Protocol
1. Generering av OVCAR-3 Mänskliga ovarialkarcinomceller stabilt transducerade med Lentiviruses Innehåller Sox2 Regulatory Region Reporter Construct
- Generera lentivirala partiklar genom transfektering HEK 293T-förpackningar cellinje med en rapportkonstruktion erkänna ett Sox2 reglerande region som beskrivits 10,21.
OBS: reporterkonstruktionen innehåller vidare en destabilisering domänen av ProteoTuner skyddssystemet före tdTomato fluorescerande protein. Shield1 binder till destabilisering domänen därigenom förhindra proteasomet att försämra fluorescerande protein 22. - Transducera OVCAR-3 celler med lentivirala partiklar över en tidsperiod av 24 h. Efteråt, avlägsna den virala supernatanten och tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och odlades i komplett medium (RPMI kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin).
- 48 h senare, 10 | ig / ml puromycin sattes till kulturerna och underhålls i 5 dagar för att möjliggöra val av rätt omvandlade celler.
2. Beredning av cellsortering och plätering
- Lägg Shield1 vid 1: 1000 utspädning 24 h före cellsortering. Använd stabilt transducerade OVCAR-3 celler utan Shield1 behandling som negativa kontroller (Figur 1). Aspirera medium från kolv, tvätta cellerna med 1 x PBS och trypsinize celler med 0,05% trypsin-EDTA under 3 min.
- Stoppa trypsin genom användning av komplett medium (se ovan), räkna cellantal, centrifugera celler vid 300 xg vid RT (15-25 ° C) under 5 minuter.
- Dekantera supernatanten och slamma cellerna försiktigt i 0,5-1 ml steril PBS.
- Använd 40 | im cellfilter cap-filter för att erhålla enkelcellsuspension.
- Justera cellantalet till 5000000 celler per ml.
- Förbered ultra låg fäst 96-brunnars plattor med 100 | il sfärer medium (MEGM kompletterat med tillväxtfaktorer, cytokiner, och kosttillskott,B-27, heparin-natrium; eller DMEM / F12 kompletterat med tillväxtfaktorer, cytokiner, och kompletterar, B-27, heparin-natrium, med eller utan tillsats av 1% metylcellulosa, se även tabell 1). Valfritt lägga antibiotika till mediet vid en koncentration av 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin för att minimera risken av möjlig kontaminering.
- Sortera RFP + och RFP- celler i förberedda 96-brunnars plattor från ovan, en cell per brunn (enkelcellbaserad sfärer analys) och 100 celler per brunn (multi cellbaserade sfärer assay), respektive. Utför sortera på kommersiellt tillgängliga cellsorterare (se Material) använder enda cell läge Sortera setup: 100 μ munstycke, slida tryck 20 psi, och avkastning mask 0, renhet mask 32, fasmask 16.
- Bedöm utstrykningseffektivitet genom mikroskopiskt scoring brunnar innehållande celler (för enkelcellbaserad analys) och genom att räkna cellantal i enskilda brunnar (för den multicellbaserad analys, fig 2
- Inkubera cellerna under normala förhållanden i sfärer medel (för komposition se steg 2.6) vid 37 ° C och 5% CO2. Supplement dagligen bFGF (20 ng / ml) och EGF (20 ng / ml).
- Efter en vecka, räkna antalet växande tumör sfärer med användning av ett standardmikroskop med 4X eller 10X förstoring och ett fluorescensmikroskop för att detektera fluorescenssignal från det integrerade reportersystem. Räkna sfärer med en diameter som överstiger 100 nm som "stora" sfärer, och sfärer med en diameter 50-100 um som "små" sfärer (Figur 3). Se till att du räkna riktiga sfärer och inte cell kluster.
OBS: I enstaka cellbaserade analyser sfären bildningen är lättare att göra mål mikroskopiskt efter 10 (kontra 7) dagars odling. - Beräkna andelen sfärbildande celler i RFP + och respektive RFP- celler i enstaka cellbaserade analyser (en 96-brunnar för varje enskild experiment) eller multicell-based spheres analyser (en brunn för varje enskild experiment) som presenteras av Shaw et al. 16
OBS: Andel sfärbildande celler (%) = (antal sfärer) / (antal sådda celler) x 100
3. seriepassage av sfärer
- Placera innehållet i varje brunn i ett lämpligt sterilt rör och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT. För flera cellbaserade sfärer analyser, samla ihop sfärerna från en brunn. Tvätta väl 3-5 gånger med PBS och centrifugera två minuter längre. För ensamstående cellbaserade sfärer analyser, samlar enskilda sfärer. På grund av det låga antalet celler, använda 1,5 ml rör för centrifugering och tvättsteg.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il av 0,05% trypsin-EDTA.
- För att uppnå optimal cellseparation, inkubera cellsuspensionen vid 37 ° C under 5 min i en mjuk skakapparat. Optimera trypsinization tid för din cellinje till lägre celldöd hastighet: om ingen storsfärer syns finfördela försiktigt med hjälp av en 100 l pipettspets. Om stora sfärer är fortfarande närvarande, inkubera med trypsin ytterligare 3 min och sedan vidare till tritureringsprocessen steget. Vid enstaka cellbaserade analyser ser till att optimera tiden för optimal cellutbyte av levande celler under trypsinering steget.
- För att inaktivera trypsinet, tillsätt 500 pl komplett medium och centrifugera vid 300 xg under 10 min, i fallet med enkelcellanalyser, centrifugera under ytterligare 2 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna försiktigt i sfärer medium.
- Använd en 40 | im cellfilter cap filter för att erhålla en enkelcellsuspension.
- I fallet med användning av RFP + och RFP- celler i flercell bassed analyser, bedöma hur stor procentandel av fluorescerande celler i varje brunn efter omblandning via flödescytometer analys.
- För serie omstryka analyser av enskilda celler, utsäde 1 cell per brunn i en ny ultra låg infästning 96-brunnar förberedda enligt ovan. Från en individ sfär, utsäde cirka 20 enskilda brunnar. För omstryka analyser av flera cellbaserade primära sfärer, fröceller erhållen från en brunn av primära sfärer i en ny 96-brunnars platta och räkna cellantal nästa dag genom mikroskopi.
- Bedöm andelen sfärbildande celler i sekundära sfärer analyser med hjälp av formeln som beskrivs i steg 2.11.
4. Resultat Analys
- Analysera resultat från experiment utförda i oberoende tre exemplar och använda dubbelsidig T-test för att analysera normalfördelade värden och annat Mann-Whitney-test för statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I konventionella sfärer analyser, nästan 40% av RFP + OVCAR-3 celler kontra 20% av RFP- celler gav upphov till en enskild tumör sfär i den primära sfärer analysen (Figur 4A). Dessutom sfärer bildade av RFP + celler var större i storlek än de som bildas genom RFP- celler.
När pläterade i enstaka cellbaserade analyser, RFP + celler bildas också fler sfärer än RFP- celler, vilket bekräftar resultaten ovan. Men det fanns en tendens till generation färre sfärer per pläterade i singel kontra flera cellbaserad analys (Figur 4A, B), vilket tyder på att i denna analys sfär bildningen kan vara partisk genom tekniska artefakter såsom mekanisk sfär fusion eller dissociation i den icke-vidhäftande odlingsmedium.
För att ytterligare undersöka dessa aspekter, jämförde vi påverkan av cell plätering tätheten på sfärer formation. Vi pläterade celler med hjälp begränsande utspädning från 1000 celler till 1 cell per brunn i 96-Ja plattor och fann att antalet nya sfärer var starkt beroende av antalet initialt pläterade celler. Överraskande, var högre antal sfärer räknas från lägre antal pläterade celler i både MGEM och DMEM / F12-baserade medier, visar att faktiskt plätering modaliteter högt partiskhet resultat i denna analys (figur 5). När däremot cellerna immobiliserades genom tillsats 1% metylcellulosa till DMEM / F12 baserade sfärer effektivitet sfär bildning var mediet 23,24 mestadels oberoende av celltäthet.
För att undersöka inverkan av sfärer odlingsbetingelser på CSC egenskaper, analyserade vi den procentuella andelen av celler som uttrycker röd fluorescens-signal efter 7 dagars inkubation i sfärerna analysen. Vi fann att i flera cellbaserade sfärer kulturer cirka 35% av cellerna från RFP + sfärer förlorade sin röda fluorescenssignal efter sju dagars odling (Figur 6A), vilket tyder på att de har undergen differentiering, medan 65% behöll en RFP + signal tyder självförnyelse kapacitet. Däremot celler från sfärer som genereras från början RFP- celler förblev RFP negativ (Figur 6A), vilket indikerar att de inte kan återupprätta stamcellspotential under dessa förhållanden.
Fluorescensmikroskopi utfördes på sfärer som genereras från enstaka celler bekräftade dessa resultat visar att ensamstående sfärer härstammar RFP + celler innehöll både RFP + och RFP- celler medan sfärer som härrör från RFP- celler förblev negativa för den röda signalen.
Liknande resultat observerades i omstryka analyser från båda villkoren.
Figur 1. Arbetsflöde för lentiviral transduktion, urval och sortering av RFP + och RFP- celler. Efter Lentiviral transduktion och positiv selektion av framgångsrikt transducerade celler via puromycin exponering, RFP- och RPF + -celler sorteras genom FACS i individuella brunnar i en 96-brunnars platta i sfärer medium. För flera cellbaserade sfärer analyser, är 100 celler placeras i en brunn. Utstrykningseffektivitet bedöms genom mikroskopi utförs efter sortering. Spheres gjordes av mikroskopi efter sju till tio dagar, dissocieras till enskilda celler, analyserade via flödescytometri och replated till sekundära sfärer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Avbildning av sorterad RFP + och RFP- celler efter utstrykning. Single RFP + och RFP- celler sorteras i varje brunn i en 96-brunnars platta analyseras för korrekt plätering med användning av en (fluorescerande) mikroskop.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av sfärer bildning i enkel cellbaserade analyser. Spheres bildning analyseras efter sju till tio dagar. (A) Large (diameter> 100 nm) och (B) liten (diameter 50-100 um). Sfärer urskiljs mikroskopiskt baserat på storlek Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effektivitet av tumör spheres bildning från RFP +och RFP- OVCAR-3 celler i multi kontra encelliga baserade sfärer analyser. Jämförelse av primär och sekundär sfär effektivitet från OVCAR-3 celler som analyserats i flera (A) kontra enstaka cellbaserade sfärer analyser (B). Klicka här för en större version av denna siffra.
Figur 5. Cell plätering tätheten starkt påverkan sfären räknas från OVCAR-3 celler i multi cellbaserade sfärer analys utförd i flytande men inte i metylcellulosa kompletterat kulturer. Användning av olika celltäthet och tillväxtmedier har rapporterats i litteraturen för äggstockscancer sfärer analyser. Att analysera eventuella fördomar som införts av dessa variabler, celler pläterade på different tätheter i 200 pl olika sfärer odlingsmedier (MGEM, DMEM / F12 med alla tillägg som anges i protokollet avsnittet eller DMEM / F12 med alla tillägg och innehåller 1% metylcellulosa) och sfären bildning görs efter 7 dagar (A) . Visat i (B) är mikroskopiska bilder av celler utstrukna på olika densiteter tagna en dag efter utstrykning i DMEM / F12 spheres odlingsmedium utan metylcellulosa. Notera cellkluster växande vid hög celltäthet i motsats till enskilda celler ses i låg densitet plattor. Skala bar för bilder:. 50 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Analys av RFP signal i tumör sfärer bildas från RFP + och respektively RFP- OVCAR-3-celler (A) Flödescytometrianalys för RFP signal i dissocierade sfärer som härrör från RFP + och RFP- celler (multicellbaserad sfärer analys). (B) Mikroskopi av sfärer som härrör från RFP + och RFP- celler (enda cell-baserade sfärer analys) avslöjar heterogena RFP signal i sfärer som härrör från RFP + men inte från RFP- celler. Bilder togs vid dag 7 för konventionella sfärer och dag 10 för enskilda cellbaserade sfär analyser. Notera den större storleken av sfärer som härrör från RFP + förmodade CSCs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Humant ovarialcancer cellkälla | Basiskt medium | Kosttillskott | Författare |
| OVCAR-3, Caov-3, primärmaterial | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 | ig / ml heparin, hydrokortison, insulin (SingleQuot kit) | Bareiss et al., |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 | ig / ml insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Li Ma et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 | ig / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 2% B-27, 0,4% BSA | Haiwei Wang et al., |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 | ig / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 2% B-27, 1 ng / ml hydrokortison | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, primärmaterial | DMEM / F12 | 5 | ig / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | T. Xiang et al. |
| Primärt material | DMEM / F12 > | 5 | ig / ml insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | Soritau et al., |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | MF Shi et al. |
| Primärt material | DMEM / F12 | 5 | ig / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | Shu Zhang et al., |
| Primärt material | EBM-2 eller X-VIVO | 5 | ig / ml insulin, 20 ng / ml rEGF | Ilona Kryczek et al., |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 | ig / ml heparin | Dongming Liang et al. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spheres kulturer är en vida använd metod för att analysera cancerstamcellspotential och anrika för stamceller liknande celler i ett brett spektrum av humana tumörceller 15,25,26. Under dessa odlingsbetingelser, är cancerceller som saknar självförnyelse förmåga förväntas differentiera och så småningom genomgå celldöd. Även om de till en början kan bilda cellkluster eller ens tumör sfärer särskilt i primära analyser, är de inte kunna upprätthålla sfär bildande förmåga vid serie omstryka grund av bristande självförnyande egenskaper. Spheres analyser används som surrogat analyser för att identifiera CSCs och utvärdera deras frekvens i hela tumörcellpopulationer.
Däremot kan observeras betydande variation mellan sfärer analyser utförda efter olika publicerade protokoll 5,10,27-35 (tabell 1). I vårt laboratorium har vi tidigare publicerat sfär bildning från humana ovarialkarcinomceller använder MEGM kompletterat med B-27, BFGF, Heparin och SingleQuot TM (innehållande insulin, rEGF och hydrokortison). Andra labs använder hela DMEM / F12 Medium, medan vissa bara lägga B-27 och rEGF. I denna rapport har flera cellbaserade sfärer analys i OVCAR-3 celler därför utförs med olika villkor. Använda MEGM eller DMEM / F12 med alla tillägg ingen signifikant skillnad i sfär bildning observerades i dessa celler (figur 5A). Dessutom har vissa laboratorier spekulerat att EGF och FGF kan vara snabbt bryts ned och har etablerat protokoll lägga dessa tillväxtfaktorer dagligen till mediet. Vi kan därför jämföras sfärer analyser utförda i ett medium där EGF och FGF lades först i början av sfärer analyser med daglig tillsats av EGF och FGF till cellkulturen, och vi hittar dessa analyser för att ge likvärdiga resultat i OVCAR-3-celler (data visas ej), vilket antyder att den dyra och mödosamma dagligt tillskott med EGF och FGF inte alltid kan vara nödvändigt. Huruvida dessa resultatär tillämpbara på celler från andra ovarialcancer cellinjer eller primärprover, eller under olika experimentella betingelser återstår att bestämmas.
Men observerade vi en betydande snedvridning av antalet skårade sfärer som införts av en annan testade variabeln, cell plätering tätheten. Överraskande, brunnar såddes med lägre antal celler uppvisade högre antal sfärer. Begränsande cellrörlighet med 1% metylcellulosa gav samma effektivitet sfär bildning, oberoende av antalet ursprungligen utstrukna celler. Dessa resultat tyder på att cellklumpning och sfär fusion eller disaggregering kan inträffa modifiera sphere nummer och leder till felaktiga resultat i fler cellbaserade spheres analyser. När celler stryks på lämplig täthet, multi cellbaserade analyser leder dock till resultat ganska jämförbara med uppgifter som samlats in i enstaka cellbaserade sfär analyser (Figur 4). För att ytterligare utforska dessa resultat vi jämförde singel och multicellbaseradanalyser som använder ovarialkarcinomceller sorteras i förmodade CSCs via en nyligen publicerad lentiviral RFP uttrycker reporter system för en Sox2 regulatorisk region 10. Faktum bekräftade båda analyserna den förstärkta primära och sekundära sfär bildande kapacitet RFP + mot RFP- celler (figur 4A, B). Viktigt högre antal sfärer observerade från RFP + celler var inte på grund av högre proliferativ kapacitet av Sox2 uttryckande celler (data visas ej), vilket är i linje med tidigare resultat som visar att induktion av Sox2 främjar sfärer formation och in vivo tumorigenicitet utan accelerera cellcykelprogressionen 10.
Sammantaget enstaka cellbaserade sfärer analyser är mer arbetskrävande och dyra, men de leder till mer exakta uppgifter, vilket också bekräftas av den högre reproducerbarhet av resultaten mellan försöken. Eftersom plätering densitet högt påverkar resultat i flera cell based fjädring spheres analyser, upfront titrering av tillräcklig plätering tätheten krävs för varje enskild tumör celltyp innan analys sfär bildning med hjälp av dessa analyser. Alternativt kan de mer exakta enstaka cellbaserade analyser användas i förskott, eller metylcellulosa tillskott för att förbättra noggrannheten i resultaten genom att minska mekaniska artefakter. Om sfär bildning jämförs mellan förhållanden där den genetiska modifieringen eller läkemedelsbehandling allvarligt kan förändra cellernas viabilitet, och därmed minska celldensitet, kan enstaka cellbaserade sfär analyser vara obligatoriskt att undvika falska positiva resultat.
Sammanfattningsvis under lämpliga experimentella betingelser både multi cellbaserade sfärer analys och singeln cellbaserade sfärer analysen kan indikera skillnader i sfär potential mellan olika cellpopulationer (stam och icke-stamceller). Men flera cellbaserade sfärer analyser som vanligtvis utförs i flytande kulturer är mer mottagliga för errors införts av experimentell design genom plätering tätheten. Komplettering av metylcellulosa (1%) till flera cellbaserade analyser kan begränsa artefakter relaterade till cell klumpar och sfären fusion. Baserat på dessa data rekommenderar vi enstaka cellbaserade sfärer analyser som ska utföras, såvida inte detaljerade titreringssystem analyser har utförts i förskott och negativa effekterna av experimentella förhållanden på cellviabilitet och därmed celltätheten har uteslutits. Men enstaka cellbaserade sfärer analyser är mer arbetskrävande och dyrare, och kanske inte krävas i varje experimentell inställning. Metylcellulosa-kompletterat multi cellbaserade sfärer analyser kan utgöra ett annat alternativ i vissa experimentella inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
