חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

סיכום

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

תקציר

פריונים הם חלקיקים חלבונים לא קונבנציונליים המתפשטים בעצמם, נטולי כל חומצת גרעין מקודדת. זרעים חלבונים אלה משמשים כתבניות להמרה ושכפול של האיזופורם התאי השפיר שלהם. עדויות מצטברות מצביעות על כך שאגרגטים רבים של חלבונים יכולים לשמש כתבניות המתפשטות מעצמן ולהשחית את הקיפול של חלבונים קוגניטיביים. למרות שאגרגטים יכולים להיות פונקציונליים בנסיבות מסוימות, תהליך זה מוביל לעתים קרובות לשיבוש של הומאוסטזיס החלבון התאי (פרוטאוסטזיס), מה שמוביל בסופו של דבר למחלות הרסניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), או אנצפלופתיה ספוגית מועברת (TSEs). המנגנונים המדויקים של התפשטות פריונים והתפשטות תא לתא של אגרגטים חלבונים הם עדיין נושא למחקר אינטנסיבי. כדי לקדם את הידע הזה, הוקם לאחרונה מודל מטזואן חדש ב-Caenorhabditis elegans, לביטוי תחום הפריון של חלבון פריון השמרים הציטוזולי Sup35. מודל פריון זה מציע מספר יתרונות, מכיוון שהוא מאפשר ניטור ישיר של תחום הפריון המתויג פלואורסצנטי בבעלי חיים וקלות של גישות גנטיות. מתוארות כאן שיטות לחקר התנהגות דמוית פריונים של אגרגטים חלבונים ולזיהוי משנים של רעילות הנגרמת על ידי פריונים באמצעות C. elegans.

מבוא

מחלות רבות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון (PD) (AD), טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וencephalopathies transmissible spongiform (TSEs), המשויכות חלבוני צבירה מועדת ומכאן ידועות קולקטיבי חלבון misfolding הפרעות (PMDs ). TSEs או מחלות פריון מהוות מעמד ייחודי של PMDs בכך שהם יכולים להיות זיהומיות, באדם ובעלי החיים ^1. ברמה המולקולרית, פריונים לשכפל על ידי גיוס והמרת PRP monomeric α-helix-עשיר בקידוד המארח הסלולרי (PRP ^C) לקונפורמציה PRP ^Sc β גיליון העשיר פתולוגי ^2,3. אגרגטים חלבון עצמי הפצת גם זוהו בפטריות, אשר חולקות מאפיינים חשובים עם פריונים יונקים ^4,5. בנוסף, פ....

פרוטוקול

1. ניטור Transcellular הפצת של חלבונים כמו פריון-ידי in vivo זמן לשגות הדמיה

הערה: לגדול ג elegans wild-type (WT) (N2) וקווים מהונדסים על פי שיטות סטנדרטיים ולשלוט בזהירות את טמפרטורת טיפוח ^47.

1. צור קווים מהונדסים של ג elegans המבטא את החלבון כמו פריון-, מתויג עם חלבון monomeric אדום ניאון (mRFP). צפה בסרטון זה שמדגים כיצד להשתמש microinjection ^48. לפרטים נוספים ושיטות המתארים כיצד לשלב קווי extrachromosomal אלה, ראו ^4....

תוצאות

ניטור אינטר הפצה של חלבונים כמו פריון-ידי in vivo הדמיה הזמן לשגות

המהונדס C. קווי elegans להביע תחום הפריון הם גם מתאימים במיוחד לניתוח של היבטים מסוימים של חלבונים כמו פריון-, למשל, העברת תא אל התא ורעילות אוטונומית מסוג תאים לא. השקיפות של בעלי החיים מאפשר מעקב של fluorescently מתויגת חלבונים מתוך אורגניזם החי בכל שלב של חיים. מנצל את זה, תנועה של חלבונים כמ.......

דיון

השיטות שתוארו כאן לעזור כדי להמחיש מתפשטים ורעילות אוטונומית תא התא המורכב אוטונומית ולא של חלבונים כמו פריון. לאחרונה גילינו שתחום פריון cytosolic צבירה מועדת הוא נלקח לתוך שלפוחית ​​קרום הנכנס בתהליך autophagy קשור. תת-קבוצה מסוימת של שלפוחית ​​אלה משלוחי תחום הפריון בתוך ובין תאים ורקמות ^40. המפתח כדי לפקח על התנועה שלהם בחי הוא שהחלבון צריך להיות מתויג עם mRFP, כי רק חלבונים מתויגים mRFP נראו בשלפוחית ​​כנראה חומצי אלה. שימוש באותה הגישה, אנחנו כרגע חוקרים את כמו פר.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תקני גודל ריאגנט
ננוספרה 100 ננומטר	ThermoScientific	3100A
Levamisole	Sigma	L-9756
IPTG	Sigma	15502-10G
ספריית AHRINGER RNAi	מקור BioScience LifeSciences		http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR צנטריפוגה מקוררת, 120VAC	ThermoScientific	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
משכפל 96 פינים	Scionomix		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro שייקר דגירה בעל קיבולת גבוהה	Digilab		http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Titertrek		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96	בקמן קולטר		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
שייקר Innova44	ניו ברונסוויק		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& פעולה=מוצרים& contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	Leica		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10Bמצלמת CCD מלאכותית	Hamamatsu		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
מסתובב דיסק AF מיקרוסקופ קונפוקלי	מצלמת Leica		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
תוכנה
MetaMorph מיקרוסקופיה אוטומציה & תוכנה לניתוח תמונות		מולקולריים	http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI תוכנת ניתוח תמונה	Meyer Instruments		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
תוסף ImageJ	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck עבור ImageJ			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans זנים
N2 (WT)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                                                                      rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]		מורימוטו	זמינה במעבדה שלנו
ראה טבלה 1 למקור לחיישנים מתקפלים וזני

תחנת עבודה אוטומטית מכשירים מעבדת מדווח מתח