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Medicine

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52343
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l'activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité.

Abstract

Tissus tumoraux rigides ont été fortement impliqué dans la régulation de la migration cellulaire et l'invasion du cancer. La migration invasive à travers les tissus réticulés est facilitée par des saillies d'actine riches appelés invadopodes qui dégradent protéolytique la matrice extracellulaire (ECM). invadopodes activité a été démontré que la rigidité dépendante de l'ECM et des cellules cancéreuses ce qui suggère que les forces de contraction des signaux de rigidité peuvent réguler ces structures sous-cellulaires à travers actomyosine contractilité. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Bien qu'il existe quelques différences entre les deux essais, le protocole présenté ici fournit un procédé pour créer FQA eà peut être utilisé dans les deux essais et sont facilement adaptables aux besoins biologiques et techniques spécifiques de l'utilisateur.

Introduction

La rigidité de l'ECM associé à une tumeur a été identifiée comme un facteur important dans la conduite de comportement malin en augmentant la contractilité actomyosine 1-3. Bien que cet effet a principalement été mise en évidence avec des cellules de cancer du sein, de la matrice de rigidité se est avérée modifier les propriétés invasives de cellules dérivées d'une variété de cancers 08.04 suggérant que la rigidité de la tumeur peut jouer un rôle dans d'autres types de cancers. Pour pénétrer les tissus réticulés pendant la migration invasive, les cellules cancéreuses utilisent saillies adhésives actine riches appelés invadopodes que localiser protéases pour dégrader focalement l'ECM neuf. Invadopodes sont considérées comme une caractéristique de cellules invasives et ont été impliqués dans l'invasion des cellules tumorales et des métastases 10,11. Des travaux antérieurs ont montré que la matrice de rigidité peut réguler numéros de invadopodes et la dégradation de l'ECM 4,12 associée par l'activité myosine II et protéines mécanosensibles 12. Compte tenu ducorrélation entre la densité de la tumeur et l'agressivité du cancer 13,14, ces résultats suggèrent un mécanisme par lequel les cellules cancéreuses peuvent répondre aux tissus tumoraux rigides à conduire invasion et métastases travers contractilité actomyosin.

Il a été démontré in vitro ECM rigidité et de la densité des tissus in vivo pour réglementer le comportement invasif des cellules cancéreuses 1,15-17. Alors que actomyosine contractilité semble être important dans ce processus, les études actuelles conflit quant à savoir si la capacité métastatique est corrélée à une augmentation ou diminution de forces contractiles 6,18-20. En outre, il ne sait pas si ces forces médiation directement l'activité de invadopodes 21. Nous avons récemment découvert que les forces de contraction des cellules cancéreuses étaient dépendants de la rigidité et la matrice étaient prédictifs de dégradation ECM par invadopodes 5. Ces résultats suggèrent que les forces cellulaires peuvent jouer un rôle important dans la progression du cancer par la médiation invadopodes activité en réponse aux propriétés mécaniques du micro-environnement de la tumeur.

Afin de corréler propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses 5, nous avons modifié un protocole pour la création de PAA avec différentes rigidités qui a été précédemment utilisés pour enquêter sur les activités de invadopodes rigidité dépendante 4,12,22. Par réticulation chimique de la fibronectine de plasma humain à travers le FQA, ces hydrogels modifiés peuvent être utilisés comme base pour les deux dosages invadopodes et des forces de traction afin de se assurer que les cellules ont subi les mêmes rigidités dans les deux expériences 5. Dans les dosages de invadopodes, la fibronectine fournit un domaine de liaison naturel pour la gélatine pour lier l'ECM superposée à l'AAP pour détecter la dégradation de la matrice. Dans les essais de la force de traction, la fibronectine fournit un ligand pour l'adhésion cellulaire direct à détecter des déplacements de microsphères utilisées dans le calcul des forces de traction cellulaires. Cette méthode aboutit à ce que nous avons appelé doux, dur,AAP et rigides qui sont liés à des plats à fond de verre et ont des modules élastiques, E, de 1023, 7307, et 22 692 Pa 5 qui couvrent la gamme de propriétés mécaniques rapportés pour les tissus normaux et cancéreux 23.

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Protocol

1. Préparation de verre Lamelles pour AAP

  1. Nettoyer les lamelles de 12 mm avec des lingettes charpie faibles.
  2. Flamme les lamelles de 12 mm et le 14 mm lamelle dans la cupule de chaque verre plat en bas de 35 mm en les faisant passer à travers une flamme du brûleur Bunsen l'aide de pinces.
  3. Traiter les micropuits avec 200 ul de NaOH 0,1 N pendant 5 min à température ambiante.
  4. Aspirer et l'air sec les puits pendant 30 min.
  5. Traiter les micropuits avec 50 à 100 pl de 3-aminopropyltriméthoxysilane pendant 10 min à température ambiante dans la hotte. Ce produit chimique réagit avec du plastique; par conséquent, utiliser des pipettes en verre et ne remplissez pas complètement les puits pour éviter tout contact avec le plat en plastique.
  6. Laver les puits avec de l'eau ultra pure pendant environ 10 min jusqu'à ce que le 3-aminopropyltriméthoxysilane devient clair.
  7. Rincer les puits avec de l'eau ultra pure deux fois en utilisant un flacon souple.
  8. Laver les puits avec 2 ml d'eau ultra-pure d'unt la température ambiante sur une bascule réglé à une vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 10 min.
  9. Aspirer et l'air sec les puits pendant 30 min.
  10. Traiter les micropuits avec 2 ml de solution de glutaraldéhyde à 0,5% à température ambiante sur un agitateur réglé à une vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 30 min.
  11. Laver les micropuits avec 2 ml d'eau ultra pure à la température ambiante sur une bascule fixé à vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 10 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 30 min.
  12. Micropuits sécher à un angle raide (60 ° ou plus) pendant 30 min.
    Remarque: Les plats peuvent être stockés pendant deux mois dans un dessiccateur.

2. Préparation des AAP pour invadopodes dosages

  1. Pour une solution de l'AAP douce (8% d'acrylamide et 0,05% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d'acrylamide, 25 ul de 2% BIS, et 574 pi d'eau ultra-pure (tableau 1).
  2. Pour une solution de l'AAP dur (8% d'acrylamide et 0,35% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d'acrylamide, 175 & #181; l de 2% BIS, et 409 pi d'eau ultra pure (tableau 1).
  3. Pour une solution de PAA-rigide (12% d'acrylamide et 0,60% BIS) 1 ml, mélanger 300 pi de 40% d'acrylamide, 300 ul de 2% BIS et 169 pi d'eau ultra pure (tableau 1).
  4. Dégazer la solution pendant 15 min. Ajouter 200, 215, et 230 ul de 1 mg / ml de fibronectine de plasma humain dans de l'eau ultra-pure aux solutions de PAA tendres, dures et rigides, respectivement. Pour toutes les solutions, ajouter 1 pl de 10 mg / ml d'acide acrylique de N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, 5 ul de 100 mg / ml de persulfate d'ammonium et 2 ul de N, N, N ', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED ; Tableau 1). Mélanger avec pipetage doux et éviter de créer des bulles dans les solutions.

AAP
(1 ml) 		40%
AA
(Ul) 		2%
(Ul) 		Ultrapure
Eau
(Ul) 		1 mg / ml
FN
(Ul) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Ul) 		100 mg / ml
APS
(Ul)
TEMED
(Ul) 		Élastique
Module
(Pa)
Doux 200 25 574 200 1 5 2 1023
Dur 200 175 409 215 1 5 2 7307
Rigide 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tableau 1: Ingrédient volumes et résultant modules élastique pour AAP tendres, dures et rigides utilisés dans les essais de invadopodes. AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = persulfate d'ammonium.

  1. Pipeter 8,48 ul de la solution de PAA sur le centre de chaque micropuits.
    Remarque: Ce volume donne théoriquement une AAP de 75 um d'épaisseur.
  2. Abaissez doucement le côté flammé du 12 mm lamelle sur la goutte dans le micropuits l'aide de pinces.
  3. Laisser la solution de l'AAP sandwich polymériser pendant 15-30 min. Vérifiez la polymérisation en cochant la solution restes.
  4. Ajouter 2 ml de 1x PBS pour chaque plat et retirez les 12 mm lamelles avec des pincettes.
    Remarque: 10x PBS est réalisée dans le laboratoire et composée de 0,011 M de KH 2 PO 4, 1,54 M de NaCl, 0,056 M et Na 2 HPO 4.
  5. Laver les puits avec 2 ml de 1 x PBS à température ambiante pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min.

3. Préparation du PAA pour la force de traction Essais

  1. Pour une solution de l'AAP souple (8% d'acrylamide et 0,05% de BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d'acrylamide, 25 ul de 2% BIS et 566 pi d'eau ultra pure (tableau 2).
  2. Pour une solution de l'AAP dur (8% d'acrylamide et 0,35% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d'acrylamide, 175 ul de 2% BIS, et 401 pi d'eau ultra-pure (tableau 2).
  3. Pour une solution de l'AAP rigide (12% d'acrylamide et 0,60% BIS) 1 ml, mélanger 300 pi de 40% d'acrylamide, 300 pi de 2% BIS, et 161 pi d'eau ultra-pure (tableau 2).
  4. Dégazer la solution pendant 15 min. Ajouter 200, 215, et 230 ul de 1 mg / ml de fibronectine plasmatique humaine à des solutions de PAA tendres, dures et rigides, respectivement. Soniquer 8 pi de 200 nm microsphères fluorescentes rouges (excitation / émission de 580/605 nm) pendant 30 secondes. Pour chaque solution, ajouter 8 200 pi de microsphères fluorescentes rouges nm,1 ul d'acide acrylique 10 mg / ml de NHS ester, 5 ul de 100 mg / ml de persulfate d'ammonium, et 2 pi de TEMED (tableau 2). Mélanger avec pipetage doux et éviter de créer des bulles dans les solutions.

AAP
(1 ml) 		40%
AA
(Ul) 		2%
BIS
(Ul) 		Ultrapure
Eau
(Ul) 		1 mg / ml
FN
(Ul)
Micro-sphères
(Ul) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Ul) 		100 mg / ml
APS
(Ul)
TEMED
(Ul) 		Élastique
Module
(Pa)
Doux 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Dur 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Rigide 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tableau 2:. Volumes d'ingrédients et résultant modules élastique pour AAP tendres, dures et rigides utilisés dans les tests de force de traction AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = persulfate d'ammonium.

  1. Pipeter 8,48 ul de la solution de PAA sur le centre de chaque micropuits.
    Remarque: Ce volume donne théoriquement une AAP de 75 um d'épaisseur.
  2. Abaissez doucement le côté flambé de ee 12 mm lamelle sur la goutte dans le micropuits l'aide de pinces.
  3. Laisser la solution de l'AAP sandwich polymériser pendant 15-30 min. Vérifiez la polymérisation en cochant solution restes.
  4. Ajouter 2 ml de 1x PBS pour chaque plat et retirez les 12 mm lamelles avec des pincettes.
  5. Laver les puits avec 2 ml de 1 x PBS à température ambiante pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min.

4. Préparation de l'ECM pour invadopodes dosages

  1. Chauffer la solution de gélatine (1% de gélatine et de 1% de saccharose) à 37 ° C.
  2. Traiter les PAA avec 150 pi de la solution de gélatine pendant 1 min puis soigneusement aspiration du fond de la cupule lors de la tenue des plats à fond de verre à un angle de 45 °.
  3. Séchez la mince couche restante de gélatine sur les AAP dans les micropuits à un angle raide (60 ° ou plus) pour optimiser le séchage pendant 60 min.
  4. Traiter les micropuits avec 2 ml d'une solution froide de glutaraldéhyde à 0,5% par rapport à iCE pendant 15 min suivie par la température ambiante pendant 30 min.
  5. Laver les puits avec 2 ml d'une 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min.
  6. Traiter les micropuits avec 2 ml d'une solution de borohydrure de sodium pendant 1 min. Tapoter doucement plats sur le banc pour éliminer les bulles qui se forment sur la surface de la gélatine.
  7. Aspirer et laver les puits avec 2 ml d'une 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min.
  8. Diluer une solution de fibronectine plasmatique humaine marqué au FITC à 50 pg / ml avec PBS 1x et une centrifugation à 175 000 xg à 4 ° C pendant 15 min. Soit acheter disponible dans le commerce fibronectine marqué ou étiqueter comme suit:
    1. Dissolvez 5 mg de fibronectine dans 10 ml de tampon borate (170 mM métaborate de sodium tétrahydraté et 40 mM de NaCl) et le lieu dans un tube de dialyse.
    2. Étiquette de la fibronectine en plaçant le tube dans 200 ml de tampon borate contenant 6 mg de FITC dissous à température ambiante sur un agitateur magnétiquefixé au niveau le plus bas pendant 1,5 heure dans l'obscurité.
    3. Dialyser avec 500 ml d'une 1x PBS sur un agitateur magnétique réglé à la température minimum pendant 3 jours dans une pièce sombre et froide (4 ° C) avec deux volumes change un jour.
    4. Concentration de fibronectine Calculer marqué au FITC en fonction de la densité optique des fractions aliquotes diluées (1: 200) à 280 nm et 493 nm, telle que [OD 280 - (0,36 x DO 493)] / 1,4 fois le facteur de dilution de 200 fois 2 (qui représente pour la concentration de la fibronectine glycérol dans l'étape suivante) résultant en unités mg / ml.
    5. Dialyser nuit dans une solution de glycérol de 50% sur un agitateur magnétique réglé à la position la plus basse durant la nuit dans une chambre froide obscurité à 4 ° C.)
  9. Traiter les micropuits avec 150 ul de la solution de fibronectine marqué au FITC à la température ambiante pendant 60 min dans l'obscurité.
  10. Aspirer soigneusement la solution de fibronectine marqué FITC du fond de la cupule lors de la tenue des plats à fond de verre auun angle de 45 °, puis de remplir les boîtes à fond de verre avec une solution d'éthanol à 70% à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte sombre de culture cellulaire pour la stérilisation. Remplissez également à fond de verre couvercles des capsules ou essuyer avec des lingettes de peluches bas trempés dans 70% d'éthanol.
  11. Lavez la vaisselle à fond de verre en les remplissant de 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus avec 2 ml de PBS 1x, pour un total de 15 min.

5. Préparation et imagerie de invadopodes dosages

  1. Ajouter 25,000 cellules cancéreuses dans 2 ml de milieu de invadopodes (1: 1 de DMEM et de milieu RPMI 1640 avec 5% de sérum faible teneur en protéines, le sérum de veau fœtal à 10%, et 20 ng / ml de fraîchement ajoutée facteur de croissance épidermique) aux plats à fond de verre et incuber une nuit.
  2. Aspirer et traiter les micropuits avec 2 ml d'une solution de paraformaldehyde à 3,7% à la température ambiante dans l'obscurité pendant 20 min pour fixer les cellules.
  3. Après deux lavages rapides avec 2 ml de PBS 1x, traiter les puits avec 2 ml d'un Triton X-100 solution à 0,1% à la chambre Temperature dans l'obscurité pendant 5 min pour perméabiliser les cellules.
  4. Après un lavage rapide avec 2 ml de PBS 1x, traiter les micropuits avec 3% d'albumine de sérum bovin solution de blocage à la température ambiante dans l'obscurité pendant 60 min pour bloquer les cellules.
  5. Incuber les puits avec 150 ul d'anticorps de souris anti-cortactine (1: 750) en solution à température ambiante dans l'obscurité pendant 60 min blocage.
  6. Laver les micropuits avec 2 ml de 1 x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min.
  7. Incuber les puits avec 150 ul d'anticorps de chèvre anti-souris 633 d'anticorps (1: 500) et 546 phalloïdine (1: 750) en solution à température ambiante dans l'obscurité pendant 60 min blocage.
  8. Laver les micropuits avec 2 ml de 1 x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min.
  9. Ajouter six gouttes de milieu de montage pour remplir chaque puits et couvrir avec 22 x 22 lamelles.
  10. Cortactine et l'actine image pour identifier invadopodes utilisant excitation et d'émission filtres de 632/647 nm et556/570 nm, respectivement, en utilisant un haut NA, 40X lentille à immersion d'huile sur un large champ microscope inversé. De même, l'image de la fibronectine à identifier la dégradation de l'ECM en utilisant un filtre d'excitation et d'émission de 492/518 nm.

6. Préparation et imagerie de la force de traction Essais

  1. Ajouter 15,000 cellules cancéreuses dans 2 ml de milieu de invadopodes de la vaisselle à fond de verre et incuber pendant une nuit.
  2. Support d'Aspirer dans les boîtes à fond de verre et le remplacer par 2 ml de milieu L-15, avec les mêmes suppléments (5% de sérum faible teneur en protéines, le sérum de veau fœtal à 10% et 20 ng / ml de fraîchement ajoutée facteur de croissance épidermique), pré -warmed à 37 ° C.
  3. Incuber les boîtes à fond de verre dans une chambre environnementale sur un microscope inversé pré-équilibrée à 37 ° C avec une humidité élevée pendant 1 heure.
  4. Prendre quatre ensembles d'images en utilisant une haute NA, 40X lentille sur un microscope inversé à grand champ avec une étape automatisée pour marquer les positions cellulaires:
    1. cellules image surp des AAP en utilisant le contraste de phase (de l'image "de phase").
    2. Image microsphères fluorescentes utilisant excitation et d'émission de 560/645 nm filtres en mettant l'accent légèrement sous les cellules jusqu'à ce que la première couche de microsphères en haut de l'AAP est au point ("souligné" l'image).
    3. En outre, se concentrer sur le fond de l'AAP (en utilisant les microsphères comme marqueurs) et prendre une image ("bas" image). Remarque: Le but de cette image est pour enregistrer la position z pour obtenir l'épaisseur de l'AAP réelle à chaque position pour le calcul de la force de traction comme décrit dans Les résultats représentatifs.
    4. Après ces images ont été acquises à plusieurs positions, mélanger doucement dans 220 pi de solution à 10% de Triton-X pour enlever les cellules. microsphères de l'image en haut de la PAA à chaque position comme décrit précédemment (image de "null").

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Representative Results

Dans le test de invadopodes, invadopodes sont généralement identifié par colocalisation des marqueurs comme l'actine et cortactine les structures ponctuées dans le corps cellulaire (figure 1). Les deux invadopodes dégrader activement et non dégradantes peut être compté et se différencient par le fait que ces structures sont colocalisés avec des zones dépourvues de noir dans le signal fluorescent fibronectine marqué au FITC (figure 1). Invadopodes sont comptées manuellement, et la dégradation de l'ECM par cellule est déterminée par seuillage manuellement ces zones noires à l'intérieur des contours des cellules.

Dans l'essai de force de traction, quatre images sont capturées à chaque emplacement cellulaire marqué par position de phase (figure 2). Tout d'abord, "phase" et "souligné" les images sont prises de toutes les cellules d'intérêt. Une image "fond" de l'AAP est également prise à chaque position afin de calculer l'épaisseur d'hydrogel. Après avoir retiré til cellules, une image "null" est prise à chaque position de la scène marquée. Déformations dans les PAA sont calculés sur la base du changement de position de microsphères entre le "souligné" et des images "null". Ces déplacements et les propriétés mécaniques de l'AAP (E et du coefficient de Poisson supposé que 0,5) sont ensuite utilisés pour calculer des forces de traction (figure 2). Plusieurs méthodes existent pour le calcul des forces de traction 24 sur la base de certains formulation de la solution de Boussinesq pendant une demi-espace élastique infinie 25. Bien que les détails de ces analyses sont au-delà du champ d'application de ce texte, nous avons un logiciel sous licence LIBTRC de Micah Dembo à l'Université de Boston, qui utilise une méthode décrite précédemment pour le calcul des forces de traction 26. Cette méthode de calcul particulière compense épaisseurs finies dans ses calculs qui exige l'épaisseur de la PAA à chaque position qui est calculé sur les différence dans le z-position des "stressés" et "images de fond". De nombreux groupes de recherche ont progiciels similaires disponibles ou choisissent d'écrire leurs propres programmes. En outre, d'autres méthodes existent pour le calcul des forces de traction basés sur des approches mathématiques différentes 24.

Figure 1
Figure 1: Le test de invadopodes peut être utilisé pour identifier invadopodes et la dégradation de l'ECM associée images de fluorescence à champ large Exemple de invadopodes dans un SCC-61 (tête et cou carcinome épidermoïde) cellule sur une AAP dur avec 1% de gélatine et FITC. fibronectine marqué. Invadopodes sont généralement identifié par colocalisation des deux marqueurs tels que l'actine et cortactine (rouge et bleu dans l'image de superposition, respectivement). Invadopodes peut être quantifiée à la fois comme dégradant activement (colocalisés avec des zones noires absenceing signaux FITC comme indiqué par des flèches jaunes) et non dégradants (notée par des flèches blanches). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Le dosage de la force de traction peut être utilisé pour déterminer les forces de traction cellulaires générées par le cytosquelette d'actine en suivant le déplacement des microsphères noyées dans les PAA Exemple grand champ de phase et de fluorescence des images d'une cellule SCC-61 sur un AAP dur (. "phase"), et les microsphères directement sous la cellule à la surface supérieure de l'AAP ("souligné"). Une image du fond de l'AAP peut également être prise par la suite de calculer son épaisseur locale ("ascendante"). Après la cellule est supprimée, une image est prise une fois de plus de la microsphères à la surface supérieure de l'AAP ("null"). positions de microsphères entre le "souligné" et des images "null" peuvent être suivis pour obtenir un "champ de déplacement." déplacements microsphères et des propriétés mécaniques AAP peuvent ensuite être utilisées pour calculer un "champ de vecteur de traction." Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous présentons une méthode pour fabriquer AAP qui peuvent être utilisés comme base pour invadopodes et de la force de traction des essais de corréler les comportements cellulaires invasives et contractiles. Alors que PAA ont longtemps été utilisés pour examiner les effets de rigidité sur les cellules et calculer les forces de traction 18,24,27, ce protocole est le premier à développer des tests parallèles fondés sur PAA avec les mêmes rigidités de corréler les comportements cellulaires invasives et contractiles en réponse à la matrice propriétés mécaniques. Activer correctement les lamelles des plats à fond de verre assure que les PAA va se lier à eux et ne se détache pas. Bien que nous et d'autres avons compté sur des réactifs tels que sulfo-SANPAH et d'acide acrylique ester NHS de se lier à la surface de la gélatine de l'AAP dans le passé 4,12,28, nous avons constaté que ces méthodes ne ont pas produit les couches de surface de manière fiable uniformes de la fibronectine . Par conséquent, la fibronectine a été intégré et réticulé à travers le PAA en utilisant l'acide acrylique ester NHS interprété29,30 par d'autres groupes. Cependant, des concentrations croissantes de la fibronectine ont été nécessaires pour obtenir la même densité de ligand à la surface des FQA tendres, dures et rigides 5. En outre, l'incorporation de la fibronectine (mais pas les microsphères) réduit les propriétés mécaniques des AAP tendres, dures et rigides de 1071, 9299 et 28283 Pa 4 à 1023, 7307, et 22 692 Pa 5, respectivement. Cependant, ces valeurs de modules élastiques réduit englobaient toujours le choix de tissus normaux et cancéreux 23. des modules de stockage de l'AAP peuvent être facilement mesurées par rhéométrie et convertis en modules d'élasticité 1,4.

Bien que le protocole est simple, en abaissant et en enlevant les 12 mm lamelles sont les étapes les plus difficiles et nécessitent la pratique. Le plus grand défi lors de l'abaissement une lamelle est de se assurer que la solution de l'AAP se étale uniformément sans les bulles ou les éclaboussures. Retrait d'une lamelle exigeune main ferme afin de ne pas endommager la lamelle 12 mm, le verre de fond 14 mm lamelle ou l'AAP. Nous avons essayé de revêtements hydrophobes sur le 12 mm lamelle d'aider à l'élimination mais a constaté que les PAA sont laissés avec des motifs dans leurs surfaces. L'utilisation de pointe fine et mince, pinces paddle de style de descente et de retirer les 12 mm lamelles, respectivement, est fortement recommandé. En outre, la quantité de lumière utilisée pour l'image des cellules doit être réduite au minimum, car certains types de cellules sont sensibles à la lumière concentrée sur le microscope. Aussi, milieu L-15 a été utilisé pour les essais de la force de traction depuis notre chambre environnementale sur notre microscope ne est pas équipé pour le CO 2. Bien que les mêmes suppléments ont été utilisés dans les médias pour les invadopodes et de la force de traction des essais dans une tentative de maintenir des conditions identiques, DMEM et RPMI 1640 pourraient être utilisés à la place du L-15, si niveaux de CO 2 peuvent être contrôlés.

Alors que le volume de la solution de PAA a été choisie pour y théoriquementield gels d'une épaisseur de 75 um, de leurs épaisseurs varient généralement entre 30 à 60 um. Toutefois, cette gamme est bien supérieur à la valeur à laquelle les cellules peuvent sentir la rigidité sous-jacent des lamelles des plats de fond de verre 31. En outre, l'épaisseur de la couche d'ECM utilisé pour détecter la dégradation (la gélatine et de la fibronectine marqué au FITC superposées sur au PAA) qui a été précédemment rapporté comme environ 1 um d'épaisseur 12; par conséquent, cette couche mince ne protège pas les cellules des rigidités du PAA. Cependant, débris solides, fissures et autres déformations soit dans le PAA et / ou de la couche d'ECM peuvent affecter les propriétés invasives et contractiles cellulaires individuels. Ces problèmes peuvent être causés par des lamelles impurs 12 mm qui introduisent des débris dans les hydrogels, séchage excessif des gels et / ou la gélatine, et d'aspiration incomplet de borohydrure de sodium qui peut laisser des bulles qui se déforment la couche d'ECM. Par conséquent, il faut prendre soin lors de la sélection CELLS pour l'imagerie pour se assurer qu'ils ne soient pas indûment influencés par des irrégularités locales dans les surfaces des échantillons.

Des concentrations relativement élevées de la fibronectine à la fois dans le PAA (à 200-230 mélangés dans ug / ml) et la couche d'ECM (superposée à la gélatine à 50 pg / ml) a été utilisé; Toutefois, les concentrations réelles de chaque surface ne ont pas été directement mesurée. Bien que chaque surface semble être saturé avec la fibronectine, on ne sait pas si les cellules éprouvent les mêmes densités de ligand exactes entre les deux essais. Pour les dosages de la force de traction, des microsphères de 200 nm à une dilution de 1: 125 ont prouvé optimale pour l'imagerie. Cependant, il est assez fréquent de trouver d'autres groupes utilisant des microsphères de différents diamètres ou des dilutions. Dans ce système, les petites microsphères affichés mouvement brownien dans le PAA, alors que les grandes microsphères provoqué des fissures et déformations. Ces observations sont très probablement en raison des propriétés physiques du PAA (c.

Dans l'ensemble, bon nombre de ces facteurs expérimentaux peuvent être ajustés en fonction des besoins de l'utilisateur tels que PAA avec des propriétés mécaniques différentes, les cellules cancéreuses avec variant propriétés invasives et contractiles, et des systèmes de microscopie avec d'autres capacités d'imagerie. Le rapport de l'acrylamide: BIS peut être modifiée pour produire PAA avec modules élastiques semblables ou différents et 27 réticulation. La sensibilité des tests de force de traction peut être ajusté pour tenir compte des différents niveaux de force cellulaire en changeant la rigidité et / ou microsphères DILUTion. Différents fluorophores peuvent également être choisis pour immunofluorescence et la fibronectine étiquetage basé sur les spécifications de microscope. Bien que l'eau de Javel FITC fait, il est tout à fait lumineux dégradation décision ECM facilement identifiable. Cependant, l'imagerie de fluorescence de invadopodes et petites microsphères nécessite généralement des objectifs élevés NA pour une résolution optimale. En outre, les deux analyses peuvent être effectuées sur des lamelles de verre en plaques à puits. Cependant, plats en verre en bas sont beaucoup plus faciles à préparer et à utiliser tout au long du processus expérimental. Dans l'avenir, la combinaison de ces essais en un seul permettrait de visualisation directe des deux dégradation de la MEC et la génération de force cellulaire. Toutefois, plusieurs défis techniques se poseraient y compris l'imagerie de cellules vivantes pour invadopodes et microbilles déplacements, augmentation de l'exposition cellulaire à la lumière, le blanchiment de la fibronectine FITC, et si les forces de traction sont complètement transduction à travers la couche marqué par fluorescence et réticulée ECM pour les surfaces de l'AAP .

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Disclosures

Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre K25CA143412 (Parekh). Nous tenons à souligner que le soutien supplémentaire a été fourni par le Département d'ORL. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Acknowledgments

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

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gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses
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Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

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