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Immunology and Infection

सच का पता लगाने के लिए माउस बी वंश प्रकोष्ठों आईजीई व्यक्त

Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52264
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Abstract

बी लिम्फोसाइट इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (IGH) वर्ग स्विच पुनर्संयोजन (सीएसआर) शुरू में आईजीएम ऐसे आईजी ऐ, आईजीई और आईजीजी के रूप में अन्य IGH आइसोटाइप, स्विच करने के लिए व्यक्त की जिसमें एक प्रक्रिया है। इन विट्रो में IGH सीएसआर के मापन आणविक और सेलुलर इम्यूनोलॉजी के पहलुओं को डीएनए पुनर्संयोजन और मरम्मत से लेकर जीवविज्ञान प्रक्रियाओं के एक नंबर के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। इन विट्रो सीएसआर परख सक्रिय बी कोशिकाओं पर प्रवाह cytometric माप सतह पुलिस महानिरीक्षक अभिव्यक्ति शामिल है। आईजी ऐ और आईजीजी उपवर्गों की माप सीधा है, वहीं इस विधि द्वारा आईजीई का माप की वजह से घुलनशील आईजीई FcεRII के लिए बाध्य करने के लिए समस्याग्रस्त है / CD23 सक्रिय बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की है। यहाँ हम संस्कृति में सीएसआर आया है कि माउस बी कोशिकाओं आईजीई-उत्पादन की सही माप के लिए एक अद्वितीय प्रक्रिया का वर्णन। विधि cy द्वारा बी वंश कोशिकाओं आईजीई उत्पादक का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, सेल सतहों पर आईजीई-CD23 परिसरों की ट्रिप्सिन की मध्यस्थता दरार पर आधारित हैtoplasmic धुंधला। यह प्रक्रिया आईजीई के लिए सीएसआर के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक समाधान प्रदान करता है।

Introduction

चूहों और इंसानों में इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (IGH) वर्ग स्विच पुनर्संयोजन (सीएसआर) के दौरान, IGH, लगातार क्षेत्र एक्सॉनों (Cμ) नष्ट कर दिया और नीचे की ओर निरंतर क्षेत्र एक्सॉनों के कई सेट में से एक (सी एच एस) (जैसे Cγ द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं μ अन्य पुलिस महानिरीक्षक वर्गों (जैसे आईजीजी, आईजीई, या आईजी ऐ) के उत्पादन के लिए आईजीएम के उत्पादन से एक स्विच में जिसके परिणामस्वरूप Cε, और Cα),। सीएसआर सी एच एस 1 के प्रत्येक सेट करने के लिए '5 स्थित 10/01 केबी दृश्यों रहे हैं, जो स्विच (एस) क्षेत्रों के भीतर होता है। सक्रियण प्रेरित Cytidine deaminase (सहायता) एंजाइम cytidine deamination गतिविधि के माध्यम से सीएसआर शुरू की।

आईजीई एलर्जी रोग दो की एक प्रमुख मध्यस्थ और आईजीई का उत्पादन किया और atopic रोग के लिए नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए दरवाजे खोल सकता है नियंत्रित किया जाता है कैसे का एक बड़ा समझ है। चूहों और इंसानों में, आईजीई सबसे कसकर विनियमित पुलिस महानिरीक्षक निर्धारण है। आईजीई सामान्य रूप से टिम के स्तर हजारों में पता चला हैतों अन्य IGH से कम तीन आइसोटाइप, लेकिन अत्यधिक रोग राज्यों चार में ऊपर उठाया जा सकता है। हालांकि, आईजीई के लिए सीएसआर अधूरे समझा जाता है। बी कोशिकाओं की इन विट्रो सक्रियण आईएल -4 विरोधी CD40 या LPS या तो साथ संयोजन में, दोनों IgG1 और आईजीई से 5 सीएसआर लाती इस्तेमाल करते हैं। सक्रिय बी कोशिकाओं घुलनशील आईजीई सीएसआर के बाद संस्कृति में स्रावित बांधता है जो कम आत्मीयता आईजीई रिसेप्टर FcεRII / CD23 2,6, व्यक्त करते हैं। प्रवाह cytometry के साथ विश्लेषण इसलिए, जब रिसेप्टर बाध्य आईजीई दाग के साथ बी कोशिकाओं इसी तरह endogenously आईजीई 7 व्यक्त कोशिकाओं बी। यह है कि माउस बी में जाना जाता है जबकि कोशिकाओं यह IgG1 के लिए कक्षा स्विचिंग की माप के साथ हस्तक्षेप करने के लिए प्रकट नहीं होता है कि हमारे अनुभव में कम आत्मीयता आईजीजी रिसेप्टर FcγRIIB1 (CD32) 8, व्यक्त करते हैं। संस्कृति में बी सेल सक्रियण के बाद आईजीई स्विचिंग मापने हालांकि, जब अविशिष्ट सतह बाध्य आईजीई विश्लेषण अस्पष्ट हो सकता है। आम धुंधला तरीकों के साथ, गैर आईजीई व्यक्त कोशिकाओं आईजीई के लिए सकारात्मक दाग।

यहाँ रेखांकित चूहों 9 से सच आईजीई व्यक्त बी कोशिकाओं सीएसआर assays के आचरण और पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है कि एक रणनीति है - 11। Trypsin के साथ सक्रिय बी कोशिकाओं के उपचार, एक आम प्रयोगशाला अभिकर्मक प्रोटीन को पचाने के लिए, cytophylic और झिल्ली दोनों बाध्य सतह आईजीई हटा। साइटोप्लास्मिक आईजीई के लिए बाद permeabilization और धुंधला इस प्रकार सच्चे आईजीई उत्पादक कोशिकाओं का पता चलता है।

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Protocol

नोट: यहाँ वर्णित सभी प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा-निर्देशों के अनुसार में थे और पशु अनुसंधान बच्चों के अस्पताल (आर्क), बोस्टन, मास ने मंजूरी दे दी।

अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. 1,000x आईएल -4 स्टॉक: एच 2 ओ या 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में 20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के लिए पतला आईएल -4 साइटोकाइन। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए 200 μl aliquots में बांटना।
  2. 1,000x विरोधी CD40: 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.0 मिलीग्राम / एमएल, दुकान पर निर्माता से प्राप्त करते हैं।
  3. बी सेल उत्तेजना मीडिया: RPMI-1640 के माध्यम के 425 मिलीलीटर के लिए जोड़ने के लिए, 75 हौसले thawed भ्रूण बछड़ा सीरम की मिलीलीटर (एफसीएस), 1.0 एम HEPES बफर, 5 मिलीलीटर एल glutamine स्टॉक के 10 एमएल, 5 मिलीलीटर पेनिसिलीन: स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर, 5 2-मर्केप्टोइथेनाल की मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक मध्यम गैर आवश्यक अमीनो एसिड (सदस्य NEAA), और 3.5 μl। एक सप्ताह तक के लिए 4 सेल्सियस पर मीडिया रखें। आईएल -4 (20 एनजी / एमएल) और विरोधी CD40 (1.0 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ेंकेवल आवश्यक मीडिया की मात्रा करने के लिए।
  4. 2% एफसीएस-FACS बफर: 1x पीबीएस के 490 मिलीलीटर एफसीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. 2x ट्रिप्सिन-EDTA समाधान: 1x पीबीएस के 20 मिलीलीटर में 10x ट्रिप्सिन-EDTA के शेयर समाधान (5.0 जी ट्रिप्सिन, प्रति लीटर 2.0 छ EDTA) के 5 मिलीलीटर पतला। स्टोर ट्रिप्सिन-EDTA के 2x में 4 डिग्री सेल्सियस पर aliquots काम कर रहे। उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति दें।
  6. भ्रूण बछड़ा सीरम: अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 सी पर thawed एफसीएस रखें। Cytoplasmic धुंधला प्रक्रिया से पहले बर्फ 15 मिनट पर रखें।
  7. तटस्थ बफर formalin: एक 10 formalin% समाधान (3.7% paraformaldehyde के) तैयार करें। Formalin विषैला होता है और उपयुक्त पीपीई पहने हुए इसलिए एक प्रयोगशाला धूआं हुड के तहत इसे संभाल। एक रासायनिक भंडारण कैबिनेट में कमरे के तापमान पर स्टोर formalin।
  8. मेथनॉल: -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर निरपेक्ष मेथनॉल (100%) कोशिकाओं permeabilized होने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक। कि मेथनॉल ज्वलनशील है और एक उचित फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए ध्यान दें।

2।शोधन और बी कोशिकाओं की सक्रियता

  1. एक हौसले से काटा माउस तिल्ली से, धीरे से एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के सवार के साथ एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से अंग दबाकर एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करते हैं। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर 1x पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र इकट्ठा।
  2. 5 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका lysing बफर के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली छानना। 5 मिनट के लिए 300 XG पर 13.5 1x पीबीएस के मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज के साथ बेअसर।
  3. (वैकल्पिक) चुंबकीय निर्माता के निर्देशों के अनुसार एमएसीएस शुद्धि प्रोटोकॉल के बाद, मोती विरोधी CD45R (B220) का उपयोग बी कोशिकाओं -labeled अलग।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर आईएल -4 (20 एनजी / एमएल) और 5 दिनों के लिए विरोधी CD40 (1.0 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) युक्त गरम बी सेल उत्तेजना मीडिया में 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर शुद्ध बी कोशिकाओं को उत्तेजित। 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली (4 मिलीलीटर प्रत्येक) के दो कुओं में विभाजित संस्कृति के 8 मिलीलीटर के साथ शुरू करो।
  5. Cultu जाँचें1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर बनाए रखने के लिए दैनिक रहे हैं। अन्य कुओं में बंटवारे और ताजा आईएल -4 और विरोधी CD40 युक्त बी सेल उत्तेजना मीडिया के साथ संस्कृति गिराए द्वारा एकाग्रता को समायोजित करें।

3. trypsinization, फिक्सेशन, और Permeabilization

  1. Trypsinization
    1. 5 मिनट के लिए 300 XG पर, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेंट्रीफ्यूज संवर्धित कोशिकाओं के ऊपर से 1.0 10 x 7 लीजिए, और सतह पर तैरनेवाला छानना।
    2. सेल संग्रह मीडिया से अवशिष्ट प्रोटीन को हटाने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ धो लें। Centrifugation कदम दोहराएँ और सतह पर तैरनेवाला छानना।
    3. (लगभग 100 μl) decanting के बाद अवशिष्ट मात्रा में सेल गोली Resuspend।
    4. ध्यान से कोशिकाओं को कमरे के तापमान में 0.1% (2x) trypsin-EDTA के 800 μl जोड़ें। शंक्वाकार ट्यूब की ओर नीचे एक 45 डिग्री के कोण पर धीरे-धीरे बांटना।
    5. ट्यूब बंद करें और तरल ट्यूब 5-6 समय की लंबाई के साथ चलाता है ताकि ट्यूब झुकने से धीरे मिश्रणएस। एक रेशेदार, सफेद वेग समाधान में फार्म कर सकते हैं। एक मिनट के तहत करने के लिए trypsinization समय सीमा।
    6. ठंड एफसीएस के 1 मिलीलीटर के साथ trypsinization प्रतिक्रिया बुझाने। तुरंत ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़कर एफसीएस पतला।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र, फिर सतह पर तैरनेवाला छानना और बर्फ के लिए ट्यूबों वापसी।
  2. फिक्सेशन
    1. Decanting के बाद अवशिष्ट मात्रा में कोशिकाओं Resuspend। यदि आवश्यक हो, ठंड पीबीएस के साथ 100 μl करने के लिए खंड को ले आओ।
    2. एक धूआं हुड में, कोशिकाओं के लिए 10% तटस्थ बफर formalin समाधान के 800 μl जोड़ने के ऊपर और नीचे pipet और। ट्यूब formalin के अलावा पर गर्म होगा। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. Permeabilization
    1. एक सज्जन मिलाते गति से एक benchtop भंवर मिक्सर सेट करें।
    2. एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet में ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल के 9 मिलीलीटर ड्रा।
    3. भंवर मिक्सर से अधिक कोशिकाओं से युक्त ट्यूब पकड़ो और धीरे Shakin शुरूजी कोशिकाओं।
    4. ट्यूब अभी भी बहुत मिलाते है मेथनॉल लगातार मिश्रण है कि जबकि यह कोशिकाओं पर dropwise गिर जाता है ताकि ट्यूब को ठंड मेथनॉल जोड़ें। मेथनॉल के पहले 2 मिलीलीटर के बाद वितरण की गति एक धीमी स्ट्रीम करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
    5. 30 मिनट permeabilization के पूरा करने के लिए ट्यूब बर्फ पर बैठते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को एक महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

IgG1 और आईजीई वर्ग परिवर्तन के लिए 4. प्रतिदीप्ति धुंधला

  1. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 300 XG पर नमूना और मेथनॉल समाधान छानना। एक सफेद वेग कोशिकाओं के साथ गोली सकता है।
  2. 5 मिनट कोशिकाओं को धोने के लिए के लिए 300 XG पर कमरे पीबीएस 1x तापमान और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर जोड़ें। एक बार दोहराएँ। नोट: कमरे के तापमान पीबीएस के साथ गोली धोने कदम 4.1 के बाद फार्म का हो सकता है कि अतिरिक्त वेग घुल।
  3. 2% एफसीएस-FACS बफर के 10 एमएल के साथ एक अतिरिक्त धोने प्रदर्शन करते हैं।
  4. नीचे की थाली दौर एक 96 अच्छी तरह से करने के लिए नमूने वितरितऔर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना और बर्फ पर थाली रख दिया।
  5. निम्नलिखित एंटीबॉडी dilutions के साथ अच्छी तरह से प्रति 2% एफसीएस-FACS बफर के 60 μl में दाग: विरोधी आईजीएम RPE / Cy7, 1: 200, विरोधी IgG1 पीई, 1: 600, विरोधी आईजीई FITC, 1: 100, विरोधी CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
  6. धुंधला के 5 मिनट के बाद, 300 x जी पर 5 मिनट के लिए 2% एफसीएस-FACS बफर और अपकेंद्रित्र के 150 μl के साथ थाली धोने।
  7. एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में एक 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से 2% एफसीएस-FACS बफर और pipet के 400 μl में resuspend।

5. निम्नलिखित Gating रणनीति का उपयोग करें:

  1. FSC / एसएससी साजिश (चित्रा 1) पर स्थित नष्ट लिम्फोसाइट आबादी से CD45R (B220) सकारात्मक कोशिकाओं को अलग।
  2. B220 सकारात्मक कोशिकाओं से, इसी आबादी प्रकट करने के लिए आईजीई और IgG1 साजिश का उपयोग करें।

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Representative Results

यह प्रक्रिया सफलतापूर्वक माउस बी कोशिकाओं में आईजीई के लिए सीएसआर अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। पहले से 11 के रूप में वर्णित सीएसआर को मापने में दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, हम विरोधी CD40 और आईएल -4 के साथ माउस प्लीहा बी कोशिकाओं को प्रेरित किया। उत्तेजना के पांच दिनों के बाद, कोशिकाओं को एकत्र किया है और प्रोटोकॉल fluorescently लेबल आईजीएम, IgG1, आईजीई, और B220 (CD45R) एंटीबॉडी के साथ ऊपर वर्णित है और दाग का उपयोग संसाधित किया गया। (चित्रा 1), आईजीई + कोशिकाओं का एक स्पष्ट आबादी सफाई से ट्रिप्सिन उपचार (चित्रा 2A) बिना भेदभाव नहीं किया जा सकता नष्ट लिम्फोसाइटों पर Gated। हालांकि, निर्धारण और permeabilization के लिए पूर्व कोशिकाओं के trypsinization के कारण सतह बाध्य आईजीई को हटाने के लिए आईजीई उत्पादक कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) की जुदाई में सक्षम बनाता है।

चित्रा 1
चित्रा 1: Forwआईएल -4 और विरोधी CD40 के साथ संस्कृति में उत्तेजना के 5 दिनों के बाद माउस प्लीहा बी कोशिकाओं की ओर तितर बितर FACS के भूखंड बनाम एआरडी। नष्ट लिम्फोसाइटों कुल अधिग्रहीत की घटनाओं में 63% तक है।

चित्रा 2
चित्रा 2:। सक्रिय बी कोशिकाओं में आईजीई और IgG1 के cytoplasmic धुंधला पर trypsin के प्रभाव (क, ख) संस्कृति में सक्रियण के बाद 129 / बी -6 मिश्रित पृष्ठभूमि चूहों से प्लीहा बी कोशिकाओं को नष्ट करना पर gated FACS (ऊपर) भूखंडों और histograms (नीचे) विरोधी CD40 और आईएल -4 के साथ 5 दिनों के लिए। अकेले फिक्सेशन और मेथनॉल permeabilization (क) और trypsin (ख) के अलावा के साथ दिखाया जाता है।

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Discussion

विरोधी CD40 और आईएल -4 के साथ संस्कृति में माउस प्लीहा बी कोशिकाओं की उत्तेजना IgG1 और आईजीई से 5 टी सहायक टाइप 2 (टी एच 2) बातचीत, उत्साहवर्धक वर्ग स्विचिंग अनुकरण करेंगे। बी कोशिकाओं कुल splenocytes 12 या के रूप में शुद्ध प्लीहा बी कोशिकाओं 11 के संदर्भ में सीएसआर के लिए सक्रिय किया जा सकता है। प्रोटोकॉल (2.3 कदम) में उल्लेख किया, बी कोशिका संवर्धन वैकल्पिक है, और यह फायदेमंद होगा अगर निर्धारित करने के लिए प्रयोगकर्ता के विवेक पर है। CD45R (B220) का उपयोग बी कोशिकाओं की सकारात्मक चुंबकीय जुदाई मोती यहाँ उपयोग किया जाता है -labeled। जुदाई के बाद, यह बी सेल एकाग्रता उचित साइटोकाइन और एंटीबॉडी उत्तेजना के लिए 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए समायोजित किया जा सकता है, ताकि FACS द्वारा सेल शुद्धता की जांच करने के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा यह फ्रीज / पिघलना चक्र आया है कि आईएल -4 प्रोटीन गतिविधि में कमी आई है हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

पूर्व निर्धारण और permeabilization के लिए कोशिकाओं की trypsinization accur के लिए अनुमति देता है(चित्रा 2) फ्लो के माध्यम से वर्ग परिवर्तन की माप खा लिया। कोशिकाओं के समुचित trypsinization इस प्रक्रिया के सफल आवेदन करने के लिए महत्वपूर्ण है। एफसीएस trypsin बाधित कर सकते हैं के रूप में, एक 1x पीबीएस धोने से पहले trypsinization के कदम के लिए किया जाता है। हम कमरे के तापमान पर एक 30 सेकंड ऊष्मायन पूरा पाचन के लिए पर्याप्त है पाया। अब durations काफ़ी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं।

विश्लेषण करने से पहले, यह निशान मेथनॉल दूर करने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कई बार धोने के लिए आवश्यक है। मेथनॉल भार 13 बाध्यकारी एंटीबॉडी को बदल सकता है और नीचे की ओर प्रवाह cytometric विश्लेषण 14 में इस्तेमाल किया एफसीएस से प्रोटीन तेज़ कर सकते हैं। इस संबंध में अन्य permeabilization के तरीकों (यानी सैपोनिन) मेथनॉल का उपयोग करने के लिए एक विकल्प हो सकता है। मेथनॉल डिटर्जेंट झिल्ली अखंडता 15 को बाधित करते हैं, झिल्ली लिपिड घुल कि एक कार्बनिक विलायक है। मेथनॉल permeabilization के लिए एक लाभ विस्तारित भंडारण की क्षमता है-20 में सी 14 ° तय कोशिकाओं की।

इस प्रक्रिया का उपयोग करते समय मन में रखने के लिए कुछ सीमाएं हैं। Cleaves प्रोटीन अवशेषों trypsin है, क्योंकि कुछ FACS के दाग को इलाज के बाद अलग-अलग दिखाई दे सकते हैं, या पूरी तरह epitopes को लक्षित करने के लिए बाध्य करने की क्षमता खो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, ट्रिप्सिन उपचार के बाद सेल संख्या में नुकसान हो सकता है। हम अलग-अलग हाइब्रिडोमा क्लोन 11 के एंटीबॉडी स्राव को मापने से एकत्र वर्ग स्विचिंग डेटा के लिए स्पष्ट रूप से तुलनीय होने के लिए इस विधि मिल गया है लेकिन, जैसा कि इस आईजीई सीएसआर माप की सटीकता को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है।

अन्य तरीकों आईजीई उत्पादक माउस बी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सूचित किया गया है। 18 - एक विधि कोशिकाओं 16 आईजीई व्यक्त पर झिल्ली ही सीमित आईजीई के लिए धुंधला करने के लिए रिसेप्टर के लिए बाध्य आईजीई पूर्व दूर करने के लिए एक एसिड धोने की प्रक्रिया का उपयोग करता है। एक अन्य विधि सेल permeabiliz से पहले सभी सतह आईजीई ब्लॉक करने के लिए एक मोनोक्लोनल विरोधी IgE एंटीबॉडी का उपयोग करता हैआईजीई व्यक्त कोशिकाओं 19 के intracellular आईजीई के लिए व्यावहारिक और धुंधला। इसके अलावा, हाल ही में एक अध्ययन आईजीएम + आईजीडी + आईजीजी + और ​​आईजी ऐ + बी सेल सबसेट 20 को छोड़कर द्वारा मनुष्यों में आईजीई बंद बी सेल आबादी की पहचान करने के लिए एक आठ रंग FACS के पैनल profiled। इन अन्य तरीकों की तुलना में, यहाँ वर्णित विधि एसिड washes के denaturing के उपयोग से बचा जाता है, और अतिरिक्त एंटीबॉडी आवश्यक नहीं हैं।

इस प्रक्रिया के लिए एक और लाभ यह है आईजीई के लिए सीएसआर की माप के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लिख नहीं करता है। वैकल्पिक विरोधी आईजीई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी केवल अंतर्जात आईजीई अणुओं का पता लगाने के लिए दिखाया गया है। हाइब्रिडोमा क्लोन R1E4, नहीं cytophilic आईजीई CD23 21,22 करने के लिए बाध्य केवल अंतर्जात सतह अणुओं के लिए विशिष्ट एक चूहे-विरोधी माउस मोनोक्लोनल IgE एंटीबॉडी पैदा करता है, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। यह आम प्रयोगशाला reage का उपयोग करता है, क्योंकि ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल सुविधाजनक और किफायती हैएनटीएस। संभावना यहां इस्तेमाल विरोधी IgE एंटीबॉडी रिसेप्टर के लिए बाध्य होने के कारण cytophilic आईजीई को आईजीई संकेत इलाज के बाद कम हो जाता है, क्योंकि ट्रिप्सिन की मध्यस्थता दरार के प्रति संवेदनशील एक साइट पर आईजीई (चित्रा 2) को बांधता है। इस प्रोटोकॉल को क्रियान्वित करने के शोधकर्ताओं ने प्रयोगों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्लोन की एक सीमा से चयन करने की स्वतंत्रता है हालांकि। इसके अलावा, कोशिका की सतह प्रोटीन को हटाने के लिए trypsin का उपयोग करने की अवधारणा FACS विश्लेषण द्वारा अन्य सेल मार्कर का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Acknowledgments

DRW एनआईएच अनुदान AI089972 और AI113217, द्वारा और mucosal इम्यूनोलॉजी अध्ययन दल द्वारा समर्थित है, और बरोज़ वेलकम कोष से चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए एक कैरियर पुरस्कार रखती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse IgE FITC BD Pharmingen 553415 clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE BD Pharmingen 550083 clone A85-1
Methanol BDH BDH1135-4LP Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon Corning 352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon Corning 352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-4052-82 clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40 eBioscience 16-0402-85 clone HM40-3
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
HEPES (1M) Gibco 15630-080
MEM-NEAA (100x) Gibco 11140-050
Phosphate Buffered Saline (10x) Lifetechnologies (Corning) 46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads  Miltenyi Biotec 130-049-501
MACS purification column Miltenyi Biotec 130-042-401
IL-4 PeproTech 214-14 Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma Aldrich T4174-100 ml 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P0781-100 ml 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)
L-Glutamine 200 mM Sigma Aldrich G7513
2-mercaptoethanol (99%) Sigma Aldrich M6250-100 ml
Red cell lysis buffer Sigma Aldrich R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 SouthernBiotech 1140-17 clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum Thermo SH30910.03
B cell Stimulation media B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine,  1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml)

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References

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Gallagher, M. P., Shrestha, A.,… More

Gallagher, M. P., Shrestha, A., Magee, J. M., Wesemann, D. R. Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells. J. Vis. Exp. (94), e52264, doi:10.3791/52264 (2014).

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