Abstract
Entre outras alterações fisiopatológicas, a exposição crónica ao fumo do cigarro provoca a inflamação e a supressão imunitária, que têm sido associados ao aumento da susceptibilidade dos fumadores a infecções microbianas e a incidência de tumores. Ex vivo supressão de respostas imunes mediadas por receptores em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) tratadas com constituintes do fumo é uma abordagem atraente para estudar os mecanismos e avaliar os possíveis efeitos a longo prazo da exposição a produtos do tabaco. Aqui, nós optimizado métodos para realizar ensaios ex vivo utilizando PBMC estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano, um receptor-ligando 4 de tipo Toll. Os efeitos do meio condicionado de fumo todo (WS-CM), a preparação de produtos de tabaco combustível (TPP), e nicotina foram investigados sobre a secreção de citocinas e alvo morte celular por PBMC nos ensaios ex vivo. Mostramos que as citocinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, e IL-8 e citocinas intracelulares IFN-47 ;, o TNF-α, e MIP-1α foram suprimidos em PBMC WS-CM-expostos. A função citolítica de PBMC efectoras, conforme determinado por um ensaio de matar células K562 alvo também foi reduzida por exposição a WS-CM; nicotina era minimamente eficaz nestes ensaios. Em resumo, é apresentado um conjunto de ensaios melhorados para avaliar os efeitos de UTEs em ensaios ex vivo, e estes métodos podem ser facilmente adaptados para testar outros produtos de interesse.
Introduction
Um corpo substancial de pontos de conhecimento para os efeitos adversos para a saúde de tabagismo crônico, incluindo a doença cardiovascular (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e câncer de 1,2. Fumar do cigarro crónica tem sido conhecido por causar inflamação e supressão imune, e estas alterações estão relatados para contribuir para o aumento do risco de infecção microbiana e o cancro em fumadores 3. Estudos in vitro e ex vivo, as técnicas são úteis para elucidar a base molecular dos efeitos patofisiológicos de fumaça de cigarro 4-9 (Tabela 1) e são reconhecidos como importantes ferramentas para orientar a regulamentação emergente de vários produtos do tabaco 10,11.
Por exemplo, nós demonstramos que inflamáveis produtos do tabaco (UTEs), como meio de toda com ar-fumo (WS-CM) e material particulado total (TPM) são muito mais citotóxica e prejudicial paraDNA de UTEs não-combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, foi recentemente informou que UTEs combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, que recentemente informou que UTEs combustíveis causou acentuada imunodepressão. Isto foi demonstrado pela supressão da Toll- como receptores (TLR) -ligands, estimulou a secreção de citocinas, e célula-alvo (K562) matando por PBMC em um modelo ex vivo 14. Dada a importância da inflamação em processos de doença induzida por fumo de cigarro, uma maior optimização das condições de ensaio para avaliar os efeitos imunomoduladores do fumo do cigarro é apresentado no presente relatório.
Os ensaios ex vivo tipicamente medido intracelular e citocinas, bem como a função citolítica das células T citotóxicas e de células K562 NK em ensaios de morte 14 segregada. Os ensaios envolvidos pré-incubação com WS-CM e nicotina e subsequente estimulação de PBMCs com agonistas de TLR durante um período de 3 dias; as leituras finais são realizadas utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) e / ou citometria de fluxo. Utilizamos o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), que se liga a receptores TLR-4 e estimula as CMSPs resultando na produção de citocinas intracelulares e de secreção de citocinas. Além disso a optimização das diversas etapas do ensaio para avaliação dos efeitos imunomoduladores da UTEs, também presentes métodos para isolar as PBMC, ensaios de morte celular, e a quantificação de IL-8. Estes métodos podem ser aplicados para abordar outras questões de pesquisa e mais refinado para avaliar os produtos do tabaco no contexto regulamentar.
Tabela 1. relatos de in vitro e ex vivo Publicado métodos usados para estudar varilus efeitos fisiopatológicos de preparações de produtos de tabaco CS, médio fumaça de cigarro.; CSC, fumaça de cigarro condensado; CSE, cigarro extrato de fumo; ELISA, enzima-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; qPCR, a reação em cadeia da polimerase quantitativa; RT, em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa; TS, fumo de tabaco.
| Autor (ano de estudo) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell, et al. (2008) |
| As células usadas | Células do endotélio brônquicas humanas (BEAS-2B), neutrófilos humanos | Células epiteliais alveolares Humanos (A549) | Vias aéreas células musculares lisas Humanos (HASMC) | As células U937 premonocytic Humanos, monócitos humanos | Alveolares tipo II células epiteliais (ATII) | Monocytic HumanoA linha de células (células THP-1), os macrófagos de pulmão humano |
| TPP usado | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Método usado | ELISA, qPCR, migração, mudança electromobility | Imuno-química, electroforese, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforese | Mudança Gel-mobilidade | A microscopia óptica, microscopia eletrônica, eletroforese, ELISA | qPCR, ELISA, kit de E-toxate (Sigma), o ensaio de placa de p65 (TransAM), electroforese, vários kits de imunoensaio |
| Medida | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, a migração | Acetiltransferases de histona, desacetilases de histonas, NF-kB, IL-8, pi-kB α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina | Proteínas de choque térmico / estresse (HSP / Hsp70), fator de transcrição HF, NF-kB,TNF-α | Proteína tensioactiva (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, o TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilação de ERK, cJun: ligação de ADN, a glutationa, o p65: ligação de ADN |
| Resultado final | CSE regula negativamente a produção de citocinas por meio de supressão da activação de AP-1. | H 2 O 2 e CSC melhorar a acetilação de proteínas histona, diminuir a actividade de histona-desacetilase, diferencialmente regulam a libertação de citocina pró-inflamatória. | A fumaça do cigarro pode causar a liberação de IL-8 de HASMC, reforçada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 libertação, a inibição da eotaxina e RANTES por fumaça de cigarro. | TS activado fator de transcrição HF, que foi associado com Hsp70 superexpressão e inibição da actividade NFkB e TNF-α liberação vinculativo. | Redução ATII níveis de quimiocinas derivadas de células compromisso alveoreparação lar, contribuindo para o cigarro induzida pelo fumo dano alveolar e enfisema. | Dados fornecer explicação mecanicista para infecções respiratórias por que os fumantes têm aumentado. Supressão da resposta inata é acompanhada por um aumento na produção de IL-8. |
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Protocol
NOTA: consentimento informado por escrito para fazer este estudo foi obtido em uma unidade de pesquisa clínica local, sob aprovação IRB, por Boas Práticas Clínicas. Processamento do sangue, o isolamento de PBMC e as outras experiências de cultura de células são realizadas em condições estéreis, utilizando reagentes e fornecimentos microbiologicamente estéreis.
1. Preparação WS-CM
- Gerar WS-CM como descrito anteriormente 12.
- Prepare WS-CM, passando fumaça de quatro 3R4F cigarros de referência através de Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol usando o seguinte esquema de fumar: 35-60-2, o volume de sopro em ml, intervalo de sopro em segundo, ea duração do sopro no segundo, respectivamente. Cada preparação gera uma amostra de 20 ml.
- Tubo (s) etiqueta com data, hora concluída, eo nome e número de cigarros. Armazenar os 500 mL alíquotas a -80 ° C imediatamente após o tabagismo está concluída.
- Analise alíquotas de WS congelados-CM Para determinar os níveis de nicotina, nitrosaminas específicas do tabaco, e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, tal como anteriormente descrito 12.
2. Isolamento de PBMC
- Coletar sangue fresco de doadores saudáveis (que são não-consumidores de produtos de tabaco) Isolar PBMC de sangue fresco conforme descrito abaixo em uma aprovação separada do Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Antes da chegada da bolsa de sangue, possuem uma garrafa de 500 ml, uma tesoura, tampão de isolamento, e salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) pronto em um nível de segurança biológica 2 (BSL-2) cultura de células de capa. Tampão de isolamento deve ser protegido da luz.
- Mantenha o saco de sangue de cabeça para baixo e cortar o tubo logo abaixo onde foi preso deixando pelo menos 3 cm de tubagem.
- Retire a tampa da garrafa de 500 ml e mantenha o tubo acima da abertura do frasco. Pegue o saco de sangue e inverter para permitir que o sangue flua livremente do saco em tele garrafa até que o saco está vazio. Permitir que o sangue flua para a parede interior da garrafa contra directamente para baixo a fim de evitar a criação de bolhas.
- Pour tampão de isolamento para dentro da garrafa a uma proporção de 1: 5 de tampão de isolamento de sangue. Tapar o frasco firmemente e suavemente invertê-lo, a cargo de ponta a ponta, 10 vezes. Deixar o frasco dentro do capuz de cultura de células a incubar com as luzes apagadas, durante 1 h à TA.
- A, camada de cor de palha luz vai construir acima do sangue. Remover esta camada usando uma pipeta de 25 ml sorológico em 50 ml tubos cônicos. O valor arrecadado pode variar 50-300 ml, dependendo do assunto que doou sangue.
- Centrifugar os tubos a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante translúcido, deixando um pelete de cor de sangue escuro. O pellet será solto, mas viscoso.
- Pipetar 3 ml de tampão de isolamento em tubos cónicos de 15 ml.
- Para ressuspender o sedimento, adicionar 20 ml de DPBS para cada 50 ml de líquido cor de palha recolhidos em step 2.1.5. Vortex para misturar bem, e consolidar o líquido novamente suspensas a partir de vários tubos. Este líquido contém suspenso células sanguíneas.
- Com uma pipeta de transferência, a transferência de 5 ml de células sanguíneas em suspensão em 3 ml de tampão de isolamento no passo 2.1.8. Inclinar o tubo cónico de 15 ml que contém a suspensão de células lenta e suavemente para criar duas camadas separadas. Centrifugar os tubos a 400 xg durante 40 min à temperatura ambiente com o mínimo de aceleração e sem travão.
- Usar uma pipeta de transferência para remover a camada resultante turva meio (buffy coat) contendo PBMCs em um tubo de 50 ml. Evite desenho outras camadas claras abaixo dela. Transferência não mais do que 25 ml em cada tubo de 50 ml.
- Adicionar 25 ml de tampão corrente fria (ou mais para preencher todo o volume restante do tubo de 50 ml) para lavar as células. Centrifuga-se as células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de corrida. Este contém PBMC. Contar as células e usar immediata ou colocar no gelo para congelar.
3. congelamento e descongelamento do PBMC
- Centrifugar as PBMCs que foram recolhidas no passo 2.1.13 durante 10 min a 400 x g.
- Encher o recipiente de congelamento com álcool isopropílico acordo com as instruções do fabricante. CUIDADO: O álcool isopropílico é inflamável e altamente tóxico.
- Ressuspender o sedimento com meio RPMI 1640 (4 ° C) contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esta é meio RPMI 1640 congelação. Ressuspender o sedimento com uma quantidade de meio que irá resultar numa suspensão com cerca de 5 x 10 7 células / ml de congelação. O número de células disponíveis para a congelação irá variar.
- Distribuir aliquotas de 1 mL de suspensão de células em tubos criogénicos de 2 ml e colocar os tubos criogénicos de congelação no recipiente. Coloque o recipiente de congelamento com criotubos em freezer a -80 ° C para armazenar O / N e, em seguida, remover os criotubos e transferir para armazenar em umcongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C.
- Remover o tubo criogénico de armazenamento criogénico e descongelar rapidamente com agitação suave num banho de água a 37 ° C.
- Transferir imediatamente as PBMCs foram descongeladas em tubo criogénico a um tubo de 15 ml com 10 ml de meio RPMI 1640 completo (4 ° C) contendo 10% de FBS, 1% de Pen / Strep e 1% de L-glutamina. O conteúdo do criotubo descongelado deve ser o mais rapidamente possível transferido para obter a viabilidade celular máxima 15.
- Centrifuga-se as PBMC a 400 xg durante 10 min.
- Ressuspender o sedimento com 5 ml RPMI 1640 completo e contar as células.
- Medir a viabilidade celular por meio de métodos estabelecidos, tais como o método de exclusão de azul de tripano. Geralmente a viabilidade celular, com este método é de cerca de 90-95%. As PBMC agora está pronto para usar em experiências.
4. morte celular da Determinação
NOTA: As diluições são listadas aqui para o propósito deste study. As diluições podem ser alteradas em conformidade.
- Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 uL / poço, como indicado abaixo.
- Diluir WS-CM às seguintes concentrações: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 ug / mL de unidades de equi-nicotina (com base no teor de nicotina no WS-CM) 12.
- Diluir nicotina em meio RPMI com as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente.
- Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
- Para o propósito deste estudo, preparar dois conjuntos de placas como anteriormente. Cobrir as placas e incubar uma placa durante 24 horas e uma placa durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste pontos de tempo que for necessário. Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 95 ul de tampão de corrida seguido por 5 ul de 7-aminoactinomycin D (7AAD) para cada poço de um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
- Adicione 100 ml de tampão de corrida para tubos de fragmentação. Transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo.
- Determinar a percentagem de células 7AAD-positivo utilizando o software de análise de citometria de fluxo.
5. CE 50 Determinação
- Os valores de EC50 de WS-CM e nicotina são determinadas por coloração 7AAD-positivo de PBMC.
- O valor de EC50 é definido como o ácido clorídrico coneentration à qual 50% das células já não eram viáveis num ensaio de 24 horas, e os valores são expressos como ug de equi-nicotina unidades / ml.
- Para as finalidades deste estudo, os valores de EC 50 foram determinados como sendo 1,56 ng / mL e 1,650 ug / ml para o WS-CM e nicotina, respectivamente.
6. As citocinas secretadas
NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade.
- Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina.
- Diluir nicotina para as seguintes concentrações: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, e 3000 ug / mL. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente.
- Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a cada poço a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço.O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
- Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 xg durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e, finalmente, a suspensão de células com 200 ul de tampão de corrida de gelo frio e repetindo o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 200 ul de meio RPMI completo, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 200 ul de 10 ug / ml de LPS meio a cada poço.
- Cobrir a placa e incubar durante 4 h, 24 h, 48 h, ou 72 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Ajuste os tempos de incubação, se necessário.
- Centrifugar a placa a 300 x g durante 3 min.
- Tome 175 mL de sobrenadante de cada bem e guarde em um freezer a -80 ° C para realizar os ensaios em etapas 7 e 8.
7. Cytometric Bead Matriz Assay
<ol>8. IL-8 ELISA
- Descongelar os sobrenadantes de células do passo 6.10 e utilização no ELISA de IL-8. Realizar o ensaio ELISA, conforme as instruções do fabricante.
9. intracelular Coloração e Citometria de Fluxo
NOTA: As diluições são listados aqui com o propósito do presente estudo. As diluições podem ser ajustados em conformidade.
- Diluir WS-CM em uma placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço a uma concentração de 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina.
- Na mesma placa, diluir nicotina para as concentrações seguintes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 ug / ml. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e ambientalmente hazardous.
- Adicionar 100 ul de PBMC em suspensão em meio RPMI completo a uma concentração de 1 x 10 6 células / poço. O volume total de células mais a WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
- Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Lavam-se as células à temperatura ambiente por centrifugação a 300 x g durante 3 min, aspirando o sobrenadante, vortex parte inferior da placa com placa coberta e finalmente ressuspender as células com 200 ul de tampão de corrida gelo frio, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 200 ul de meio RPMI completo para a placa, e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Preparar as concentrações de trabalho de 2 ul / ml GolgiPlug e 10 ug / ml de LPS, utilizando meio RPMI completo e adicionar 200 ul a cada poço.
- Incubar a placa durante 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- No final do passo 9.8, lavar as células com tampão de corrida (4 ° C) e centrifugação a 300xg durante 3 min a 4 ° C.
- Adicionar 100 ul de Cytofix a cada poço e incubar durante 20 min a 4 ° C.
- Lavam-se as células 3 vezes, conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Adicionar 45 ul de 1x Cytoperm a cada poço seguido por 5 ul de cada um de um dos seguintes anticorpos para cada cavidade: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min.
- Lavar as células duas vezes conforme descrito no passo 9.9 com 1x Permwash (4 ° C) e uma vez com tampão de corrida (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células com 200 uL de paraformaldeído a 2% (4 ° C). Transferência das células em 12 × 75 mm tubos, e analisar as amostras em citômetro de fluxo. CUIDADO: O paraformaldeído é corrosivo, altamente tóxico e um perigo para a saúde.
10. K562 Ensaio Killing
NOTA: As células devem ser cultivadas K562em cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 com meio RPMI completo até atingirem 80% de confluência antes do ensaio.
- Prepare um mM 5 carboxyfluorescein solução éster succinimidyl (CFSE) estoque, adicionando 18 mL de DMSO para o frasco.
- Diluir WS-CM ou nicotina numa placa de 96 poços, utilizando meio RPMI completo para um volume total de 100 ul / poço para alcançar as unidades de equi-nicotina desejadas ou as concentrações de nicotina para cada poço. ATENÇÃO: A nicotina é altamente tóxico e prejudicial ao ambiente.
- Adicionar 100 ul de PBMC em meio RPMI completo a uma concentração de 1,5 x 10 6 células / poço. O volume total de células com WS-CM ou nicotina será de 200 ul / poço.
- Cobrir a placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Lavam-se as células K562 por adição de 10 ml de DPBS e centrifugar a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células com 10 ml de DPBS e contar as células K562.
- Prepare CFSE workisolução ng por adição de 1 ml de solução de estoque de CFSE a 1 ml de DPBS.
- Adicionar 1 ml de solução de trabalho de CFSE a 1 ml da suspensão de células K562 contendo 1-2 x 10 7 células. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT.
- Imediatamente adicionar 200 mL de FBS. Vortex e incubar exactamente durante 2 minutos a RT.
- Adicionar 10 ml de meio RPMI completo e centrifugar o tubo a 400 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e meio RPMI romper a pelota e ressuspender as células com 10 ml de meio RPMI completo e contar as células K562 marcadas com CFSE.
- Lavam-se as CMSPs por centrifugação a placa a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por decantação do líquido. Substituir a tampa e vortex a parte inferior da placa. Adicionar 200 ul de meio RPMI completo e repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar células K562 marcadas com CFSE, na proporção de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a cada poço da placa de amostra de CMSP e ainda incubate durante 5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Lava-se a mistura de células por centrifugação a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante por se eliminar o líquido. Coloque a tampa e vortex a parte inferior da placa.
- Adicionar 200 ul de tampão de corrida e repetir o passo de lavagem descrito no passo 10,14 mais uma vez.
- Adicionar 95 ul de tampão de corrida, seguido por 5 mL de 7AAD a cada poço para um volume total de 100 ul / poço. Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
- Adicionar 100 ul de tampão de corrida a cada poço e transferir todo o volume de suspensão de células de cada poço da placa para os tubos de fragmentação e adquirir as amostras no citómetro de fluxo.
- Determinar a percentagem de células positivas 7AAD e CFSE-positivos usando software de análise de citometria de fluxo.
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Representative Results
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (quatro amostras do dador). T-teste do aluno entre amostras de controlo tratados e não tratados foi realizada utilizando o software Excel, bem como comparações t-teste para todos os tratamentos com seus controles correspondentes. A significância estatística foi indicada por: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Para medir o efeito da exposição a WS-CM e nicotina, as PBMC foram tratadas com diferentes concentrações de WS-CM e de nicotina durante 3 horas ou 24 horas. A morte celular foi medida através do método de coloração 7AAD robusto e fiável, que intercala 7AAD em ácidos nucleicos de cadeia dupla e podem penetrar as membranas celulares de células mortas ou a morrer 16. Foi observado um aumento dependente da dose da morte celular com WS-CM em 24 horas, com uma morte celular perto de 80% detectado em 4 ug / ml de unidades de equi-nicotina (Figura 1A). Um grau comparável de morte celular foiobservou-se apenas com 3,000 ug / ml de nicotina (Figura 1B). Desde que nós expostos PBMCs durante 3 horas com WS-CM e nicotina para avaliar o seu efeito de indução de citocinas e capacidade de matar células-alvo, foi necessário determinar se WS-CM causa citotoxicidade significativa após tratamento 3 hr. CMSPs tratadas com 5 ug / ml de unidades de equi-nicotina de WS-CM não experimentar uma toxicidade significativa (<5%; Figura 1A). O tratamento com nicotina durante 3 horas causou a morte mensurável (8%) de células apenas com 2.000 ng / mL (Figura 1B). Assim, a exposição de WS-CM ou nicotina nas doses indicadas e períodos de tratamento não provocou citotoxicidade significativa sob as condições experimentais.
Para medir os efeitos imunomoduladores, as PBMC foram estimuladas com LPS durante diferentes períodos de tempo, e as citocinas secretadas foram medidos pelo ensaio de CBA. Para optimizar o tempo de estimulação com LPS, expusemos PBMC a estimulação com LPS durante 4 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas, e citocinas secretadas foram medidos. Por exemplo, estimulação por LPS durante 24 horas produziu a secreção máxima de citocinas IL-6 e IL-8 (Figura 2), e períodos de tempo prolongados não resultou em mais aumentos (IL-6) ou diminui (IL-8) em citocina secreção. Foram obtidos resultados semelhantes com outras citocinas secretadas, tais como IL-10, IL-1β e TNF-α (dados não mostrados).
As experiências de curso-tempo-piloto sugeriram que a produção máxima de citocinas em resposta a TLR-4 estimulação por LPS ocorre por 24 h, e, portanto, as citocinas secretadas foram medidos às 24 h em todas as experiências subsequentes. O tratamento com o WS-CM e de nicotina, seguida por estimulação de receptor TLR-4 com LPS, resultou numa diminuição dependente da dose da secreção de citocinas (Figura 3). O tratamento com o WS-CM resultou em diminuição acentuada de IFN-γ (Figura 3A), TNF (Figura 3B), IL-10 (Figura 3C </ Forte>) e IL-6 (Figura 3D) em unidades de equi-nicotina baixa (1,56 ug / ml). Supressão de citocinas também ficou evidente com a nicotina. No entanto, a supressão de citocinas com nicotina ocorreram com doses significativamente mais elevadas, e o grau de supressão variou entre as citocinas individuais. Por exemplo, o IFN-γ pareceu ser suprimida de forma significativa com a nicotina em 50 ug / ml, enquanto que a IL-6 foi suprimida na concentração mais elevada (4 mg / mL) testada (Figurie 3D). Em seguida, foram medidos os níveis de IL-8 nas mesmas amostras utilizando um ensaio ELISA. IL-8 secreção foi efetivamente suprimida em PBMC WS-CM-expostos; enquanto que os efeitos supressores de nicotina foram significativas a 2 mg / mL (Figura 4).
Os níveis de citocinas intracelulares foram quantificados no WS-CM- e células tratadas com nicotina após estimulação com LPS. Anteriormente, estimulados PBMC por 3 dias e acrescentou Golgiplug durante a última 6 horas de incubação para medircitocinas intracelulares 14. Nós agora reduziu significativamente o período de incubação por combinação de estimulação com LPS e tampão de Golgi para um total de 6 horas e mediu-células positiva de citocinas intracelulares (Figura 5). A Figura 5 ilustra uma redução dependente da dose por cento em células-IFN-γ positivo ( Figura 5A), as células (Figura 5B) em ambos nicotina e WS-CM- TNF-α positivo exposta PBMCs, enquanto que uma redução dependente da dose por cento em células-MIP-1α positivo (Figura 5C) foi observada no WS-CM PBMC -exposed. Neste ensaio observou-se uma diminuição no número de células positivas de citocinas intracelulares após a exposição ao WS-CM em menores equi-unidades de nicotina (1,56 ug / ml). Ambos citocina segregada e ensaios de citocinas intracelulares mostrou resultados semelhantes em termos de níveis de IFN-γ ou células-IFN-γ positivo.
Como uma medida funcional, a capacidade de WS-CM- e nicotinaPBMC tratados para matar células K562 alvo foi determinada. Figura 6A representa citometria de fluxo representante dados brutos de coloração 7AAD-positivo de alvo (CFSE marcado K562) morte celular por controle, WS-CM-exposta, e PBMCs tratados com nicotina. Os números na caixa representar por cento células K562 CFSE rotulados 7AAD-positivo. A exposição a 1,56 ug / ml WS-CM reduziu significativamente a capacidade de matar as células efectoras PBMCs em comparação com o controlo e as doses mais baixas. Tratamento de nicotina em doses baixas e altas não interferiu com a morte celular. A Figura 6B mostra uma diminuição dependente da dose da percentagem de células K562 matando de doadores de múltiplos numa única experiência.
Figura 1. A morte celular de PBMC após exposição a concentrações crescentes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml). (A) e com nicotina durante 3 horas e 24 horas (B). A morte celular foi medida por coloração com 7AAD. Cada ponto representa a média ± DP barras de erro de quatro doadores de uma experiência representativa. A significância estatística é indicado por: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
Figura 2. A secreção de IL-6 e IL-8 por PBMC estimulados com LPS em diferentes pontos de tempo. As PBMC foram estimuladas com LPS durante 4 h, 24 h, 48 h e 72 h. Os níveis de IL-6 e IL-8 citocinas nos sobrenadantes de cultura celular foram determinados utilizando o kit humano de citoquinas inflamatórias (kit ABC) e citometria de fluxo. Estes dados representam as médias ± DP barras de erro a partir de uma das duas experiências independentes utilizando PBMC de três dadores diferentes. A si estatísticagnificance é indicado por: * P <0,05; ** P <0,005.
Figura 3. A redução da secreção de citocinas por PBMC tratadas com concentrações crescentes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml) após estimulação com LPS. As PBMC foram expostas a diferentes concentrações de WS-CM e nicotina durante 3 horas e estimuladas com LPS durante 24 horas. Os níveis de IFN-γ (A), TNF (B), IL-10 (C), e IL-6 (D) citocinas nos sobrenadantes de cultura de células foram determinadas usando um ensaio de Th1 / Th2 CBA e citometria de fluxo. Estes dados representam a média ± DP barras de erro a partir de uma das três experiências independentes utilizando PBMC de quatro dadores diferentes. A significância estatística é indicado por: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Con Superior centrações de WS-CM também foram estatisticamente significantes com *** P <0,0005.
Figura 4. A atenuação da secreção de IL-8 por PBMC tratadas com concentrações crescentes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml) após estimulação com LPS. As PBMC foram expostas a WS-CM e nicotina, estimuladas com LPS durante 24 horas, e secretada de IL-8 foi medida por ELISA. Estes dados representam as médias ± DP barras de erro a partir de uma das três experiências independentes utilizando PBMC de quatro dadores diferentes. A significância estatística é indicado por: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Maiores concentrações de WS-CM também foram estatisticamente significantes com *** P <0,0005.
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Figura 5. Redução de células positivas citocinas intracelulares em PBMC tratadas com concentrações crescentes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml). PBMC foram expostas a concentrações variáveis de WS-CM e nicotina durante 3 h e estimulados com LPS e Golgiplug durante 6 h. O controle de veículo para o WS-CM e nicotina era meio RPMI completo. Foram quantificados intracelular (C) células de MIP-1α-positivos IFN-γ positivo (A), o TNF-α positivo (B), e por citometria de fluxo. Estes dados representam as médias ± DP barras de erro a partir de um dos quatro experiências independentes utilizando PBMC de quatro dadores diferentes. A significância estatística é indicado por: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Maiores concentrações de WS-CM também foram estatisticamente significantes com *** P <0,0005.
Figura 6. Redução da capacidade de matar as PBMCs alvo com exposição a concentrações crescentes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml). PBMC foram tratadas com as concentrações indicadas de WS-CM e nicotina para 3 h, e as células K562 marcadas com CFSE foram então adicionadas como células alvo e incubadas durante 5 horas adicionais. As células foram coradas com 7AAD e citometria de fluxo foi usada para avaliar a capacidade de matar. A Figura 6A mostra o fluxo de citometria resultados representativos com percentagem de morte mostrado nas caixas fechadas. A seta indica a reduzida percentagem de morte em 1,56 mg / ml expostos WS-CM. A Figura 6B mostra barras representativas média ± SD de erro de quatro experimentos independentes, utilizando PBMC de quatro doadores diferentes. A significância estatística é indicado por: ** P <0,005; *** P <0,0005. Maiores concentrações de WS-CM também foram estatisticamente significativa with *** P <0,0005.
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Discussion
Nós e outros autores demonstraram previamente que o tratamento das PBMC com UTEs suprime a várias respostas, incluindo a expressão e a secreção de citocinas e medidas funcionais, tais como células alvo de matar 14. Os métodos experimentais descritos na obra anterior exigem períodos de incubação mais longos e eram modestas em magnitude 14. Dadas as potenciais aplicações desse modelo atrativo ex vivo para pesquisa básica e aplicada, investigamos se algum dos parâmetros do ensaio nestes ensaios biológicos multi-passo pode ser otimizado. Aqui, apresentamos métodos simplificados para medir as respostas imunes mediadas por TLR usando um modelo ex vivo PBMC tratados com TPP.
Isolamento de PBMC viável é um requisito fundamental para esses ex vivo ensaios. Dada a variabilidade individual e estado fisiológico em potenciais doadores, é ideal para obter PBMCs que são sensíveis. Para o propósito deste estudo, isolard PBMC de indivíduos adultos, geralmente saudáveis, utilizando um método previamente publicado 15. Além disso, neste estudo para minimizar a variabilidade entre os doadores, foram excluídos aqueles com alergias, infecções, ou que estavam a tomar qualquer prescrição ou de balcão drogas como a aspirina. Além disso, o isolamento de PBMCs a partir de sangue colhido de fresco é desejável, uma vez que assegura a viabilidade e a funcionalidade das células em experiências subsequentes óptima.
Os métodos anteriores utilizaram a estimulação com agonistas de TLR durante 67-72 h para medir citocinas intracelulares e citocinas secretadas 14. Um curso de tempo da secreção de citocinas em células estimuladas pelos TLR (sob condições de controlo sem WS-CM ou nicotina) sugeriu que a secreção máxima ocorreu às 24 h. Além disso, a incubação combinados com agonistas de TLR e Golgiplug e reduziu o tempo de incubação para um total de 6 h para medir citocinas intracelulares. Enquanto isto requereu um ensaio separado para medircélulas de citocinas-positivo, os dados são mais robustos em comparação com o método anterior 14. Consistente com os resultados anteriores, WS-CM suprimiu fortemente a indução de citocinas intracelulares e segregadas. Assim, essas modificações conduziu a uma redução substancialmente os tempos de ensaio e produziu resultados muito semelhantes às descritas na literatura. Embora se tenha utilizado a citometria de fluxo e ELISA para avaliar os níveis de citocinas, outras técnicas, tais como tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) também pode ser utilizada como uma técnica complementar.
Historicamente, o alvo morte celular por PBMC efetoras utilizados métodos marcados (por exemplo, o ensaio de 51 Cr-release). O método descrito neste relatório elimina o uso de radioactividade e utiliza células que carregam com um corante fluorescente, cuja presença pode ser monitorizada por citometria de fluxo. Outra vantagem do método aqui descrito é que é relativamente rápido e pode ser adapted para ensaios de elevado rendimento. Uma vez que o período de incubação de células alvo e efectoras é 5 h, este ensaio pode ser completado em 8 horas. Isto em contraste com outros métodos publicados, que são mais envolvido em que requerem o isolamento de subtipos de PBMCs e de activação / estimulação ao longo de um período de vários dias, ou de análise das células NK e conjugados de células K562 para monitorar citotoxicidade 17,18. Outra vantagem do método é que a corrente que utiliza PBMCs criopreservadas directamente como células efectoras, que oferece maior flexibilidade.
Em resumo, descrevemos vários ensaios para determinar o efeito da resposta imunitária mediada pelos TLR em combustíveis CMSPs tratadas com TPP, que pode ser facilmente aplicado para testar compostos diferentes. O uso de componentes criopreservados permite uma flexibilidade significativa, e em conjunto com técnicas estabelecidas, tais como citometria de fluxo, ensaios de CBA, e ELISAs, robusto e resultados consistentes podem ser obtidos rapidamente por toda laboratório diferenteoratórios.
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Acknowledgments
Este trabalho é financiado pela RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) sob um contrato de investigação em colaboração com a Escola Wake Forest University of Medicine. GL Prasad é um funcionário em tempo integral da RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
