Abstract
他の病態生理学的変化の中で、タバコの煙への慢性暴露は、微生物感染症および腫瘍発生に喫煙者の感受性の増加に関連している炎症および免疫抑制を引き起こす。 エクスビボのヒト末梢血単核細胞における受容体媒介性免疫応答の抑制（PBMC）を煙成分で処理されたメカニズムを研究し、タバコ製品への曝露の可能性のある長期的影響を評価するための魅力的なアプローチである。ここでは、細菌性リポ多糖、Toll様受容体4リガンドによって刺激したPBMCを使用してex vivoでのアッセイを実行するための方法を最適化した。全体煙馴化培地（WS-CM）、可燃タバコ製品製剤（TPP）、及びニコチンの効果はサイトカイン分泌に調査し、ex vivoでのアッセイでのPBMCによる細胞死滅を標的とした。者らは、分泌されたサイトカインIFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、及びIL-8および細胞内サイトカインIFN-47 ;, TNF-α、およびMIP-1αは、WS-CM-暴露PBMCにおいて抑制された。 K562標的細胞殺傷アッセイによって決定されるエフェクターPBMCの細胞溶解機能は、また、WS-CMへの曝露によって減少した。ニコチンはこれらのアッセイにおける最小有効だった。要約すると、我々は、生体外アッセイにおけるTPPの影響を評価するために改良されたアッセイのセットを提示し、これらの方法は、容易に関心のある他の製品をテストするために適合させることができる。
Introduction
心血管疾患（CVD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および癌1,2を含む慢性喫煙の健康への悪影響に対する知識ポイントの大幅なボディ。慢性の喫煙は、技術が病態生理学的効果の分子基盤を解明することにおいて有用であり、炎症および免疫抑制を引き起こすことが知られており、これらの変化は、喫煙3における微生物感染および癌の危険性の増大に寄与することが報告されている。 インビトロおよびエキソビボタバコの煙4-9（ 表1）と、様々なタバコ製品10,11の新たな規制を案内するための重要なツールとして認識されている。
例えば、我々は、全煙馴化培地（WS-CM）および総粒子状物質（TPM）などの可燃タバコ製品製剤（のTPP）をはるかに細胞毒性および有害にあることを実証している不燃性のTPPまたはニコチン12,13よりDNA。公表された研究と一致して、最近、可燃のTPPまたはニコチン12,13ことが報告された。発表された研究と一致して、我々は最近、可燃のTPPが著しい免疫抑制を引き起こしたことを報告した。これは、受容体（TLR）-ligands Toll様の抑制によって証明された、サイトカイン分泌を刺激し、細胞（K562） のex vivoモデル14でのPBMCによる殺傷を狙っ。タバコの煙によって誘発される疾患プロセスにおける炎症の重要性を考えると、タバコの煙の免疫調節効果を評価するためのアッセイ条件のさらなる最適化は、このレポートに記載されている。
ex vivoでのアッセイは、典型的に、細胞内および分泌されるサイトカインなどアッセイ14を殺すK562細胞における細胞傷害性T細胞およびNK細胞の細胞溶解機能を測定した。アッセイは、WS-CM及びニコチン及びPBMCのその後の刺激とのプレインキュベーションを含んだ3日間にわたってTLRアゴニストとの;最終的な読み出しは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、および/またはフローサイトメトリーを行っている。我々は、TLR-4受容体に結合し、細胞内サイトカインおよびサイトカインの分泌の産生をもたらすのPBMCを刺激し、細菌性リポ多糖（LPS）を利用する。単離PBMCを、細胞死アッセイ、およびIL-8の定量化のためのTPP、我々はまた、本発明の方法の免疫調節効果を評価するための様々なアッセイ手順の最適化に加えて。これらの方法は、他の研究課題に対処するために適用され、さらなる調節文脈でタバコ製品を評価するために洗練されてもよい。
表1 のin vitroの報告書を発表し、ex vivoでの方法はたばこ製品製剤のvarilus病態生理学的効果を研究するために使用される CS、タバコの煙媒体。 CSC、タバコの煙凝縮。 CSE、タバコの煙抽出物; ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ; GADPH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。定量PCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 RT、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 TS、タバコの煙。
| 著者（研究の年） | ラーンら （2004） | ムーディら （2004） | Oltmanns ら （2005） | Vayssier（1998） | Witherden ら （2004） | ビレルら （2008） |
| 細胞を使用 | ヒト気管支内皮細胞（BEAS-2B）、ヒト好中球 | 人間の肺胞上皮細胞（A549） | ヒト気道平滑筋細胞（HASMC） | ヒトpremonocytic U937細胞、ヒト単球 | 肺胞II型上皮細胞（ATII） | ヒト単球細胞株（THP-1）、ヒト肺マクロファージ |
| TPP使用 | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| メソッドの使用 | ELISA、定量PCR、マイグレーション、電気泳動移動度シフト | 免疫組織化学、電気泳動、Arrayscanキット、RT-PCR、ELISA | ELISA、RT-PCR、定量PCR、電気泳動 | ゲル移動度シフト | 光学顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、ELISA | 定量PCR、ELISA、E-toxateキット（Sigma）を、p65のプレートアッセイ（のTransAM）、電気泳動、種々の免疫アッセイキット |
| メジャー | IL-8、GM-CF、AP-1、NF-κB、移行 | ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、NF-κB、IL-8、pIがκB-α、GADPH | HO-1、GADPH、RANTES、IL-8、エオタキシン | ヒートショック/ストレスタンパク質（HSP / Hsp70が）、HF転写因子、NF-κB、TNF-α | 界面活性剤タンパク質（SP-A、SP-C）、IL-8、MCP-1、GRO-α、TNF-α、IL-1β、IFN-γ | IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP1-α、GRO-α、MAPK / JNK / ERKリン酸化、cJUN：DNA結合、グルタチオン、P65：DNA結合 |
| 最終結果 | CSEは、AP-1活性化の抑制を介してサイトカイン産生をダウンレギュレートする。 | H 2 O 2とCSC示差的炎症性サイトカインの放出を調節する、ヒストンデアセチラーゼ活性を低下させる、ヒストンタンパク質のアセチル化を高める。 | タバコの煙は、TNF-α、20％CSE少ないタバコの煙によるIL-8放出、エオタキシンおよびRANTESの阻害によって強化、HASMCからのIL-8の放出を引き起こすことがあります。 | TSは、Hsp70の過剰発現およびNFkBの結合活性およびTNF-α放出の阻害に関連したHFの転写因子を活性化した。 | 減少ATII細胞由来ケモカインレベルが肺胞を損なうLAR修理、タバコの煙によって誘発される肺胞の損傷および肺気腫に貢献する。 | データは、喫煙者は呼吸器感染症が増加している理由のための機構的説明を提供する。生得的反応の抑制は、IL-8の増加を伴う。 |
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Protocol
注：この研究を行うための書面によるインフォームドコンセントがグッド臨床プラクティスごとに、IRBの承認の下で地元の臨床研究ユニットで得られた。血液の処理は、PBMCおよび他の細胞培養実験の単離は、微生物学的に無菌用品および試薬を用いて、無菌条件下で行われる。
1. WS-CMの準備
- 以前に12を説明したように、WS-CMを生成します。
- 35-60-2、溶液にパフボリューム、秒でパフの間隔、及びパフ時間：以下の喫煙レジメンを使用したフェノールレッドを含まない1640培地（RPMI）ロズウェルパーク記念研究所を通じて4 3R4F参照タバコから煙を渡すことで、WS-CMを準備secである。各調製物を20mlのサンプルを生成する。
- 日付、時刻完了し、タバコの名前と番号付きラベルチューブ（S）。喫煙が完了した直後にC -80℃で500μlのアリコートに保管してください。
- 凍結されたWSのアリコートを分析以前12に記載のように、ニコチン、タバコ特異的ニトロソアミン、および多環式芳香族炭化水素のレベルを決定する-CM。
PBMCの2の分離
- （タバコ製品の非消費者である）健康なドナーからの新鮮な血液を収集ウェイクフォレストバプテスト保健IRB 15とは別の承認の下に下記のように新鮮な血液由来のPBMCを分離します。
- 血液バッグの到着前に、500mlの瓶、はさみ、分離バッファ、及びダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）（RT）、バイオセーフティーレベル2（BSL-2）細胞培養フード中で準備している。分離バッファは、光から保護されなければならない。
- 逆さまに血液バッグを持って、ちょうどそれがチューブの少なくとも3センチ残してクランプされた場所の下にチューブをカット。
- 500ミリリットルボトルからキャップを外し、ボトルの口の上にチューブを保持する。血液バッグをピックアップし、血液がTにバッグから自由に流れることができるようにそれを反転袋が空になるまで、彼は、ボトル。血液が気泡を作成しないようにまっすぐとして対ボトルの内壁上に流れるようになります。
- 血液の分離バッファの5：1の比率でボトル内に分離バッファを注ぐ。転倒、10回、しっかりとボトルをキャップとそっとそれを反転。室温で1時間、ライトをオフにインキュベートし、細胞培養フードで瓶のままにしておきます。
- 光、麦わら色の層は血の上に構築します。 50ミリリットルコニカルチューブに25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この層を除去する。血液を寄付被写体によって、300mlの - 収集量は50から異なる場合があります。
- RTで10分間、200×gでチューブを遠心。
- 暗い血色のペレットを残して、半透明の上清を吸引除去する。ペレットはルーズが、粘性になります。
- ピペットで15ミリリットルコニカルチューブに単離緩衝の3ミリリットル。
- 再懸濁ペレットに、Sに集め麦わら色の液体のすべての50ミリリットルのためにDPBSの20ミリリットルを追加TEP 2.1.5。ボルテックスは完全に混合し、複数の管からの再懸濁した液体を統合する。この液体は、血液細胞を懸濁含ま。
- トランスファーピペットで、ステップ2.1.8において分離緩衝液3mlに転写懸濁血液細胞を5ml。 2つの別個の層を作成するために、ゆっくりと静かに細胞懸濁液が含まれている15ミリリットルコニカルチューブを傾けます。最小限の加速とブレーキなしの室温で40分間400×gでチューブを遠心。
- 50ミリリットルコニカルチューブにしたPBMCを含む得られた濁った中間層（軟膜）を除去するために、転送ピペットを使用してください。その下に他の明確なレイヤを描画することは避けてください。各50ミリリットルコニカルチューブにせいぜい25ミリリットルを転送します。
- 細胞を洗浄するために（50ミリリットルコニカルチューブの全体の残りの容量を埋めるために、またはそれ以上）の低温のランニングバッファーの25ミリリットルを追加します。 4℃で10分間400×gで細胞を遠心します。
- ランニング緩衝液10mlのペレットを再懸濁。これはPBMCを含まれています。細胞をカウントし、IMを使用凍結氷の上に置くmediatelyか。
3.凍結とのPBMCを解凍
- 遠心分離機400×gで10分間のステップ2.1.13に回収したPBMCを。
- 製造者の指示に従ってイソプロピルアルコールで冷凍コンテナを埋める。注意：イソプロピルアルコールは可燃性および急性毒性である。
- 20％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有するRPMI 1640培地（4℃）でペレットを再懸濁する。これは凍結培地RPMI 1640である。約5×10 7細胞/ mlを有するサスペンションをもたらす凍結培地の量でペレットを再懸濁する。凍結のために利用可能な細胞の数が異なります。
- の2mlクリオチューブに細胞懸濁液の1mlアリコートを分配し、冷凍コンテナにクライオチューブを置き。 O / Nを格納し、クリオチューブを削除し、に格納する転送するために-80℃の冷凍庫にクライオチューブに冷凍コンテナを置きます-190℃〜-150℃の極低温冷凍機。
- 低温貯蔵からのクライオチューブを外し、37℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら急速に解凍。
- 直ちに10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含有する10ミリリットルRPMI 1640完全培地（4℃）にて15mlコニカルチューブにクライオチューブ中で解凍したPBMCを転送する。解凍したクライオチューブの内容物は、最大の細胞生存率15を得ることができる限り速やかに転送されるべきである。
- 10分間400×gでのPBMCを遠心。
- 5ミリリットルRPMI 1640完全培地でペレットを再懸濁し、細胞を数える。
- トリパンブルー排除法のような確立された方法により細胞生存率を測定する。 95％ - 一般に、この方法では、細胞生存率は約90である。 PBMCを今の実験で使用する準備が整いました。
4.細胞死の決定
注：ここに記載されている希釈はこのSTUのためのものでありDY。希釈は、それに応じて変更することができる。
- 以下に示すように、100μl/ウェルの全体積のRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。
- 以下の濃度にWS-CMを希釈：0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、（WS-CM中のニコチン含有量に基づく）、等のニコチン単位の5μg/ mlの12。
- 100、200、500、750、1000,2000、および3000 / mlの以下の濃度にRPMI培地中でニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。
- よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。
- 本研究の目的のために、上記のようにプレートの二組を準備。プレートを覆い、24時間、37℃で3時間、5％CO 2のための一つのプレートに1つのプレートをインキュベートする。必要に応じて時間点を調整します。 氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。
- 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7-アミノD（7AAD）5μlのに続いてバッファを実行しているの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。
- クラスターチューブにバッファを実行している100μlのを追加します。クラスターチューブ、プレートの各ウェルからの細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。
- 解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性細胞の割合を決定します。
5. EC 50の決定
- WS-CMとニコチンのEC 50値は、PBMCの7AAD陽性染色によって決定される。
- EC 50値は、濃として定義されentrationれる細胞の50％が24時間のアッセイにおいて、もはや生存可能ではなく、値は、等ニコチン単位/ mlのμgのように表現される。
- この研究の目的のために、EC 50値は、それぞれ、WS-CM及びニコチン1.56 / mlのと1650μgの/ mlであると決定された。
6.分泌されたサイトカイン
注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。
- 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。
- 以下の濃度にニコチンを希釈：100、200、500、750、1000,2000、及び3000μg/ mlの。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。
- よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。
- プレートを覆い、37℃で3時間および5％CO 2でインキュベート。
- 、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスし、最後の氷冷200μlのバッファーを実行し、洗浄工程をもう一度繰り返しで細胞を懸濁して室温で細胞を洗浄。
- RPMI完全培地200μlを追加し、洗浄工程をもう一度繰り返します。
- 各ウェルに10μg/ mlのLPS培地200μlを追加します。
- プレートを覆い、4時間、24時間、48時間、または37℃で72時間、5％CO 2でインキュベート。必要に応じてインキュベーション時間を調整します。
- 3分間300×gでプレートを遠心します。
- ステップ7および8でアッセイを実行するために-80℃の冷凍庫でよく各店舗からの上清175μlをしてください。
7.サイトメトリービーズアレイアッセイ
<OL>8. IL-8 ELISA
- ステップ6.10から細胞上清を解凍し、IL-8 ELISAで使用しています。製造業者の指示に従ってELISAアッセイを実行します。
9.細胞内染色およびフローサイトメトリー
注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。
- 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。
- 2、10、50、100、500、2000、及び4000 / mlの：同じプレートにおいて、以下の濃度にニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性があり、環境にハザルdous。
- /ウェル1×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。
- プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。
- 氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。
- プレートにRPMI完全培地200μlを追加し、洗浄ステップをもう一度繰り返します。
- RPMI完全培地を使用した2μL/ mlのGolgiPlugの使用濃度および10μg/ mlのLPSを準備し、各ウェルに200μlを添加する。
- 37℃で6時間、5％CO 2、プレートをインキュベートする。
- ステップ9.8の終了時に、バッファー（4℃）を実行し、300で回転で細胞を洗浄4℃で3分間XG。
- 各ウェルにのCytofix100μlのを追加し、4℃で20分間インキュベートする。
- 4℃で3分間300×gで1倍Permwash（4℃）でステップ9.9で説明したように、細胞を3回洗浄する。
- に以下の抗体の1の各5μlの各ウェルに45μLの1x Cytopermをの追加各ウェル：TNF-α-アレクサフルオロ488、IFN-γV500、MIP-1αPE。 30分間4℃でインキュベートする。
- 1X Permwash（4℃）、4℃で3分間300×gでバッファー（4℃）を実行していると1時間にステップ9.9で説明したように、細胞を2回洗浄します。
- 2％パラホルムアルデヒド（4℃）200μlで細胞を再懸濁。 12×75mmのチューブに細胞を移し、フローサイトメーターでサンプルを分析する。注意：ホルムアルデヒドは急性毒性と健康被害、腐食性がある。
10. K562キリングアッセイ
NOTE：K562細胞を増殖されるべきであるRPMI完全培地で37℃、5％CO 2での培養では、それらは、アッセイの前に80％のコンフルエンスに達するまで。
- バイアルにDMSOを18μLを追加することによって、スクシンイミジルエステル（CFSE）原液カルボ5 mMのを準備します。
- 各ウェルに対して所望の等ニコチン単位またはニコチン濃度を達成するために、100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。
- /ウェル1.5×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地にPBMCの100μlのを追加。 WS-CMまたはニコチンでの細胞の総容積は200μl/ウェルであろう。
- プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。
- 室温で8分間400×gでDPBSと遠心機の10ミリリットルを追加することによって、K562細胞を洗浄。
- DPBS 10mlの細胞を再懸濁し、K562細胞を数える。
- CFSE workiを準備1ミリリットルのDPBSにCFSEストック溶液1μlを追加することでNGソリューション。
- 2×10 7細胞- 1を含むK562細胞懸濁液1mlにCFSEワーキング溶液1mlを加える。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。
- すぐにFBSの200μlを添加する。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。
- RPMI完全培地の10ミリリットルを加え、室温で8分間400×gでチューブを遠心する。
- RPMI上清を除去し、ペレットを破るし、RPMI完全培地10mlで細胞を再懸濁し、CFSE標識K562細胞を数える。
- RTで3分間300×gでプレートを遠心分離することによりPBMCを洗浄する。液体をデカントすることによって、上清を吸引除去する。カバーを取り付け、プレートの底をボルテックス。 RPMI完全培地200μlを加え、洗浄工程をもう一度繰り返します。
- 各サンプルPBMCプレートのウェル、さらに私に：1：15（1.5×10 6のPBMC10万K562s）の比率でCFSE標識K562細胞を追加37℃で5時間、5％CO 2のためncubate。
- RTで3分間300×gで遠心分離することにより細胞ミックスを洗ってください。液体を廃棄することにより、上清を吸引除去する。カバーを置き、プレートの底をボルテックス。
- ランニング緩衝液200μlを加え、ステップ10.14 1より多くの時間に記載されて洗浄工程を繰り返します。
- 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7AAD5μlのに続いて実行されているバッファの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。
- 各ウェルにバッファを実行している100μlのを追加し、クラスターチューブにプレートの各ウェルから細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。
- 解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性とCFSE陽性細胞の割合を決定します。
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Representative Results
結果は、平均（4ドナーサンプル）の平均値±標準誤差として示した。処理および未処理の対照サンプルとの間のスチューデントのt検定は、対応するコントロールとのすべての治療のためにExcelソフトウェアならびにt検定比較を用いて行った。統計的有意性は次式で示された：*、P <0.05; **、P <0.005。 ***、P <0.0005。
WS-CMおよびニコチンへの曝露の効果を測定するために、PBMCを3時間または24時間、WS-CMおよびニコチンの異なる濃度で処理した。細胞死は、二本鎖核酸にインターカレート7AADとして、堅牢で信頼性の高い7AAD染色法で測定し、16瀕死または死細胞の細胞膜に浸透することができる。細胞死の用量依存的増加は、等ニコチンユニット（ 図1A）の4 / mlの近くで検出され、80％の細胞死と、24時間後にWS-CMで観察された。細胞死の同程度であったのみ3000 / mlのニコチン（ 図1B）で指摘した。我々は、サイトカイン誘導および標的細胞を死滅させる能力のそれらの効果を評価するために、WS-CM及びニコチンで3時間攪拌したPBMCを露出しているので、WS-CMは、3時間の処置後に有意な細胞毒性を引き起こすかどうかを決定する必要があった。 PBMCを有意な毒性を経験しなかったWS-CMの等ニコチン単位の5μg/ mlので処理（<5％; 図1A）。 3時間ニコチンによる治療は、2000 / mlの（ 図1B）で測定可能（8％）細胞死を引き起こした。このように、示された用量および治療期間でのWS-CMまたはニコチンへの曝露は、実験条件下で有意な細胞毒性を引き起こさなかった。
免疫調節効果を測定するために、PBMCを、異なる時間LPSで刺激し、そして分泌されたサイトカインCBAアッセイにより測定した。 LPS刺激時間を最適化するために、我々は、2、4時間LPS刺激したPBMCに露出4時間、48時間、72時間、および分泌されるサイトカインを測定した。例えば、24時間LPS刺激は、サイトカインIL-6およびIL-8（ 図2）の最大分泌が得られ、そして長期間、サイトカインのさらなる増加（IL-6）または減少（IL-8）をもたらさなかった分泌。同様の結果は、例えばIL-10、IL-1βおよびTNF-αなどの他の分泌されたサイトカインを用いて得られた（データは示さず）。
パイロットの時間経過実験は、LPSによるTLR-4刺激に応答におけるサイトカインの最大の生産は、24時間によって起こることが示唆され、従って、分泌されるサイトカインは、その後のすべての実験において、24時間で測定した。 WS-CMおよびニコチンでの処置は、LPSによるTLR-4受容体の刺激に続いて、分泌されるサイトカイン（ 図3）の用量依存的な減少をもたらした。 WS-CMを用いた治療は、IFN-γ（ 図3A）の深遠な減少をもたらしたTNF（ 図3B）、IL-10（図3C <低、等ニコチン単位（1.56μg/ ml）をで> /強い）およびIL-6（ 図3D）。サイトカインの抑制は、また、ニコチンと明らかであった。しかし、ニコチン性サイトカインの抑制は有意に高い用量で、および個々のサイトカイン間で変動抑制の程度で生じた。 IL-6は試験した最高濃度（4 mg / ml）で（Figurie 3D）に抑制したのに対し、例えば、IFN-γは、有意には50μg/ mlでニコチンを抑制するように見えた。次に、ELISAアッセイを用いて、同じサンプル中のIL-8レベルを測定した。 IL-8分泌を効果的にWS-CM-暴露PBMCにおいて抑制された。ニコチンの抑制効果は、2mg / mlの（ 図4）で有意であった。
細胞内サイトカインのレベルは、LPSで刺激時にWS-CM-とニコチン処理した細胞で定量した。以前、私たちは3日間のPBMCを刺激し、測定するために、インキュベーションの最後の6時間の間にGolgiplugを追加しました細胞内サイトカイン14。私たちは現在、大幅に6時間と測定された細胞内サイトカイン陽性細胞（ 図5）の合計にプラグLPSおよびゴルジでの刺激を組み合わせることにより、潜伏期間を減少させた。 図5は、（IFN-γ陽性細胞の用量依存％の減少を示しているMIP-1α陽性細胞（ 図5C）の用量依存的減少パーセントは、WS-CM中で観察された図5A）、ニコチンおよびWS-CM-両方においてTNF-α陽性細胞（ 図5B）は 、PBMCを露出-exposed PBMCを。このアッセイでは、下側の等ニコチン単位（1.56μg/ ml）を少なくともWS-CMへの曝露後の細胞内のサイトカイン陽性細胞の数の減少を観察した。分泌されたサイトカインおよび細胞内サイトカインアッセイの両方は、IFN-γレベルまたはIFN-γ陽性細胞の点で同様の結果を示した。
機能的な措置、WS-CM-とニコチンの能力として標的K562細胞を死滅させる処置したPBMCを決定した。 図6Aは、制御によって（CFSE標識K562）細胞死滅は、WS-CM露出対象の7AAD陽性染色の代表的なフローサイトメトリーの生データを示しており、ニコチン処置したPBMC。ボックス内の数字はパーセント7AAD陽性CFSE標識K562細胞を表す。 1.56 / mlのへの曝露は、WS-CMは、対照および低用量と比較したPBMCエフェクター細胞の殺傷能力を低下させた。低および高用量でのニコチン処置は、細胞殺滅を妨害しなかった。 図6Bは、単一の実験で多数のドナーからの殺傷率K562細胞の用量依存的減少を示す。
WS-CM濃度（μg/ ml）およびニコチン性（μg/ ml）を、等ニコチン単位の濃度の増加への曝露後のPBMCの図1.細胞死。 （A）および3時間および24時間（B）のためのニコチンWS-CMで処理した。細胞死は、7AAD染色によって測定した。各点は、代表的な実験からの4人のドナーの平均±SDエラーバーを表します。統計的有意性は次式で示されます：* P <0.05; ** P <0.005、*** P <0.0005。
異なる時点でLPSで刺激されたPBMCによるIL-6およびIL-8の分泌は、図2。PBMCを4時間、24時間、48時間、および72時間LPSで刺激した。 IL-6およびIL-8のレベルを細胞培養上清中のサイトカインは、ヒト炎症性サイトカインキット（CBAキット）を用いて測定し、フローサイトメトリーを行った。これらのデータは、3つの異なるドナーからのPBMCを用いて、2つの独立した実験の一つからの平均±SDエラーバーを表す。統計的にSignificanceは次式で示されます：* P <0.05; ** P <0.005。
LPS刺激後のWS-CM濃度（μg/ ml）およびニコチン性（μg/ ml）を、等ニコチン単位の増加濃度で処理したPBMCによるサイトカイン分泌の図3削減。PBMCは、WS-CMおよびニコチンの異なる濃度に暴露した3時間および24時間LPSで刺激。 IFN-γ（A）のレベルは、TNF（B）、細胞培養上清中のIL-10（C）、およびIL-6（D）サイトカインは、Th1 / Th2のCBAアッセイを用いて測定し、フローサイトメトリーを行った。このデータは、4つの異なるドナーからのPBMCを用いた3回の独立した実験の一つからの平均±SDエラーバーを表す。統計的有意性は次式で示されます：* P <0.05; ** P <0.005。 *** P <0.0005。より高いCON WS-CMのcentrationsも*** P <0.0005と統計学的に有意であった。
LPS刺激後のWS-CM濃度（μg/ ml）およびニコチン性（μg/ ml）を、等ニコチン単位の増加濃度で処理したPBMCによるIL-8分泌の図4の減衰。PBMCは、WS-CMおよびニコチンにさらされた、 24時間LPSで刺激し、IL-8をELISAによって測定した分泌。これらのデータは、4つの異なるドナーからのPBMCを用いた3回の独立した実験の一つからの平均±SDエラーバーを表す。統計的有意性は次式で示されます：* P <0.05; ** P <0.005。 *** P <0.0005。 WS-CMのより高い濃度も*** P <0.0005と統計学的に有意であった。
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WS-CM濃度（μg/ ml）およびニコチン性（μg/ ml）を、等ニコチン単位の増加濃度で処理したPBMC中の細胞内のサイトカイン陽性細胞の図5の低減。PBMCは、WS-CMおよびニコチンの様々な濃度に暴露した3時間と6時間LPSとGolgiplugで刺激。 WS-CMとニコチンのための車両制御は、RPMI完全培地であった。細胞内IFN-γ陽性（A）、TNF-α陽性（B）、及びMIP-1α陽性（C）細胞をフローサイトメトリーによって定量化した。これらのデータは、4つの異なるドナーからのPBMCを使用して、4つの独立した実験の一つからの平均±SDエラーバーを表す。統計的有意性は次式で示されます：* P <0.05; ** P <0.005。 *** P <0.0005。 WS-CMのより高い濃度も*** P <0.0005と統計学的に有意であった。
WS-CM濃度（μg/ ml）およびニコチン性（μg/ ml）を、等ニコチン単位の増加する濃度に暴露された能力を殺したPBMC標の図6低減。PBMCを3用のWS-CMおよびニコチンの示された濃度で処理した時間、そしてCFSE標識K562細胞を、標的細胞として添加し、さらに5時間インキュベートした。細胞を7AADで染色し、フローサイトメトリーの能力を殺す測るために使用されたされた。 図6（a）は、ゲート付きのボックスに示されている％の殺害との結果が代表的なフローサイトメトリーを示しています。アローが露出1.56μg/ mlの中パーセント殺傷を減少示しWS-CM。 図6Bは、4つの異なるドナーからのPBMCを使用して、4つの独立した実験からの代表的な平均値±SDエラーバーを示しています。統計的有意性は次式で示されます：** P <0.005。 *** P <0.0005。 WS-CMのより高い濃度も統計学的に有意なウィットたH *** P <0.0005。
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Discussion
我々は、他の以前のTPPによるPBMCの処理は、サイトカインおよび14を殺し、標的細胞として機能的措置の発現および分泌を含むいくつかの応答を抑制することを実証した。前作に記載された実験の方法はより長いインキュベーション時間を必要とし、大きさが14で控えめだった。基本のためにこの魅力的なex vivoでモデルの潜在的な応用を考えると応用研究、我々はこれらのマルチステップ生物学的ア ッセイにおいてアッセイパラメータのいずれかが最適化することができるかどうかを調べた。ここでは、TPP処理エクスビボで PBMCモデルを用いてTLR媒介性免疫応答を測定するための簡便法を提示する。
実行可能なPBMCの単離これらのex vivoアッセイのための重要な要件です。潜在的なドナーにおける個々の変動と生理的な状況を考えると、それが応答するのPBMCを得ることが理想的です。本研究の目的のために、我々は隔離以前に発表された方法15を使用して、一般的に健康な成人被験者からDのPBMC。さらに、ドナー間のばらつきを最小限にするために、本研究では、我々はアレルギー、感染症を有するものを除外し、人やどんな処方箋を服用またはアスピリンなどの一般用医薬品た。それはその後の実験における細胞の最適な生存率および機能性を保証するように、また、新たに採取した血液からのPBMCの単離は、望ましい。
67-72時間、TLRアゴニストで刺激を利用した従来の方法は、細胞内サイトカインおよび分泌されたサイトカイン14を測定した。 （WS-CMまたはニコチン無しの対照条件下で）TLR刺激細胞におけるサイトカイン分泌の時間経過は、最大分泌が24時間で生じたことを示唆した。さらに、本発明者らは、TLRアゴニストおよびGolgiplugとのインキュベーションを一緒にし、細胞内サイトカインを測定するための6時間の合計インキュベーション時間を減少させた。これは、測定するために別々のアッセイを必要としますがサイトカイン陽性細胞は、データは、従来の方法14に比べ、より堅牢である。以前の結果と一致して、WS-CMが強く細胞内および分泌されたサイトカインの誘導を抑制した。したがって、これらの変更は実質的に低減するためのアッセイ時間を導いており、文献に記載されているような非常によく似た結果が得られた。我々は、サイトカインレベルを評価するためにフローサイトメトリー及びELISA法を利用しているが、このようなリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCRの）のような他の技術もまた、相補的技術として利用することができる。
歴史的に、放射性標識された方法（ 例えば 、51 Cr放出アッセイ）を利用して、エフェクターのPBMCによる細胞死滅をターゲットにしています。このレポートに記載された方法は、放射能の使用を排除し、その存在をフローサイトメトリーによりモニターすることができる蛍光色素をロードする細胞を使用する。記載された方法の別の利点は、本明細書では、比較的迅速であり、adapte得ることであるハイスループットアッセイにdを。標的およびエフェクター細胞のインキュベーション期間は5時間であるので、このアッセイは、8時間で完了することができる。これは、数日間にわたってPBMCおよび活性化/刺激のサブタイプの単離を必要とするより複雑な他の公開された方法との対比で、またはNK細胞およびK562細胞複合体の分析は、細胞毒性17,18を監視する。現在の方法の別の利点は、より大きな柔軟性を与えるエフェクター細胞として直接凍結保存したPBMCを使用していることである。
要約すると、我々は容易に異なる化合物を試験するために適用することができる可燃TPP処理したPBMCにおけるTLR媒介免疫応答の効果を決定するためにいくつかのアッセイが記載されている。凍結保存された成分の使用は、かなりの柔軟性を可能にし、一緒にそのようなフローサイトメトリーのような確立された技術を、CBAアッセイ、およびELISAを、堅牢で一貫性のある結果は、異なる研究室全体で速やかに得ることができオラトリオ。
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Acknowledgments
この作品は、医学のウェイクフォレスト大学医学部との共同研究契約の下で、RJレイノルズ·タバコ·カンパニー（RJRT）によって資金を供給されている。 GLプラサドはRJRTのフルタイムの従業員である。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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