Abstract
B-lymfocytt-immunoglobulin-tung kjede (avIgH) klasse bryter rekombinasjon (CSR) er en fremgangsmåte hvor utgangspunktet uttrykt IgM bytter til andre igh isotyper, så som IgA, IgE og IgG. Måling av in vitro avIgH CSR er en viktig metode for studiet av en rekke biologiske prosesser som strekker seg fra DNA-rekombinasjon og reparasjon for aspekter av molekylær og cellulær immunologi. In vitro CSR-analysen involverer strømningscytometrisk måling overflate Ig-ekspresjon på aktiverte B-celler. Selv om måling av IgA og IgG subklasser er enkel, er måling av IgE ved denne metode problematisk på grunn av oppløselig IgE-binding til FcεRII / CD23 uttrykkes på overflaten av aktiverte B-celler. Her beskriver vi en unik fremgangsmåte for nøyaktig måling av IgE-produserende mus-B-celler som har gjennomgått CSR i kultur. Metoden er basert på trypsin-formidlet kløyving av IgE-CD23 komplekser på celleoverflater, noe som åpner for deteksjon av IgE-produserende B-celler ved avstamning cytoplasmic farging. Denne prosedyren gir en praktisk løsning for flowcytometrisk analyse av CSR til IgE.
Introduction
Under immunoglobulin tung kjede (avIgH) klasse bryter rekombinasjon (CSR) i mus og mennesker, μ Igh konstant område eksoner (Cμ) slettes og erstattes med en av flere sett med nedstrøms konstant område eksoner (C H r) (f.eks Cγ, Cε, og Cα), noe som resulterer i en bryter fra produksjonen av IgM til produksjon av andre Ig-klasser (for eksempel IgG, IgE, IgA eller). CSR skjer innen switch (S) regioner, som er 1-10 kb sekvenser lokalisert 5 'til hvert sett med C H s 1. Aktiverings-Induced cytidindeaminase (AID) enzym initierer CSR via cytidine deaminering aktivitet.
IgE er en viktig formidler av allergisk sykdom to og en større forståelse av hvordan IgE produseres og regulert kan åpne dører til nye terapeutiske tilnærminger til atopisk sykdom. Hos mus og mennesker, er IgE den mest strengt regulert Ig isotypen. IgE er normalt oppdages på nivåer tusenvis av times mindre enn andre avIgH isotyper tre, men kan være sterkt forhøyet i sykdomstilstander 4. Imidlertid er CSR til IgE ufullstendig forstått. In vitro-aktivering av B-celler ved hjelp av IL-4 i kombinasjon med enten anti-CD40 eller LPS induserer CSR til både lgG1 og IgE 5. Aktiverte B-celler uttrykker den lave affinitet IgE reseptor FcεRII / CD23 2,6, som binder løselig IgE utskilles i kultur etter CSR. Derfor når analysere med flowcytometri, B-celler med reseptor-bundet IgE flekken på samme måte som B-celler endogent uttrykker IgE 7. Mens det er kjent at mus B celler uttrykker den lave affinitet IgG reseptor FcγRIIB1 (CD32) 8, i vår erfaring det ser ikke ut til å forstyrre måling av klassen bytte til IgG1. Imidlertid, når man måler IgE veksling etter at B-celleaktivering i kultur, kan ikke-spesifikk overflate-bundet IgE tilsløre analysen. Med vanlige fargemetoder, ikke-IgE-uttrykker celler flekken positivt for IgE.
Skissert her er en strategi som har vært benyttet til å gjennomføre samfunnsansvar analyser og oppdage ekte IgE-uttrykke B-celler fra mus 9-11. Behandling av aktiverte B-celler med trypsin, til en felles lab reagens fordøye protein, fjerner både cytophylic og membranbundet overflate IgE. Påfølgende permeabilization og farging for cytoplasmic IgE avslører dermed den sanne IgE-produserende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle forsøkene beskrevet her var i samsvar med The Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer og godkjent av Forsøksdyrbarnesykehus (ARCH), Boston, Mass.
1. Utarbeidelse av reagenser
- 1,000x IL-4 Lager: Fortynn cytokin IL-4 til 20 pg / ml i H2O eller 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Dispensere i 200 ul porsjoner til 1,5 ml mikrosentrifugerør og butikk ved -20 ° C.
- 1,000x anti-CD40: Skaff fra produsenten på 1,0 mg / ml, oppbevares ved 4 ° C.
- B-cellestimuleringsmiddel: Til 425 ml av RPMI-1640-medium, tilsett 75 ml nylig tint føtalt kalveserum (FCS), 10 ml av 1,0 M HEPES-buffer, 5 ml L-glutamin lager, 5 ml Penicillin: streptomycin lager, 5 ml Minimum Essential Medium Ikke-essensielle aminosyrer (MEM-NEAA), og 3,5 pl 2-mercaptoethanol. Holde media ved 4 ˚C i opptil en uke. Legg IL-4 (20 ng / ml) og anti-CD40 (1,0 ug / ml) umiddelbart før brukBare volumet av mediet som kreves.
- 2% FCS-FACS-buffer: til 10 ml av FCS til 490 ml av 1 x PBS. Hold ved 4 ° C.
- 2x trypsin-EDTA-oppløsning: Fortynn 5 ml av 10x trypsin-EDTA-stamløsning (5,0 g trypsin, 2,0 g EDTA pr liter) i 20 ml av 1 x PBS. Butikk trypsin-EDTA i 2x arbeider porsjoner ved 4 ° C. Tillat blandingen å oppvarmes til romtemperatur før bruk.
- Føtalt kalveserum: Hold tinte FCS ved 4 ˚C i opptil to uker. Plasser på is 15 min før cytoplasmatisk fargeprosedyre.
- Nøytral-bufret formalin: Forbered en 10% formalinløsning (3,7% paraformaldehyde). Formalin er giftig og derfor håndtere den under et laboratorium avtrekkshette mens iført egnet verneutstyr. Butikk formalin ved romtemperatur i en kjemisk lagringskabinett.
- Metanol: Lagres absolutt metanol (100%) ved -20 ° C inntil cellene er klare til å bli permeabilisert. Merk at metanol er brannfarlig og bør oppbevares i egnet fryser.
2.Rensing og aktivering av B-celler
- Fra en fersk høstet mus milt, utarbeide en enkelt celle suspensjon ved å trykke forsiktig organ gjennom en 70 mikrometer celle sil med stempelet av en 3 ml sprøyte. I et 15 ml konisk sentrifugerør, samle cellene i 10 ml av 1 x PBS og sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml av røde blodcellelyseringsbuffer i 5 min. Nøytraliser med 13,5 ml av 1 x PBS og sentrifugering ved 300 xg i 5 min.
- (Valgfritt) Magnetisk skille B-celler ved hjelp av anti-CD45R (B220) -merket perler, etter MACS rensing protokollen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Stimulere rensede B-celler ved 1,0 x 10 6 celler / ml i B-cellestimulering varmet medium inneholdende IL-4 (20 ng / ml) og anti-CD40 (1,0 ug / ml) i 5 dager ved 37 ° C. Starte med 8 ml av kulturen oppdelt i to brønner i en 6-brønners kulturplate (4 ml hver).
- Sjekk Culture daglig for å opprettholde på 1,0 x 10 6 celler / ml. Juster konsentrasjon ved å dele inn i andre brønner, og fortynning av kulturen med B-cellestimulering media inneholdende friskt IL-4 og anti-CD40.
3. trypsinering, Fiksering, og Permeabilization
- Trypsinering
- Samle opp til 1,0 x 10 7 av dyrkede celler i et 15 ml konisk rør, sentrifuger ved 300 xg i 5 min, og dekanter supernatanten.
- Vask med 10 ml PBS for å fjerne den gjenværende protein fra cellesamlingen media. Gjenta sentrifugeringstrinnet, og dekanter supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i restvolumet etter dekantering (ca. 100 ul).
- Tilsett forsiktig 800 ul romtemperatur 0,1% (2x) trypsin-EDTA til cellene. Dispensere sakte i en 45 ° vinkel ned på siden av den koniske rør.
- Lukke røret og bland forsiktig ved å vippe røret slik at væsken løper langs lengden av røret 5-6 tidens. En trevlet, hvitt bunnfall kan dannes i oppløsningen. Begrens trypsinization tid til under en min.
- Stans trypsinisering omsetning med 1 ml kald FCS. Fortynn FCS umiddelbart ved tilsetning av 10 ml kald PBS.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og deretter dekantere supernatanten og tilbake rørene på is.
- Fiksering
- Resuspender cellene i det gjenværende volum etter dekantering. Om nødvendig, ta med volum opp til 100 ml med kald PBS.
- I et avtrekksskap, tilsett 800 ul av 10% nøytral bufret formalin løsning til cellene og pipetter opp og ned. Røret vil varme ved tilsetning av formalin. Inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Permeabilization
- Sett opp en benkeplate Bøk vortex mikser på en forsiktig risting hastighet.
- Tegn 9 ml kald (-20 ° C) metanol i en 10 ml serologisk pipette.
- Hold i rør inneholdende cellene over vortex-blander og forsiktig starte shaking cellene.
- Legg kald metanol til røret slik at det faller dråpevis til cellene, mens røret fortsatt risting, slik at metanolen kontinuerlig blanding. Etter de første 2 ml metanol dispenseringshastigheten kan økes til en langsom strøm.
- La røret sitter på is i 30 minutter for å fullføre permeabilization. Alternativt kan cellene bli lagret ved -20 ° C i opp til en måned.
4. fluorescensbeising for IgG1 og IgE klasse Switching
- Sentrifuger prøven ved 300 xg i 5 min og dekanter metanoloppløsning. Et hvitt bunnfall kan pellet med cellene.
- Tilsett 10 ml romtemperatur 1 x PBS og sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter for å vaske cellene. Gjenta en gang. Merk: Vask av pellet med romtemperatur PBS oppløser ekstra bunnfall som kan danne etter trinn 4.1.
- Utføre en ekstra vasking med 10 ml 2% FCS-FACS-buffer.
- Fordele prøvene i en 96-brønns rundbunnet plateog sentrifuger ved 300 xg i 5 min. Dekanter supernatanten og sette platen på is.
- Flekken i 60 ul av 2% FCS-FACS-buffer per brønn med følgende fortynninger antistoff: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, Anti-lgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE-FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Etter 5 min for farging, platen vaskes med 150 ul av 2% FCS-FACS-buffer og sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Resuspender i 400 ul av 2% FCS-FACS-buffer og pipette gjennom et 40 um nyloncellefilter inn i en 5 ml FACS-rør.
5. Bruk følgende gating Strategi:
- Isolere CD45R (B220) positive celler fra sprengnings lymfocyttpopulasjonen ligger på FSC / SSC tomten (figur 1).
- Fra B220 positive celler, bruker IgE og IgG1 tomten for å avdekke de tilsvarende populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne prosedyren har blitt implementert for å studere CSR til IgE i mus B-celler. For å demonstrere effektiviteten ved måling av CSR, vi stimulert muse milt-B-celler med anti-CD40 og IL-4 som beskrevet tidligere 11. Etter fem dager etter stimulering ble cellene innsamlet og prosessert ved å bruke den protokoll som er beskrevet ovenfor, og farget med fluorescens-merket IgM, IgG1, IgE, og B220 (CD45R) antistoffer. Lukket på sprengnings lymfocytter (figur 1), en klar populasjon av IgE + celler kan ikke rent diskrimineres uten trypsin-behandling (figur 2a). Imidlertid trypsinisering av cellene før fiksering og permeabilization muliggjør separasjon av IgE-produserende celler (figur 2b) på grunn av fjerning av overflate-bundet IgE.
Figur 1: Videres.valgard vs. side scatter FACS tomt på musemilt B-celler etter fem dager med stimulering i kultur med IL-4 og anti-CD40. Sprengning lymfocytter utgjør 63% av de totale ervervet hendelser.
Fig. 2: Effekt av trypsin på cytoplasmisk farging av IgE og IgG1 på aktiverte B-celler (a, b) FACS-plott (ovenfor) og histogrammer (nedenfor) separert på sprengnings milt-B-celler fra 129 / B6 blandet bakgrunn mus etter aktivering i kultur i 5 dager med anti-CD40 og IL-4. Fiksering og metanol permeabilization alene (a) og med tilsetning av trypsin (b) er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stimulering av mus splenic B-celler i kultur med anti-CD40 og IL-4 vil simulere T helper type 2 (T H 2) interaksjoner, oppmuntrende klasse veksling til IgG1 og IgE 5. B-celler kan aktiveres for CSR i sammenheng med totale splenocytes 12 eller som rene milt B-celler 11. Som nevnt i protokollen (trinn 2.3), er B-celle berikelse valgfritt, og er på skjønn av eksperimentator å fastslå om det ville gunstig. Positive magnetisk separasjon av B-celler ved hjelp av CD45R (B220) -merket perler anvendes her. Etter separering, er det anbefalt å kontrollere celle renhet ved FACS, slik at B-celle-konsentrasjonen kan justeres til 1,0 x 10 6 celler / ml for riktig cytokin antistoff og stimulering. Også det skal bemerkes at IL-4-protein som har gjennomgått en fryse / tine-sykluser kan ha redusert aktivitet.
Trypsinisering av cellene før fiksering og permeabilization tillater accurspiste måling av klasse veksling via flowcytometri (figur 2). Riktig trypsinization av cellene er avgjørende for vellykket bruk av denne prosedyren. Som FCS kan inhibere trypsin, er en 1 x PBS vaske utføres før trypsinering trinn. Vi fant en 30 sek inkubasjon ved romtemperatur er tilstrekkelig for fullstendig nedbrytning. Lengre varigheter kan merkbart påvirke cellenes levedyktighet.
Før analyse, er det viktig å vaske cellene flere ganger med PBS for å fjerne spor metanol. Metanol carry kan endre antistoffbinding 13 og kan utløse proteiner fra FCS brukes i nedstrøms flowcytometrisk analyse 14. I dette henseende kan andre permeabilization metoder (dvs. saponin) være et alternativ til anvendelse av metanol. Metanol er et organisk oppløsningsmiddel som løser membranlipider, mens vaskemidler forstyrre membranintegritet 15. En fordel til metanol permeabilization er muligheten for utvidet lagringav faste celler ved -20 ° C 14.
Det er noen begrensninger du bør huske på når du bruker denne fremgangsmåten. Fordi trypsin spalter proteinrester, kan enkelte FACS flekker vises annerledes etter behandling, eller kan miste evnen til å binde å målrette epitoper helt. I tillegg kan et tap i celle nummer etter trypsinbehandling oppstå. Men dette betyr ikke ut til å påvirke nøyaktigheten av IgE CSR målinger som vi har funnet denne metoden til å være klart sammenlignes med klasse veksling data samlet inn fra måle antistoff sekret av individuelle hybridomkloner 11.
Andre fremgangsmåter er blitt rapportert å påvise IgE-produserende mus-B-celler. En fremgangsmåte benytter en syrevaskeprosedyren for å fjerne reseptor-bundet IgE før farging for membran-bundet IgE på IgE-uttrykkende celler 16-18. En annen metode som bruker et monoklonalt anti-IgE antistoff for å blokkere all overflaten IgE før celle permeabilizasjon og farging for intracellulær IgE av IgE-uttrykker celler 19. Videre, en fersk studie profilert en åtte-farge FACS panel for å identifisere IgE-svitsjede B-celle populasjoner hos mennesker ved å ekskludere IgM +, IgD +, IgG + og IgA + B-celle undergrupper 20. Sammenlignet med disse andre metoder, fremgangsmåten beskrevet her unngår bruk av denaturerende syrevaskinger, og overskytende antistoffer er ikke nødvendig.
En fordel med denne prosedyren er at det ikke fore spesifikke monoklonale antistoff for måling av CSR til IgE. Alternative anti-IgE-monoklonale antistoffer er blitt vist å detektere bare endogene IgE-molekyler. Den hybridomklon R1E4 produserer en rotte-anti-mus IgE monoklonalt antistoff som er spesifikt bare for endogene overflatemolekyler, ikke cytophilic IgE bundet til CD23 21,22, men er ikke kommersielt tilgjengelige. Protokollen er beskrevet ovenfor er praktisk og økonomisk fordi den bruker vanlig lab reagents. Den anti-IgE antistoff som brukes her sannsynlig binder til reseptor-bundet IgE ved et sete følsomme for trypsin-formidlet kløyving, fordi IgE-signalet på grunn av cytophilic IgE reduseres etter behandling (figur 2). Men forskerne som utfører denne protokollen har frihet til å velge mellom en rekke kommersielt tilgjengelige kloner for eksperimenter. Dessuten kan konseptet med å bruke trypsin for å fjerne celleoverflateproteiner bli utvidet til påvisning av andre cellemarkører ved FACS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW støttes av NIH tilskudd AI089972 og AI113217, og ved Mucosal Immunologi Studier Team, og har en karriere Award for Medisinsk Forskere fra Burroughs Wellcome Fondet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
