la aggregazione delle cellule e la sfera di fusione o di disaggregazione possono verificarsi modificando numeri sfera e che porta a risultati non accurati in multi cellulari-sfere saggi. Quando le cellule vengono piastrate a densità corretta, saggi basati su cellule multiple tuttavia portano a risultati piuttosto paragonabili ai dati raccolti in singoli dosaggi sfera a base di cellule (Figura 4). Per esplorare ulteriormente questi risultati abbiamo confrontato base cella singola e multitest con cellule di carcinoma ovarico ordinati in CSC putativi attraverso un sistema che esprime giornalista RFP lentiviral recentemente pubblicato una regione regolatoria SOX2 10. Infatti, entrambi i saggi hanno confermato la sfera formatura capacità primaria e secondaria migliorata di RFP + contro cellule RFP- (Figura 4A, B). È importante sottolineare che i numeri più alti di sfere osservate da + cellule RFP non erano dovuti alla maggiore capacità proliferativa delle cellule SOX2 esprimono (dati non mostrati), che è in linea con i risultati precedenti che mostrano che l'induzione di Sox2 promuove sfere formazione e nella tumorigenicità vivo senza accelerare progressione del ciclo cellulare 10.
Nel loro insieme, singole sfere basati su celle saggi sono più laborioso e costoso, ma risultano in dati più precisi, che è confermata anche dalla maggiore riproducibilità dei risultati tra esperimenti. Poiché densità di placcatura altamente influenze risultati in più cellule-bassospensione ed sfere saggi, è necessaria la titolazione iniziale di un'adeguata densità di placcatura per ogni singolo tipo di cellule tumorali prima di saggiare la formazione di sfera con questi test. In alternativa, i più accurati saggi cellulari singoli possono essere utilizzati in anticipo, o supplementazione metilcellulosa per migliorare la precisione dei risultati, riducendo gli artefatti meccanici. Se la formazione di sfera è confrontata tra le condizioni in cui la modificazione genetica o terapia farmacologica possono alterare gravemente la vitalità delle cellule, diminuendo in tal modo densità cellulare, singoli saggi sfera a base di cellule potrebbe essere obbligatoria per evitare risultati falsi positivi.
In sintesi, in condizioni sperimentali appropriate sia multi cell-based sfere test e il singolo dosaggio sfere a base di cellule sono in grado di indicare differenze di potenziale sfera tra diverse popolazioni di cellule staminali (e cellule non staminali). Tuttavia, multi-sfere basati su celle saggi che comunemente vengono eseguiti in colture liquide sono più suscettibili a errors introdotte dal disegno sperimentale con densità di placcatura. La supplementazione di metilcellulosa (1%) a dosaggi multipli basati su cellule può limitare gli artefatti legati alla cella aggregazione e fusione sfera. Sulla base di questi dati, si consiglia di singoli basati su cellule sfere test da effettuare a meno dettagliate analisi di titolazione sono state eseguite impatto anticipo e negativo di condizioni sperimentali sulla vitalità delle cellule e quindi la densità cellulare è stato escluso. Tuttavia, singole sfere basati su celle saggi sono più faticoso e più costosi, e potrebbero non essere necessarie in ogni impostazione sperimentale. Methylcellulose-integrate multi-cellulari-sfere saggi possono rappresentare un'altra alternativa in alcune impostazioni sperimentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
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