Abstract
B lymfocyt immunoglobulin tung kæde (IgH) klasse-skift rekombination (CSR) er en fremgangsmåde, hvor indledningsvis udtrykt IgM skifter til andre IgH isotyper, såsom IgA, IgE og IgG. Måling af IgH CSR in vitro er en vigtig metode til undersøgelse af en række biologiske processer, der spænder fra DNA-rekombination og reparation aspekter af molekylær og cellulær immunologi. In vitro CSR assay involverer flowcytometrisk måleoverflade Ig ekspression på aktiverede B-celler. Mens målingen af IgA- og IgG-underklasser er ligetil, måling af IgE ved denne metode er problematisk på grund af opløseligt IgE-binding til FceRII / CD23 udtrykt på overfladen af aktiverede B-celler. Her beskriver vi en unik procedure for nøjagtig måling af IgE-producerende muse-B-celler, der har undergået CSR i kultur. Metoden er baseret på trypsin-medieret spaltning af IgE-CD23 komplekser på celleoverflader, hvilket tillader påvisning af IgE-producerende B-afstamningsceller af cytoplasmic farvning. Denne procedure giver en bekvem løsning til flowcytometrisk analyse af CSR til IgE.
Introduction
Under immunglobulin tung kæde (IgH) klasse skiftrekombination (CSR) i mus og mennesker, IgH μ konstant region exoner (Cu) slettes og erstattes af en af flere sæt af downstream konstant regionexonerne (CH s) (f.eks Cy, Ce og Ca), hvilket resulterer i et skift fra produktion af IgM til produktion af andre Ig klasser (f.eks IgG, IgE eller IgA). CSR sker inden switch (S) regioner, som er 1-10 kb sekvenser lokaliseret 5 'for hvert sæt af CH s 1. Den aktiverings-induceret cytidindeaminase (AID) enzym initierer CSR via cytidin deaminering aktivitet.
IgE er en vigtig mediator af allergisk sygdom 2 og en større forståelse af, hvordan IgE produceres og reguleret, kan åbne døre til nye terapeutiske tilgange til atopisk sygdom. I mus og mennesker, IgE er den mest stramt reguleret Ig isotype. IgE normalt detekteres ved niveauer tusindvis af Times mindre end andre IgH isotyper 3, men kan være stærkt forhøjet i sygdomstilstande 4. Imidlertid er VSA IgE ufuldstændigt forstået. In vitro-aktivering af B-celler ved hjælp af IL-4 i kombination med enten anti-CD40 eller LPS inducerer VSA både IgG1 og IgE 5. Aktiverede B-celler udtrykker lave affinitet IgE receptor FceRII / CD23 2,6, som binder opløseligt IgE udskilles i kulturen efter CSR. Derfor, når en analyse med flowcytometri, B-celler med receptor-bundne IgE pletten tilsvarende til B-celler endogent udtrykker IgE 7. Selv om det er kendt, at mus B-celler udtrykker lav affinitet IgG receptor FcyRllb1 (CD32) 8, i vores erfaring er det ikke synes at forstyrre målingen af klasseskift til IgG1. Men når måling IgE skift efter B-celle-aktivering i kultur, kan specifik overflade IgE tilsløre analysen. Med fælles farvningsmetoder, ikke-IgE-udtrykkende celler pletten positivt for IgE.
Her skitserede er en strategi, der er blevet anvendt til at gennemføre CSR-analyser og opdage sande IgE-udtrykkende B-celler fra mus 9-11. Behandling af aktiverede B-celler med trypsin, en fælles lab reagens fordøje protein, fjerner både cytophylic og membranbundet overflade IgE. Efterfølgende permeabilisering og farvning for cytoplasmatisk IgE således afslører den sande IgE-producerende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle eksperimenter er beskrevet her, var i overensstemmelse med de institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer og godkendt af Animal Research Børnehospital (ARCH), Boston, Mass.
1. Fremstilling af reagenser
- 1.000 x IL-4 lager: Fortynd IL-4 cytokin til 20 ug / ml i H2O eller 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Dispenser i 200 pi prøver til 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
- 1.000 x anti-CD40: Anskaf fra producenten på 1,0 mg / ml, opbevares ved 4 ° C.
- B-celle stimulation media: til 425 ml RPMI-1640 medium, tilsættes 75 ml frisk optøet føtalt kalveserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-buffer, 5 ml L-glutamin lager, 5 ml penicillin: Streptomycin lager 5 ml Minimum Essential Medium ikke-essentielle aminosyrer (MEM-NEAA), og 3,5 pi 2-mercaptoethanol. Hold medier ved 4 C i op til en uge. Tilføj IL-4 (20 ng / ml) og anti-CD40 (1,0 ug / ml) umiddelbart før brugkun til mængden af medier påkrævet.
- 2% FCS-FACS Buffer: Der tilsættes 10 ml FCS til 490 ml 1x PBS. Hold ved 4 ° C.
- 2x trypsin-EDTA-opløsning: Fortynd 5 ml 10x trypsin-EDTA stamopløsning (5,0 g trypsin, 2,0 g EDTA per liter) i 20 ml 1X PBS. Store trypsin-EDTA i 2x arbejder portioner ved 4 ° C. Tillad at opvarme til stuetemperatur før brug.
- Føtalt kalveserum: Hold optøede FCS ved 4 C i op til to uger. Anbring på is 15 min før den cytoplasmatiske farvning procedure.
- Neutral-bufferet formalin: Forbered en 10% formalin (3.7% paraformaldehyd). Formalin er giftigt og derfor håndtere det under et laboratorium stinkskab mens iført passende PV. Store formalin ved stuetemperatur i en kemisk opbevaringsskab.
- Methanol: Store absolut methanol (100%) ved -20 ° C, indtil cellerne er klar til at blive permeabiliseret. Bemærk, at methanol er brændbart og skal opbevares i en passende fryser.
2.Oprensning og aktivering af B-celler
- Fra et friskhøstede muse milt, fremstille en enkelt cellesuspension ved forsigtigt at trykke det organ, gennem en 70 um cellefilter med stemplet i en 3 ml sprøjte. I et 15 ml konisk centrifugerør, indsamle celler i 10 ml 1x PBS og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Derefter dekanteres den klare og resuspender pellet i 1 ml røde blodlegemer lyseringsbuffer i 5 min. Neutraliser med 13,5 ml 1x PBS og centrifugeres ved 300 xg i 5 min.
- (Valgfrit) magnetisk adskilte B-cellerne under anvendelse af anti-CD45R (B220) -mærkede perler efter MACS oprensningsprotokol i henhold til producentens anvisninger.
- Stimulering oprensede B-celler ved 1,0 x 10 6 celler / ml i opvarmet B-celle stimulation medier indeholdende IL-4 (20 ng / ml) og anti-CD40 (1,0 ug / ml) i 5 dage ved 37 ° C. Start med 8 ml kultur opdelt i 2 brønde i en 6-brønds dyrkningsplade (4 ml hver).
- Tjek culture dagligt for at opretholde ved 1,0 x 10 6 celler / ml. Juster koncentrationen ved at opdele i andre brønde og fortynde kulturen med B-celle stimulation medier indeholdende frisk IL-4 og anti-CD40.
3. trypsinering, fiksering, og Permeabilisering
- Trypsinering
- Saml op til 1,0 x 10 7 af dyrkede celler i en 15 ml konisk rør, centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter, og dekanter supernatanten.
- Vask med 10 ml PBS for at fjerne den resterende proteinet fra cellen indsamling medier. Der centrifugeres trin, og der dekanteres supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i den resterende mængde efter dekantering (ca. 100 pi).
- Derefter tilsættes forsigtigt 800 pi stuetemperatur 0,1% (2x) trypsin-EDTA til cellerne. Dispenser langsomt ved en vinkel på 45 ° ned langs siden af den koniske rør.
- Glasset lukkes og blandes forsigtigt ved at vippe røret, så væsken løber langs længden af røret 5-6 tids. En trævlet, hvidt bundfald kan dannes i opløsningen. Begræns trypsinering tid til under en min.
- Stands trypsinisering reaktionen med 1 ml kold FCS. Fortynd FCS straks ved tilsætning af 10 ml kold PBS.
- Centrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C, derefter dekanteres supernatanten og returnere rørene til is.
- Fiksering
- Resuspender cellerne i den resterende mængde efter dekantering. Hvis det er nødvendigt, bringe volumen op til 100 pi med kold PBS.
- I et stinkskab, tilsættes 800 pi 10% neutral bufret formalin opløsning til cellerne og pipetteres op og ned. Røret vil varme ved tilsætning af formalin. Der inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
- Permeabilisering
- Opret en benchtop vortex mixer ved en forsigtig omrystning hastighed.
- Tegn 9 ml kold (-20 ° C) methanol i en 10 ml serologisk pipette.
- Hold røret indeholdende cellerne over vortex mixer og forsigtigt starte Shaking celler.
- Tilføj kold methanol til røret, så det falder dråbevis på cellerne, mens røret stadig omrystning så methanol kontinuerligt blanding. Efter de første 2 ml methanol udleveringen kan øges til en langsom strøm.
- Lad røret sidde på is i 30 min for at fuldføre permeabilisering. Alternativt kan cellerne opbevares ved -20 ° C i op til en måned.
4. fluorescensfarvning for IgG1 og IgE Class Switching
- Centrifuger prøven ved 300 xg i 5 minutter og dekanteres methanolopløsningen. Et hvidt bundfald kan bundfælde med cellerne.
- Der tilsættes 10 ml stuetemperatur 1x PBS og centrifuger ved 300 xg i 5 min at vaske celler. Gentag en gang. Bemærk: Vask af pillen med stuetemperatur PBS opløser ekstra bundfald, der kan dannes efter trin 4.1.
- Udfør en yderligere vask med 10 ml 2% FCS-FACS buffer.
- Fordel prøver til en 96-brønds rundbundet pladeog der centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Dekanteres supernatanten og sætte pladen på is.
- Stain i 60 pi 2% FCS-FACS buffer per brønd med følgende antistoffortyndinger: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Efter 5 min på farvning, vask pladen med 150 pi 2% FCS-FACS-buffer og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g.
- Resuspender i 400 pi 2% FCS-FACS buffer og pipette gennem en 40 um nylon cellefilter i et 5 ml FACS rør.
5. Brug følgende Gating Strategi:
- Isoler CD45R (B220) positive celler fra sprængning lymfocytpopulationen placeret på FSC / SSC plot (figur 1).
- Fra B220 positive celler, skal du bruge IgE og IgG1 komplot for at afsløre de tilsvarende populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne procedure er gennemført med succes for at studere CSR til IgE i mus B-celler. For at demonstrere effektiviteten måle CSR, vi stimuleret muse milt B-celler med anti-CD40 og IL-4 som beskrevet tidligere 11. Efter fem dages stimulation blev celler indsamlet og behandlet under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor og farvet med fluorescens-mærket IgM, IgG1, IgE, og B220 (CD45R) antistoffer. Lukket på sprængning lymfocytter (figur 1), en klar population af IgE + celler kan ikke rent diskrimineret uden trypsinbehandling (figur 2a). Imidlertid trypsinisering af celler før fiksering og permeabilisering muliggør separation af IgE-producerende celler (figur 2B) på grund af fjernelse af overflade-bundet IgE.
Figur 1: Videresnd.valgARD vs. sidespredning FACS plot af muse milt B celler efter 5 dages stimulation i kultur med IL-4 og anti-CD40. Sprængning lymfocytter udgør 63% af de samlede erhvervet begivenheder.
Figur 2:. Virkning af trypsin på cytoplasmatisk farvning af IgE og IgG1 i aktiverede B-celler (a, b) FACS plots (ovenfor) og histogrammer (nedenfor) gatet på sprængning milt B-celler fra 129 / B6 blandede baggrund mus efter aktivering i kultur i 5 dage med anti-CD40 og IL-4. Fiksering og methanol permeabilisering alene (a) og med tilsætning af trypsin (b) er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stimulering af muse milt B-celler i kultur med anti-CD40 og IL-4 vil simulere T hjælper type 2 (T H2) interaktioner, opmuntrende klasseskift til IgG1 og IgE 5. B-celler kan aktiveres for VSA i forbindelse med samlede splenocytter 12 eller som oprensede milt-B-celler 11. Som det fremgår af protokollen (trin 2.3), B-celle berigelse er valgfri, og er skøn forsøgslederen for at afgøre, om det ville gavnligt. Positive magnetisk separation af B-celler under anvendelse af CD45R (B220) -mærkede perler anvendes her. Efter separation, anbefales det at kontrollere cellen renhed ved FACS så koncentrationen af B-celle kan justeres til 1,0 x 10 6 celler / ml for korrekt cytokin og antistof stimulering. Det bør også bemærkes, at IL-4-protein, som har undergået frysnings- / optøningscykler kunne have nedsat aktivitet.
Trypsinisering af celler før fiksering og permeabilisering muliggør accurspiste måling af klasseskift via flowcytometri (figur 2). Korrekt trypsinering af cellerne er afgørende for en vellykket gennemførelse af denne procedure. Som FCS kan inhibere trypsin, er en 1x PBS vask udføres før trypsinisering trin. Vi fandt en 30 sek inkubation ved stuetemperatur er tilstrækkelig til fuldstændig fordøjelse. Længere varigheder kan mærkbart påvirker cellelevedygtighed.
Før analyse, er det vigtigt at vaske cellerne flere gange med PBS for at fjerne spor af methanol. Methanol fremførsel kan ændre antistofbinding 13 og kan udfælde proteiner fra FCS anvendes i nedstrøms flowcytometrisk analyse 14. I denne henseende kan andre permeabilisering metoder (dvs. saponin) være et alternativ til anvendelse af methanol. Methanol er et organisk opløsningsmiddel, der opløser membranlipider, mens rengøringsmidler forstyrre membranen integritet 15. En fordel for methanol permeabilisering er evnen af langtidslagringaf fikserede celler ved -20 ° C 14.
Der er nogle begrænsninger for at huske på, når du bruger denne procedure. Fordi trypsin spalter proteinrester, kan nogle FACS pletter se anderledes efter behandlingen, eller kan miste evnen til at binde til at målrette epitoper helt. Derudover kan et tab i celleantal efter trypsinbehandling forekomme. Det betyder dog ikke at påvirke nøjagtigheden af IgE CSR målinger som vi har fundet denne metode til at være klart sammenlignelige til klasseskift data indsamlet fra måling af antistof sekreter enkelte hybridomkloner 11.
Er blevet rapporteret Andre metoder til påvisning af IgE-producerende muse-B-celler. En fremgangsmåde anvender en syrevask procedure for at fjerne receptor-bundne IgE forud for farvning for membranbundet IgE på IgE-udtrykkende celler 16-18. En anden fremgangsmåde anvender et monoklonalt anti-IgE-antistof til at blokere alle overflade IgE før celle permeabilization og farvning for intracellulær IgE af IgE-udtrykkende celler 19. Endvidere en nylig undersøgelse profileret en otte-farve FACS panel at identificere IgE-switched B cellepopulationer i mennesker ved at udelukke IgM +, IgD + IgG + og IgA + B-celle delmængder 20. Sammenlignet med disse andre metoder, den her beskrevne fremgangsmåde undgår anvendelsen af denaturerende syrevask, og overskydende antistoffer er ikke nødvendige.
En fordel for denne procedure er, at det ikke foreskriver specifikke monoklonale antistoffer til måling af CSR til IgE. Alternative anti-IgE monoklonale antistoffer har vist sig at detektere kun endogene IgE molekyler. Den hybridomklon R1E4 producerer en rotte-anti-muse-monoklonalt IgE antistof specifikt kun for endogene overflademolekyler, ikke cytophilic IgE bundet til CD23 21,22, men er ikke kommercielt tilgængelige. Den ovenfor beskrevne protokol er praktisk og økonomisk, fordi det anvender fælles lab ReageNTS. Den anti-IgE antistof, der anvendes her sandsynligvis binder til receptor-bundne IgE på et sted følsomme for trypsin-spaltning, fordi IgE signal på grund cytophilic IgE reduceres efter behandling (figur 2). Men forskere udfører denne protokol har frihed til at vælge mellem en række kommercielt tilgængelige kloner til eksperimenter. Desuden kan begrebet anvendelse af trypsin til at fjerne celleoverfladeproteiner udvides til påvisning af andre cellemarkører ved FACS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW er støttet af NIH tilskud AI089972 og AI113217, og af Mucosal Immunologi Studies Team, og har en karriere-prisen til medicinsk Forskere fra Burroughs Wellcome fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
