Abstract
Determinando o modo de acção de produtos químicos bioactivos é de interesse para uma larga gama de académico, farmacêuticos, industriais e cientistas. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de brotamento, é um modelo eucariota para que um conjunto completo de ~ 6000 mutantes de deleção do gene e gene essencial hipomórfico mutantes estão disponíveis comercialmente. Estas colecções de mutantes pode ser usado para detectar interacções químicas sistematicamente-gene, isto é, genes necessários para tolerar um produto químico. Esta informação, por sua vez, comunica com o modo provável de acção do composto. Aqui nós descrevemos um protocolo para a rápida identificação de interações químicas-genética em brotamento da levedura. Demonstramos o método usando o agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tem um mecanismo bem definido de acção. Os nossos resultados mostram que o TRAMP nuclear RNA e de exossoma enzimas de reparação de ADN são necessários para a proliferação na presença de 5-FU, o que é consistente com m anterioricroarray abordagens genéticas baseadas em códigos de barras de produtos químicos e o conhecimento de que 5-FU afeta adversamente o metabolismo de RNA e DNA. Os protocolos de validação necessárias dessas telas de alto rendimento são também descritos.
Introduction
As ferramentas e os recursos disponíveis no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae genéticas permitiram grande escala genômica funcional estudos que fornecem coletivamente uma nova visão sobre como os genes funcionam como redes de cumprir os requisitos de sistemas biológicos. A pedra angular dessas ferramentas foi a criação colaborativa de um conjunto completo de deleções de genes não essenciais de todos os quadros de leitura aberta em levedura 1,2. Uma observação interessante foi que apenas ~ 20% dos genes de levedura são necessários para a viabilidade, quando cultivada como haplóides, sob condições laboratoriais padrão. Isto realça a capacidade de uma célula para o tampão contra perturbações genómicas, através da utilização de vias alternativas biológicas. Mutantes genéticos que sejam viáveis individualmente, mas em combinação letal, sinalizar caminhos biológicos paralelas ligadas ou convergentes e formam redes de interação genéticas que descrevem a função biológica. Com o desenvolvimento do te condicionalalelos mperatura-sensíveis e hipomórfico de genes essenciais da tecnologia não tem sido limitada para o estudo dos genes não essenciais 3,4. Este conceito foi aplicado em escala genômica produzindo um mapa imparcial interação genética que ilustra como os genes envolvidos em processos celulares similares agrupam 5.
Perturbações químicos de redes genéticas deleções de genes imitam (Figura 1) 6. Consultando os compostos inibidores do crescimento contra uma matriz de alta densidade de estirpes de deleção de hipersensibilidade identifica um perfil de interacção química-genético, isto é, uma lista de genes que são necessários para tolerar o stress químico. Como interacções genéticas, telas em larga escala de bibliotecas químicas têm mostrado que os compostos com um modo semelhante de acção de cluster em conjunto 7. Portanto, ao estabelecer o perfil de interação química, genética de um composto o modo de ação pode ser deduzida por comparação com larinteração genética genética e química sintética ge-escala conjuntos de dados de 8,9.
Telas químico-genética em larga escala, onde dezenas de compostos são interrogados, foram realizados ensaios de competição por código de barras. Nesta abordagem, o conjunto reunido de estirpes de deleção é cultivado em massa por várias gerações em um pequeno volume de um meio contendo uma substância química. Uma vez que cada mutante de deleção abriga um código de barras genético único, a viabilidade / crescimento de mutantes individuais dentro da piscina de estirpes de deleção é rastreado por microarray ou de alto rendimento seqüenciamento 10.
Deduzir aptidão monitorando tamanho da colônia de mutantes fisicamente vestiu cultivadas em agar sólido contendo um composto bioativo também é um método eficaz para identificar as interações químicas genético 11,12. Esta abordagem fornece uma alternativa de baixo custo para triagem baseado na competição e é bem adequado para ensaiar pequenas bibliotecas de produtos químicos.Esboçado aqui é uma metodologia simples para a produção de uma lista de interações químicas-genética em S. cerevisiae que não confia em molecular manipulações de biologia ou de infra-estrutura. Ela exige apenas uma coleção de levedura eliminação, um aparelho de pinagem robótico ou manual e software de análise de imagens disponíveis gratuitamente.
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Protocol
NOTA: O fluxo de trabalho geral deste procedimento é descrito na Figura 2.
1. Determinação da dose de inibição de crescimento
- Preparação da cultura de levedura durante a noite
NOTA: Os meios de crescimento de levedura-extract-peptone dextrose (YEPD) utilizados neste protocolo é uma receita padrão 13.- Expelido BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) as células em uma placa de agar de YEPD e incubar durante 48 horas a 30 ° C ou até formar colónias visíveis.
- Prepare a culturas de uma noite inoculando 5 ml de meio líquido YEPD num vaso de cultura estéril com uma única colónia. Incubar durante a noite a 30 ° C com rotação contínua ou agitação. A cultura será tipicamente atingir a saturação da manhã (2 x 10 ~ 8 células / ml).
- Preparação ágar sólido contendo doses químicas diferentes
- Prepare diversas unidades populacionais deo produto químico a ser testado em 100x a concentração final desejada em um solvente apropriado.
NOTA: As concentrações eficazes irão depender da natureza da substância, e deve ser determinada empiricamente. Por isso, é aconselhável testar inicialmente uma ampla gama de concentração final, ou seja, a partir de baixo � a alta mM. - Para cada concentração de produto químico a ser testado, alíquota de 3 ml de agar de YEPD fundido a um tubo de cultura em vários estéril. Lugar no 55 ° C banho de água para manter-se de solidificação.
- Para cada concentração de produto químico a ser testado adicionar 30 ul do composto a 100x meios fundidos, vortex 2-3 segundos para misturar, e pipeta de 1 ml em cada par de cavidades em duplicado de uma placa de 12 poços. Certifique-se de incluir um veículo único controle. Permitir placas para definir durante a noite à temperatura ambiente. Descarte qualquer mídia extra.
- Prepare diversas unidades populacionais deo produto químico a ser testado em 100x a concentração final desejada em um solvente apropriado.
- Células se espalham chapeamento
- Inocular 10 ml de meio líquido YEPD com 2 ul de uma cultura saturada de levedura, cultivada durante a noite, como no Passo 1.1.2.
- Placa de 25 ul de cultura de levedura diluída por poço, espalhe uniformemente com esferas de vidro estéreis ou vara, e permitir que o prato para secar sob uma chama. Incubar a placa a 30 ° C durante 48 h.
- Avaliar o crescimento de leveduras (tanto o número total e tamanho de colónias) nas placas. Escolher a uma concentração sub-letal de composto que não iniba o crescimento em mais de 10% -15% para realizar a tela.
2. Systematic Tela Chemical Genetic
- Manutenção de supressão-mutante-array (DMA) e Preparação de Fonte Placa
- Para uma descrição detalhada sobre a construção de matrizes de mutantes de deleção de stocks de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Uma vez que os mutantes de deleção foram dispostas a uma densidade de 384 colónias por placa, o DMA podem ser armazenados durante vários meses a 4 ° C. Replicar em agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418, como necessário para prevenir crescimento de colónias em cadaoutro.
NOTA: múltipla repetições em série deve ser evitada para evitar a perda de estirpes de crescimento lento e minimizar o aparecimento de mutantes supressores. Isto é particularmente relevante se a manutenção das coleções como haplóides. - Execute todas as etapas replica-chapeamento usando um microbiana arraying sistema robótico. Alternativamente, manipular colônias utilizando ferramentas manuais vestiu de aprisionamento.
NOTA: A coleção de levedura eliminação está disponível como haplóides e diplóides de várias fontes comerciais e geralmente é enviado como stocks de glicerol em placas de 96 poços.
- Para uma descrição detalhada sobre a construção de matrizes de mutantes de deleção de stocks de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Uma vez que os mutantes de deleção foram dispostas a uma densidade de 384 colónias por placa, o DMA podem ser armazenados durante vários meses a 4 ° C. Replicar em agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418, como necessário para prevenir crescimento de colónias em cadaoutro.
- Condensação da matriz mutante de deleção
- Preparar 250 ml de caldo YEPD meios de agar contendo 200 ug / ml de G418. A concentração eficaz de G418 pode variar e cada lote deve ser testada empiricamente.
- Preparar cinco placas de agar de YEPD vertendo 50 ml de agar de YEPD contendo 200 ug / ml de G418 por placa. Faça isso um dia antes da condensação da matriz e permitir que as placas para esfriar à temperatura ambienteratura durante a noite em uma superfície lisa.
NOTA: Quatro placas serão necessários para a recolha de densidade 1536-deformação, o quinto placa é derramado como um extra. - Remover os pratos de Petri contendo 16 a recolha mutante de deleção, a uma densidade de 384 colónias por placa e deixar vir à temperatura ambiente (~ 1 hora).
- Limpe qualquer condensação que se formou sobre a tampa de cada placa usando uma tarefa delicada wipe. Não fazer isso pode resultar em gotas de água que está sendo depositado sobre a matriz e contaminação cruzada de mutantes dispostas.
- Usando uma matriz fixando robô microbiana, condensar o DMA de uma densidade de 384 colônias por placa (16 placas de Petri) a 1.536 colônias por placa (4 placas de Petri). Realizar isso para que a 1ª colônia de placa 1 pins para a linha 1 coluna 1 da matriz condensado, o 1º colônia de placa 2 para a linha 1 coluna 2, o 1º colônia de placa 3 a linha 2 e coluna 1, e a colônia 1º de placa 4 a linha 2coluna 2.
- Incubar a matriz consolidada a 30 ° C durante a noite.
- Examine a matriz para assegurar a transferência uniforme de colônias a partir de placas de origem. Haverá várias posições em branco, propositadamente incorporados na matriz, que servem como guia para assegurar o DMA foi condensada correctamente (Figura 4A).
NOTA: Estas serão as placas de base para a réplica de placas em meios contendo o composto de teste. A chapa única fonte pode ser usado para várias pinnings. Além disso, muitos robôs terão um recurso de compensação, o que irá garantir um número semelhante de levedura estão sendo transferidos de cada vez.
- Placa Replica variedade mutante de deleção
- Prepare 700 ml de controle (veículo só) e 700 ml de mídia experimental (contendo química). Isto é suficiente para realizar o ensaio em triplicado (12 placas por condição, além de dois extras).
- Despeje 50 ml de agar YEPD contendo substância química de ensaio ou de controlo por placa. Permitir que as placas to esfriar à temperatura ambiente durante a noite em uma superfície lisa.
- Usando o robô para placa réplica, o DMA para inocular três conjuntos de placas que contêm produtos químicos com a concentração determinada experimentalmente, bem como três conjuntos de placas contendo o controlo do veículo. Incubar as placas à temperatura ambiente, durante 24-48 h.
3. As placas de imagem e análise de dados
- Retirar as placas da incubadora e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (~ 1 hora) antes da imagem. Isso vai evitar a formação de condensação enquanto a imagem das placas.
- Placas de imagem em 24 e 48 horas por remover a tampa e colocar o rosto para baixo em um scanner de mesa. Capturar imagens com uma resolução de pelo menos 300 dpi. Como alternativa, use uma câmera digital para capturar imagens. Se fazê-lo, placas lugar enfrentam-se em um fundo escuro e remover as tampas para a imagem.
NOTA: O formato de arquivo e de posicionamento das placas dependerá do programa de quantificação utilizados. Execute quantificação e comparação dos tamanhos colônia matriz usando um dos vários programas de código aberto, incluindo Balony 15, SGAtools 16, e ScreenMill 17.
4. Validação de Tela
NOTA: Nesta fase, várias exclusões de leveduras mutantes vai marcar como hipersensibilidade à substância química de interesse. Essas interações químicas-genético deve ser validado junto de duas maneiras. Primeiro a identidade de cepas sensíveis devem ser confirmados por PCR. Em segundo lugar, a sensibilidade química deve ser marcado de forma independente. Descritos abaixo é um breve protocolo para realização de ensaios mancha para validar hipersensibilidade tensão, uma técnica comum em biologia levedura.
- Streak fora desejado (hipersensibilidade) mutantes da coleção eliminação fermento em agar YEPD contendo 200 ug / ml de G418. Incubar a 30 ° C até formar colónias. Verifique se o genótipo da estirpe por PCR com primers de diagnóstico de acordo com ao protocolo do fabricante.
- Inocular 5 ml de líquido YEPD para cada estirpe e incubar durante a noite a 30 ° C com rotação ou agitação.
- Meça OD 600 e diluir cada cepa de DO600 = 1 em dH estéril 2 O. Estes são agora as culturas de levedura normalizados.
- Dispensar 100 ul de normalizada levedura do tipo selvagem (BY4741) a cultura bem A1 de uma placa de 96 poços. Dispensar 100 l de até sete estirpes adicionais para poços B1-H1.
- Use uma pipeta multicanal para dispensar 90 ul de dH 2 O estéril para poços A2-H2 através A6-H6. Finalmente, preparar uma série de diluições 1:10 de culturas de levedura normalizados. Comece serialmente pipetando 10 ul de coluna 1 para a coluna 2 com um pipetador multicanal, e continuar ao longo da placa de 96 poços até seis diluições são feitas (isto é, 10 0 a 10 -5).
- Transferir 2-5 ul de culturas de levedura diluídos em uma grade usando um multicanalpipettor em meios sólidos YEPD contendo controle químico e do veículo. Incubar as placas à temperatura apropriada, durante 24-48 h.
- Inspeccionar placas e comparar a sensibilidade de escolha para mutantes química (em relação ao controle BY4741). Placas de imagem às 24 e 48 horas como no passo 3.2.
NOTA: Embora a identificação de várias cepas de hipersensibilidade com ontologias ou funções de genes relacionados empresta confiança para a validade da tela, a transformação de uma estirpe eliminação hipersensibilidade com um plasmídeo contendo uma cópia do tipo selvagem do gene é necessário para estabelecer formalmente que um gene eliminação de interesse (e não escondidos segundo mutações no local) faz com que a sensibilidade de drogas.
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Representative Results
Como uma validação desta abordagem foi realizado um rastreio genético química representativa interacção do agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), seguindo o protocolo descrito acima. 5-FU é conhecido por perturbar a timidilato-sintase, assim como o metabolismo do ADN e ARN 18. As interações químicas genéticos de 5-FU são bem estudados e foram investigados por meio de técnicas de levedura de código de barras de microarranjos utilizando ambas as coleções de deleção heterozigotos e homozigotos 8,19. Aqui mostramos que resultados semelhantes podem ser obtidos por quantificação comparativa da dimensão da colónia mutante.
Deve notar-se que o rastreio realizado utiliza a recolha não essencial deleção do gene haplóide. Este tipo de ecrã também pode ser realizada utilizando estirpes diplóides, mutantes sensíveis à temperatura, e alelos hipomórfico, permitindo a inclusão de mutantes de genes essenciais. Uma das vantagens de utilizar a coleção eliminação haplóides é aumentada sensitiv drogadade de vias de alvo, tendo em conta a ausência completa do produto do gene. No entanto, duas desvantagens significativas são de que a hipersensibilidade gene essencial não pode ser consultada, bem como a recolha haplóides é propenso a mutações espontâneas supressores que são selecionados por mais de múltiplas propagações. Isso pode levar à deterioração da coleção. Assim, existe uma troca entre inerente fora da integridade e da largura da matriz e a sensibilidade do efeito do fármaco. Isto deve ser tomado em consideração e a recolha mutante mais adequado, seleccionado com base na aplicação desejada.
Em primeiro lugar, a concentração sub-letal apropriado de 5-FU para ser utilizado no crivo foi determinada para ser de 10 uM por BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), as células que crescem em concentrações crescentes de 5-FU e avaliar visualmente o crescimento de colónias de levedura ( Figura 3A). Alternativamente, os resultados semelhantes podem ser obtidos através do crescimento vosast em placas de microtitulação em cultura líquida e uma monitorização frequente das culturas de densidade óptica usando um leitor de microplacas (Figura 3B), conforme descrito por grupos anteriores 10,20.
Usando o Cantor ROTOR, o DMA de levedura foi replicada a 1536 colónias por placa de densidade em meio contendo um sulfóxido de dimetilo (DMSO) de controle (Figura 4A) 10 uM de 5-FU ou. Estas placas foram incubadas durante 24 horas à temperatura ambiente e fotografada em um scanner de cama plana. Medição do tamanho da colônia para cada mutante em ambas as placas experimentais e de controle foi realizada utilizando o mecanismo de análise de imagem Balony 15. O software calcula o rácio Balony tamanho de colónias na matriz experimental em relação ao controlo. O usuário é capaz de definir um limite de relação e se a tela é realizada em, pelo menos, triplicar o valor de p será atribuído para cada mutante. Em nossos mutantes tela representativos que apresentaram uma proporção de ≤0.8 foram considereed ser hits. Os resultados de quantificação de colónias podem ser representados graficamente, representando graficamente a proporção de tamanho para cada colónia no eixo y e a deleção do gene da ordenada pela posição de matriz (Figura 4B) ou razão (Figura 4C) no eixo-x.
Doente Sintético / mutantes letais identificados na tela podem ser agrupadas com base em descrições funcionais realizando ontologia gene (GO) análise. Existem várias ferramentas disponíveis publicamente para análise GO de listas de S. genes cerevisiae; incluindo Funspec 21, DAVID Bioinformática banco de dados 22,23, eo Saccharomyces Genome banco de dados (SGD) Go Term localizador 24. Deleções de genes que tinha uma proporção de menos do que ou igual a 0,8 na tela de 5-FU foram usadas como uma lista de entrada para Funspec. Funspec aceita uma lista de nomes de genes de levedura sistemática ou comum e produz resumos de ontologias de genes, classificações funcionais, localização, complexos de proteína, bem como otsuas classificações úteis que são enriquecidos nessa lista. O écran representativo realizado mostrou um enriquecimento de ontologias para o metabolismo de ARN, incluindo ARNt oscila, modificação uridina e máquinas de vigilância de ARN, e resposta a danos no ADN (Tabela 1). Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que mostraram 5-FU tratamento resulta da acumulação de RNAs não codificantes poliadenilados, que são processados pelo nuclear Trf / Rrp6 / Air / Mtr4 Poliadenilação (TRAMP) exosome 25. Assim, estes resultados estão de acordo com telas genéticos químicas anteriores e do mecanismo conhecido de 5-FU bioatividade 8,19.
Tal como acontece com todas as abordagens genómicas funcionais de alto rendimento, é necessário para validar os resultados. Para validar interações químicas genéticas mutantes de levedura devem ser primeiramente por PCR validado com iniciadores que se ligam dentro do promotor do gene alvo e KANMX cassete de disrupção. Selecção de estirpes para válidoção é um tanto arbitrárias, mutantes porém priorizando que mostram um fenótipo forte e grupo funcional fornece um bom ponto de partida. Em seguida, hipersensibilidade a um produto químico é confirmada por meio de ensaios spotting, uma abordagem comum para medir a aptidão de mutantes de levedura. Para este fim, diluições em série de estirpes de levedura são manchados numa grelha no meio contendo a dose de produto químico adequado, bem como um controlo. Como um exemplo, podemos confirmar a interacção química genética de 5-FU com e Ar1 TRF5 mutantes do complexo TRAMP (Figura 5). Estes genes codificam componentes da exosome nuclear TRAMP. Notamos que a cepa rrp6, faltando o 3'-5 'exonuclease de TRAMP core, estava perdido em alta densidade coleção DMA do nosso laboratório. Na obtenção de um mutante rrp6 fresco confirmamos que rrp6 e 5-FU também exibir uma interacção química genética, que estabelece que a actividade TRAMP é necessária para tolerar 5-FU. Isto ilustraque a integridade das coleções supressão grandes podem ficar comprometida ao longo do tempo, tornando a manutenção DMA adequada e validação tensão crítica.
Nossa tela também identificaram mutantes em várias enzimas de reparo de DNA (incluindo RAD50, rad52 e Mre11) como 5-FU sensível. Pontuação da dimensão da colónia indicou a aptidão relativa destes mutantes a 10 uM 5-FU como 0,7, 0,65, e 0,42 em comparação com o tipo selvagem. Com base em nossos ensaios de mancha de confirmação (Figura 5), esses valores são uma provável subestimação, devido ao limitado alcance dinâmico de medição de fitness pelo tamanho da colônia de pontuação. Isso destaca uma segunda razão para confirmar de forma independente as interações por manchas de série: a magnitude de algumas interações genéticas químicos pode ser subestimado na análise de dados primários. Nossos resultados mostram que um produto químico tela genético baseado em crescimento realizada com 4.800 ~-deformação coleção eliminação haplóides, em triplicado, fornece resol adequada ution para isolar confiança interações químicas específicas genéticas.
Figura 1: Representação esquemática da. Genéticas interacções químicas deleções de genes que resultam em hipersensibilidade à perturbação químico permite a identificação de processos biológicos alvo de um produto químico. Vias (A) convergentes pode ser interrompida por qualquer deleção do gene (Genea) ou quimicamente (geneB). Individualmente, estes insultos celulares pode ser tolerado, devido à redundância inerente em vias biológicas. No entanto, a viabilidade das células em combinação resultante é comprometida em qualquer um fenótipo letal ou sinteticamente doente. (B) A eliminação de genes (geneC) críticos para mitigar o estresse induzido quimicamente também causar hipersensibilidade e indicar caminhos biológicos interrompidos por tratamento químico. "target =" _ jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho para Chemical tela genética (A) Determinação da dose sub-inibitória:. Parental estirpes de levedura são crescidas até à fase estacionária, diluída 1: 5.000, e propagação semeadas em meio YEPD sólidos contendo o aumento da dose química. A concentração mais elevada não tendo mais do que 10-15% de inibição de crescimento é seleccionado para o rastreio contra o DMA. (B) Systematic Chemical Seleção Genética: Usando uma variedade de alto rendimento fixando-robô do S. cerevisiae DMA é réplica semeados em meios contendo a concentração adequada de substância química de ensaio. As placas são incubadas à temperatura ambiente durante 24-48 h, fotografada, e o tamanho das colónias relativa determinada.ref = target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 :. Determinação da Concentração Sub-inibitório. (A) Crescimento de BY4741 células em meios sólidos contendo 5-fluouracil. Cultura saturada BY4741 diluído 1: 5000 e semeadas em concentrações crescentes de 5-fluorouracilo. Curva (B) Crescimento de BY4741 células em meios líquidos contendo 5-fluorouracilo. ~ 4 x 10 4 culas foram depositados em triplicado em concentrações crescentes de 5-FU e ODs foram medidos a cada 10 min durante 22 h.
Figura 4: Seleção Genética Química da 5-Fluorouracil. (A) S. cerevisiae matriz mutante de deleção replicado em agar de YEPD contendo 10 uM de 5-FU (direita) e controlo de DMSO (esquerda). (B) Os resultados do Chemical Seleção Genética: crescimento relativo de mutantes em 10 mM 5-FU em comparação com DMSO controle ordenada pela posição array. (C) O crescimento relativo de mutantes em 10 mM 5-FU em comparação com DMSO controle ordenada pela proporção de tamanho colônia. Um limiar proporção de ≤0.8 é indicado em ambos os gráficos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Validação de Química Genéticos Interações. As diluições em série de várias estirpes isoladas mutantes crescidos em DMSO de controlo (A), 10 uM de 5-FU (
| GO Categoria | P-valor | Genes identificados (hits) | # visitas | Número total de genes em GO Categoria |
| tRNA modificação uridine oscilação [GO: 0002098] | 2,24 x 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| transcrição, dependente de DNA [GO: 0006351] | 1,69 x 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ash1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| Tradução [GO: 0006412] | 4,28 x 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| tRNA posição oscilação uridine tiola�o [GO: 0002143] | 1,88 x 10 -4 | NCS6 URM1 TUM1 | 3 | 5 |
| regulação da transcrição, dependente de DNA [GO: 0006355] | 4,98 x 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ash1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| urmylation proteína [GO: 0032447] | 6,33 x 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| exportação de ARNm do núcleo em resposta ao stress térmico [GO: 0031990] | 2,04 x 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| poliadenilação dependente nuclear processo catabólico CUT [GO: 0071039] | 2,04 x 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| processo metabólico triptofano [GO: 0006568] | 2,15 x 10 -3 | Trp5 TRP3 | 2 | 3 |
| cedo endosome ao transporte Golgi [GO: 0034498] | 2,75 x 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| ribossômica pequena biogênese subunidade [GO: 0042274] | 3,63 x 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| modificação da cromatina [GO: 0016568] | 3,64 x 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ash1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| ATP processo metabólico [GO: 0046034] | 4,23 x 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| vacuolar-transporte de protões do tipo V ATPase montagem complexa [GO: 0070072] | 4,23 x 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| cromossoma localização [GO: 0050000] | 4,23 x 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| transporte mRNA [GO: 0051028] | 4,59 x 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| acidificação vacuolar [GO: 0007035] | 4,89 x 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| rRNA exportação de núcleo [GO: 0006407] | 5,63 × 10 <sup> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| endocitose [GO: 0006897] | 6,57 x 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 | 7 | 82 |
| vigilância mRNA nuclear de processamento de mRNA 3'-end [GO: 0071031] | 6,92 x 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA poliadenilação [GO: 0043629] | 6,92 x 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| poliadenilação dependente nuclear processo catabólico snoRNA [GO: 0071036] | 6,92 x 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| poliadenilação dependente nuclear processo catabólico snRNA [GO: 0071037] | 6,92 x 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| processo de biossíntese de triptofano [GO: 0000162] | 6,92 x 10 -3 | Trp5 TRP3 | 2 | 5 |
| inserção de proteínas em membrana ER [GO: 0045048] | 6,92 x 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| estabilização mRNA [GO: 0048255] | 6,92 x 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| resposta ao dano no DNA estímulo [GO: 0006974] | 7,05 x 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Categoria | P-valor | Genes identificados (hits) | em "> # visitasNúmero total de genes em GO Categoria | |
| poliadenilação dependente nuclear processo catabólico rRNA [GO: 0071035] | 8,46 x 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Tabela 1: ontologia Gene (GO) Caracterização de 5-fluorouracil Mutants sensível.
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Discussion
Esboçado aqui é uma abordagem para a geração de perfis de interação química-genética. O método é simples: comparando dimensões das colónias de cada estirpe em colecções de deleção de genes completos, na presença e ausência de uma substância química, todos os genes necessários para tolerar uma agressão química são identificados. Análise anotação enriquecimento da lista resultante de estirpes sensíveis pode então ser usada para fornecer uma visão sobre o modo de acção de produtos químicos. Enquanto este protocolo foi otimizado para quem gosta de levedura, ele também pode ser adaptado para uso com outras coleções microbianas supressão vestiu, como a E. coli Keio recolha, que tem sido utilizado com sucesso para sondar centenas de perturbações celular 26,27.
-Caracterização química genética em levedura e outros organismos está bem estabelecida. A maioria desses estudos basearam-se em ensaios de competição que quantificam reunidos mutantes de deleção por meio de análise de microarray ou de alto rendimento sequmentavam de códigos de barras genéticos únicos. Esta abordagem tem sido bem sucedida na produção de perfis químicos genética robustos de grandes bibliotecas químicas. A metodologia aqui descrita oferece uma alternativa útil para a análise química, genética de menores números de compostos de teste. O ensaio proporciona uma leitura simples que é menos do que o custo proibitivo de sequenciação de alto rendimento ou análise de microarray e não sofre de polarização de sequência. Enquanto o protocolo, conforme descrito requer um instrumento robótico para manipulação colônia, esses sistemas estão se tornando mais acessíveis e, alternadamente, o protocolo pode ser modificada para uso com ferramentas manuais de aprisionamento, exemplos dos quais foram incluídos na lista de materiais.
É importante estar ciente das limitações desta abordagem e caracterização genética química em geral. Em primeiro lugar, o composto deve ter um efeito sobre a viabilidade de enxertia de levedura, ou o organismo específico a ser utilizado. Enquanto muitos processos biológicos fundamentaise funções são bem conservadas entre eucariotas, interacções químicas específicas genéticas organismo pode variar amplamente, assim como a absorção de produtos químicos em células. Deve também notar-se que várias estirpes de deleção foram encontrados para ser sensível a vários tratamentos com drogas 8. Estes incluem os genes envolvidos no efluxo de drogas, função vacuolar e integridade da membrana. É importante levar em consideração a resistência multi-droga ao fazer conclusões no que diz respeito a modos directos e indirectos de acção.
A tela aqui descrito foi realizado usando a coleção eliminação haplóides, uma abordagem comum para a análise química-genética em leveduras. Existem hoje várias coleções de mutantes de levedura disponíveis para um novo auxílio na determinação do modo de um composto químico de ação. Isto inclui não só o homozigoto completa e colecções de deleção diplóides heterozigóticos, mas também mutantes de genes essenciais condicionais sensíveis à temperatura, a Decréased abundância por ARNm Perturbação (húmido) de levedura biblioteca mutante, e uma histona H3 e H4 sintético recolha mutante, que pode ser usado para investigar terapias moleculares baseados epigenética 3,4,28, Dada a incrível profundidade dos instrumentos disponíveis, a facilidade de a metodologia, e a infra-estrutura exigida limitada, esta abordagem fornece um formato acessível ao acesso a informação funcional rico no que diz respeito ao mecanismo de um composto químico.
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Acknowledgments
Pesquisa no laboratório CJN é apoiado por subsídios operacionais de NSERC, o Instituto Sociedade Canadense do Câncer Research (CCSRI), eo Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
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