Abstract
Среди других патофизиологических изменений, хроническое воздействие табачного дыма вызывает воспаление и подавление иммунитета, которые были связаны с повышенной восприимчивостью курильщиков микробных инфекций и возникновения опухолей. Экс естественных подавление рецепторов-опосредованной иммунной реакции в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМС) обрабатывали компонентов дыма является привлекательным подходом для изучения механизмов и оценки вероятных долгосрочных последствий воздействия табачных изделий. Здесь мы оптимизировали методы для выполнения экс анализов крысах с МНПК, стимулированных бактериального липополисахарида, в Toll-подобных рецепторов 4 лиганда. Последствия всего табачного дыма кондиционированной среды (WS-КМ), подготовка горючих табачных изделий (ТЭС) и никотин были исследованы на секрецию цитокинов и убийства клетки-мишени путем МНПК в бывших естественных условиях анализов. Показано, что цитокины, секретируемые IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, и IL-8 и внутриклеточные цитокины IFN-47 ;, TNF-α и MIP-1α были подавлены в WS-CM-инфицированными МНПК. Цитолитическая функции эффекторных РВМС, как определено в К562 клеток-мишеней погибли анализа также была снижена путем воздействия WS-МС; Никотин минимально эффективными в этих анализах. Таким образом, мы представляем набор усовершенствованных анализов для оценки последствий ТЭС в бывших естественных условиях анализов, и эти методы могут быть легко адаптированы для тестирования других продуктов, представляющих интерес.
Introduction
Значительный объем пунктов знаний к неблагоприятным последствиям для здоровья хронического курения сигарет, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и рак 1,2. Хронический курение, как известно, вызывают воспаление и подавление иммунитета, и эти изменения отражаются внести свой вклад с повышенным риском микробной инфекции и рака у курильщиков 3. В пробирке и бывших естественных условиях методы полезны при выяснении молекулярных основ патофизиологических эффектов сигаретный дым 4-9 (Таблица 1), и признаются в качестве важных инструментов для направления формирующегося регулирование различных табачных изделий 10,11.
Например, мы показали, что горючие вещества табачных изделий (ТЭС), такие как всей табачного дыма кондиционированной среды (WS-КМ) и общей твердых частиц (TPM) значительно более токсичным и разрушительным дляДНК, чем негорючих ТЭС или никотина 12,13. В соответствии с опубликованной работы, это было недавно сообщили, что горючие ТЭС или никотин 12,13. В соответствии с опубликованной работы, мы недавно сообщили, что горючие ТЭС вызвало заметное подавление иммунитета. Это свидетельствует подавлением Toll- подобный рецептор (TLR) -ligands, секрецию цитокинов и клеток-мишеней (K562) убийство по МНПК в Экс Vivo модели 14. Учитывая значимость воспаления в сигаретном болезненных процессов дыма, вызванного, дальнейшая оптимизация условий анализа для оценки иммунной модулирующие эффекты сигаретного дыма представлены в данном отчете.
Экс естественных условиях анализы обычно измеряют внутриклеточный и секретируется цитокины, а также цитолитическую функцию цитотоксических Т и NK клеток в К562 гибели клеток анализы 14. Анализы участвует предварительной инкубации с WS-МС и никотина и последующей стимуляцией РВМСс с TLR агонистов в течение 3 дней; окончательные показания выполняются с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и / или проточной цитометрии. Мы использовали бактериального липополисахарида (ЛПС), который связывается с TLR-4 рецепторов и стимулирует РВМС в результате чего производство внутриклеточных цитокинов и секреции цитокинов. В дополнение к оптимизации различных аналитических шагов для оценки иммуномодулирующее действие ТЭС, мы также представляем методы выделения МНПК гибель клеток анализов и IL-8 количественной оценке. Эти методы могут быть применены для решения других вопросов исследования и уточнены оценки табачные изделия в контексте регулирования.
Таблица 1. Опубликованные отчеты в пробирке и бывших естественных условиях методы, используемые для изучения varilus патофизиологические эффекты препаратов табачных изделий CS, сигаретный дым средой.; CSC, сигаретный дым конденсата; CSE, сигаретный дым экстракт; ELISA, иммуноферментный анализ; GADPH, глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы; КПЦР, количественной полимеразной цепной реакции; RT, в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции; TS, табачного дыма.
| Автор (год обучения) | Лан и др. (2004) | Муди и др. (2004) | Олтманс и др. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden и др. (2004) | Birrell и др. (2008) |
| Клетки используется | Человека бронхиальных клеток эндотелия (BEAS-2B), нейтрофилы человека | Человека эпителиальные клетки (А549) | Гладкой мускулатуры дыхательных путей клетки человека (HASMC) | Человека premonocytic U937 клетки, моноциты человека | Альвеолярного типа II эпителиальные клетки (ATII) | Человек моноцитовклеточной линии (ТНР-1), легочные макрофаги человека |
| ТЭЦ используется | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Метод, используемый | ИФА, КПЦР, миграция, электромобилей сдвиг | Immunohisto, автохимия, электрофорез, ArrayScan комплект, RT-PCR, ELISA | ИФА, ПЦР, КПЦР, электрофорез | Сдвиг гель-мобильность | Световая микроскопия, электронная микроскопия, электрофорез, ELISA | КПЦР, ИФА, E-toxate комплект (Sigma), p65 планшете (TransAm), электрофорез, различные наборы для иммуноанализа |
| Мера | ИЛ-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, миграция | Гистонов ацетилтрансферазы, гистондезацетилаз, NF-kB, IL-8, П. И. κB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, ИЛ-8, эотаксин | Тепловой шок / стрессовые белки (HSP / Hsp70), HF транскрипционный фактор, NF-kB,ФНО-α | Поверхностно-активное вещество белок (SP-A, SP-C), ИЛ-8, МСР-1, GRO-α, ФНО-α, ИЛ-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, МАРК / JNK / ERK фосфорилирования, cJUN: связывание с ДНК, глутатион, p65: связывание с ДНК |
| Конечный результат | CSE вниз регулирует выработку цитокинов путем подавления AP-1 активации. | H 2 O 2 и CSC повышения ацетилирование гистонов белков, снижение гистонов дезацетилазы деятельность, дифференциально регулировать провоспалительных релиз цитокинов. | Сигаретный дым может вызвать высвобождение IL-8 из HASMC, усиливается TNF-α, 20% CSE меньше IL-8-релизе, подавление эотаксина и RANTES сигаретного дыма. | TS активированный фактор HF транскрипции, который был связан с Hsp70 гиперэкспрессией и торможения NFkB связывания активность и TNF-α-релиз. | Снижение ATII уровни хемокинов клеток получают компромисс AlveoLAR ремонт, способствуя сигаретного дыма, вызванного альвеолярного повреждения и эмфиземы. | Данные предоставить механистическое объяснение, почему курильщики обострение респираторных инфекций. Подавление врожденной ответ сопровождается увеличением IL-8. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: письменное информированное согласие делать это исследование было получено в местном клинической единицы исследования под IRB утверждения, за надлежащей клинической практики. Обработка крови, выделение МНПК и других экспериментов на клеточных культурах выполняются в стерильных условиях, используя микробиологически стерильные материалы и реагенты.
1. WS-CM Подготовка
- Генерация WS-CM, как описано выше 12.
- Подготовка WS-CM, передавая дым из четырех 3R4F справочных сигарет через Roswell института Park Memorial (RPMI) 1640 без фенола красного, используя следующую схему курению: 35-60-2, объемом затяжки в мл, интервал слоеного в сек, и продолжительности слоеного в сек, соответственно. Каждый препарат создает образец 20 мл.
- Этикетка трубки (ы) с даты, времени завершены, и имя и номер сигарет. Хранить в 500 мкл аликвоты при -80 ° C сразу после курения завершена.
- Анализ аликвот замороженных WS-cm, Чтобы определить уровни никотина, табачных конкретных нитрозаминов и полициклических ароматических углеводородов, как описано выше 12.
2. Выделение МНПК
- Соберите свежую кровь от здоровых доноров (которые не являющихся потребителями табачных изделий) Изолировать МНПК от свежей крови, как описано ниже в рамках отдельного разрешения Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- До прибытия мешка крови, есть бутылка 500 мл, ножницы, буфер изоляции и фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) (RT) готов в уровень биобезопасности 2 (BSL-2) капот культуре клеток. Выделение буфера должен быть защищен от света.
- Держите сумку в крови с ног на голову и разрежьте трубу чуть ниже, где он был зажат оставляя по крайней мере, 3 см труб.
- Снимите крышку с бутылки 500 мл и удерживайте над отверстием бутылки трубку. Возьмите мешок крови и инвертировать его, чтобы кровь свободно вытекать из мешка в тон бутылка, пока мешок не пуст. Дайте крови течь на внутреннюю стенку флакона по сравнению с вертикально вниз, чтобы избежать образования пузырьков.
- Налейте буфер изоляции в бутылку в соотношении 1: 5 буфера изоляции с кровью. Закройте бутылку плотно и аккуратно переверните его, в конце-по-конец, в 10 раз. Оставьте бутылку в капот культуре клеток инкубируют с выключенным светом, в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Свет, соломенно-желтый слой будет наращивать выше крови. Удалить этот слой с помощью 25 мл серологические пипетки в 50 мл конические пробирки. Собранный количество может варьировать от 50 - 300 мл, в зависимости от субъекта, который донорской крови.
- Центрифуга трубки при 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте полупрозрачный супернатант, оставляя темные крови цвета гранул. Осадок будет свободна, но вязкой.
- Пипетка 3 мл буфера изоляции в 15 мл конические пробирки.
- К ресуспендируют осадок, добавляют 20 мл DPBS на каждые 50 мл соломенного цвета жидкость, собранна в секТеп 2.1.5. Vortex тщательно перемешать, и консолидировать ресуспендировали жидкости из нескольких труб. Эта жидкость содержит суспендируют клетки крови.
- С передачей пипетки, передача 5 мл взвешенных клеток крови на 3 мл буфера изоляции в шаге 2.1.8. Наклоните 15 мл коническую трубку, содержащую суспензию клеток медленно и осторожно, чтобы создать два отдельных слоя. Центрифуга трубки на 400 мкг в течение 40 мин при комнатной температуре с минимальным ускорением и без тормоза.
- Использование передачи пипетки, чтобы удалить полученный мутный средний слой светлого сгустка крови (), содержащий РВМС в 50 мл коническую трубку. Избегайте рисования других четких слоев под ним. Трансфер не более 25 мл в каждую 50 мл коническую трубку.
- Добавить 25 мл холодного буфера работает (или более, чтобы заполнить весь оставшийся объем 50 мл коническую трубку), чтобы промыть клетки. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют гранул с 10 мл рабочего буфера. Этот документ содержит МНПК. Граф клеток и использовать чатопосредованно или места на льду для замораживания.
3. замораживания и оттаивания в МНПК
- Центрифуга РВМС, которые были собраны в стадии 2.1.13 течение 10 мин при 400 х г.
- Заполните замораживания контейнер с изопропилового спирта в соответствии с инструкциями изготовителя. ВНИМАНИЕ: изопропиловый спирт легко воспламеняется и характеризуется острой токсичностью.
- Ресуспендируют гранул с RPMI 1640 (4 ° С), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Это RPMI 1640 замерзания средой. Ресуспендируют гранул с количеством замораживания среды, что приведет к суспензии, имеющей примерно 5 х 10 7 клеток / мл. Число клеток, доступных для замораживания будет меняться.
- Не включать 1 мл аликвоты клеточной суспензии в 2 мл криопробирки и разместить криопробирок в контейнере замерзания. Поместите замораживания контейнер с криопробирок в морозильной камере при -80 ° C для хранения O / N, а затем удалить криопробирок и передать для хранения вкриогенная морозильник между -150 ° С до -190 ° С.
- Извлеките криоскопической из криогенного хранилища и разморозить его быстро при осторожном перемешивании в водяной бане при 37 ° С.
- Сразу передачи талой РВМС в криоскопической пробирки в 15 мл коническую пробирку с 10 мл RPMI полной среды 1640 (4 ° С), содержащей 10% FBS, 1% Pen / Strep и 1% L-глутамина. Содержание талой криоскопической пробирки должны быть переданы как можно быстрее, чтобы получить максимальное жизнеспособности клеток 15.
- Центрифуга РВМС при 400 х г в течение 10 мин.
- Ресуспендируют гранул с 5 мл RPMI 1640 полной среде и подсчет клеток.
- Измерение жизнеспособности клеток с помощью установленных методов, таких как трипанового синего методом исключения. Вообще жизнеспособность клеток с помощью этого метода составляет около 90 - 95%. РВМС теперь готовы для использования в экспериментах.
Определение Смерть 4. Сотовый
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, перечисленные здесь, для целей настоящего ГТУду. Разведения могут быть соответствующим образом изменены.
- Развести WS-см или никотин в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку, как указано ниже.
- Развести WS-см до следующих концентраций: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, и 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц (на основе содержания никотина в WS-12 см).
- Развести никотина в RPMI среде до следующих концентраций: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 и 3000 мкг / мл. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически опасным.
- Добавить 100 мкл РВМС, взвешенных в полной среде RPMI в каждую лунку в концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку. Общий объем клеток плюс WS-см или никотина будет 200 мкл / лунку.
- Для целей данного исследования, подготовке двух наборов пластин, как описано выше. Покрытие пластин и инкубировать одну пластину в течение 24 ч и одной пластины в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2. Регулировка моменты времени по мере необходимости. Промыть при комнатной температуре клетки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин, аспирации супернатант, встряхиванием в нижней части пластины с пластины, покрытой и, наконец, ресуспендирования клеток с 200 мкл охлажденного льдом буфера под управлением, и повторить стадии промывки еще раз.
- Добавить 95 мкл рабочего буфера, а затем 5 мкл 7-aminoactinomycin D (7AAD) в каждую лунку при общем объеме 100 мкл / лунку. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавить 100 мкл работает буфер для кластерных труб. Перевести весь объем клеточной суспензии из каждой лунки пластины к кластеру труб и приобрести образцы на поток цитометр.
- Определить процент 7AAD-позитивных клеток с использованием проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.
5. EC 50 Определение
- EC 50 значения WS-CM и никотина определяются 7AAD-положительное окрашивание МНПК.
- ЕС 50 значение определяется как концentration, при которой 50% клеток были уже не жизнеспособны в 24 ч анализа, а значения выражены в мкг равностепенной никотина ед / мл.
- Для целей настоящего исследования, EC 50 значения были признаны 1,56 мкг / мл и 1650 мкг / мл для WS-CM и никотина, соответственно.
6. Секретируемые Цитокины
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, перечисленные здесь, для целей данного исследования. Разведения могут быть соответствующим образом скорректированы.
- Развести WS-см в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку в концентрации 0,3, 1,56, 3 и 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц.
- Развести никотина в следующих концентрациях: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, и 3000 мкг / мл. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически опасным.
- Добавить 100 мкл РВМС, взвешенных в полной среде RPMI в каждую лунку в концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку.Общий объем клеток плюс WS-см или никотина будет 200 мкл / лунку.
- Закройте планшет и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Промыть при комнатной температуре клетки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин, аспирации супернатант, встряхиванием в нижней части пластины с пластины, покрытой и, наконец, суспендирующие клетки с 200 мкл охлажденной льдом рабочем буфере и повторение стадии промывки еще раз.
- Добавить 200 мкл полной среды RPMI, и повторить стадии промывки еще раз.
- Добавить 200 мкл 10 мкг / мл LPS среды в каждую лунку.
- Закройте планшет и инкубируют в течение 4 ч, 24 ч, 48 ч, или 72 ч при 37 ° С и 5% СО 2. Регулировка времени инкубации при необходимости.
- Центрифуга пластины при 300 х г в течение 3 мин.
- Возьмите 175 мкл супернатанта из каждой лунки и хранить в морозильной камере при температуре -80 ° C для выполнения анализов с шагом 7 и 8.
7. Cytometric бисера Массив Анализ
<ол>8. IL-8 ELISA
- Оттепель клеточных супернатантов с шага 6,10 и использования в IL-8 ELISA. Выполните анализ ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.
9. внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, перечисленные здесь, для целей данного исследования. Разведения могут быть соответствующим образом скорректированы.
- Развести WS-см в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку в концентрации 0,3, 1,56, 3 и 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц.
- В то же пластине, разбавленной никотина в следующих концентрациях: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, и 4000 мкг / мл. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически ХазарDOUS.
- Добавить 100 мкл РВМС, взвешенных в полной среде RPMI при концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку. Общий объем клеток плюс WS-см или никотина будет 200 мкл / лунку.
- Закройте планшет и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Промыть при комнатной температуре клетки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин, аспирации супернатант, встряхиванием в нижней части пластины с пластины, покрытой и, наконец, ресуспендирования клеток с 200 мкл охлажденного льдом буфера под управлением, и повторить стадии промывки еще раз.
- Добавить 200 мкл RPMI полной среде к плите, и повторите шаг Мойте еще раз.
- Подготовка рабочих концентраций 2 мкл / мл GolgiPlug и 10 мкг / мл LPS с помощью RPMI полной среды и добавить 200 мкл в каждую лунку.
- Инкубируют планшет в течение 6 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- В конце стадии 9,8, мыть клетки с рабочим буфером (4 ° С) и спиннинг в 300мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
- Добавить 100 мкл Cytofix в каждую лунку и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° С.
- Промыть клетки 3 раза, как описано в стадии 9,9 1х Permwash (4 ° С) при 300 х г в течение 3 мин при 4 ° С.
- Добавить 45 мкл 1х Cytoperm в каждую лунку с последующим 5 мкл каждого из одного из следующих антител в каждую лунку: ФНО-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α ПЭ. Инкубируйте при 4 ° С в течение 30 мин.
- Промыть клетки в два раза, как описано выше в стадии 9,9 1х Permwash (4 ° C) и один раз с рабочим буфером (4 ° C) при 300 х г в течение 3 мин при 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток с 200 мкл 2% параформальдегида (4 ° C). Передача клеток в 12 × 75 мм пробирок и анализа проб на проточной цитометрии. ВНИМАНИЕ: Параформальдегид вызывает коррозию, остро токсичен и опасен для здоровья.
10. K562 Убийство Анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: К562 должны быть выращеныв культуре при 37 ° С и 5% СО 2 с полной среде RPMI, пока они не достигнут 80% слияния до анализа.
- Подготовка 5 мм карбоксифлуоресцеина сукцинимидиловый эфир (CFSE) маточного раствора путем добавления 18 мкл ДМСО в пробирку.
- Развести WS-см или никотин в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку, чтобы достичь желаемых равностепенно никотина единиц или концентрации никотина для каждой лунки. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически опасным.
- Добавить 100 мкл РВМС в полной среде RPMI при концентрации 1,5 × 10 6 клеток / лунку. Общий объем клеток с WS-CM или никотина будет 200 мкл / лунку.
- Закройте планшет и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Промыть клеток K562, добавив 10 мл DPBS и центрифуге при 400 х г в течение 8 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клеток с 10 мл DPBS и подсчет клеток К562.
- Подготовка CFSE WorkiРаствор нг добавлением 1 мкл исходного раствора CFSE до 1 мл DPBS.
- Добавить 1 мл рабочего раствора CFSE в 1 мл клеточной суспензии K562, содержащей 1 - 2 х 10 7 клеток. Вихревой и инкубировать точно в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Сразу добавить 200 мкл FBS. Вихревой и инкубировать точно в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 10 мл RPMI полной среде и центрифугируют пробирку при 400 х г в течение 8 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант RPMI и разорвать гранулы и ресуспендирования клеток с 10 мл RPMI полной среды и считать CFSE-меченых клеток К562.
- Промыть РВМС центрифугированием пластину на 300 мкг в течение 3 минут при комнатной температуре. Аспирата супернатант декантируют жидкость. Установите на место крышку и вихрь нижней части пластины. Добавить 200 мкл RPMI полной среде и повторите этап промывки еще раз.
- Добавить CFSE-меченых клеток К562 в соотношении 1:15 (100000 K562s: 1,5 × 10 6 РВМС) к каждому образцу лунку планшета РВМС и дальше яncubate в течение 5 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Промыть смесь клеток центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Аспирата супернатант путем отбрасывания жидкости. Поместите крышку и вихрь нижней части пластины.
- Добавить 200 мкл рабочего буфера и повторите этап промывки, описанные в шаге 10.14 еще раз.
- Добавить 95 мкл работает буфер, а затем 5 мкл 7AAD в каждую лунку при общем объеме 100 мкл / лунку. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавить 100 мкл рабочего буфера в каждую лунку и передать весь объем клеточной суспензии из каждой лунки пластины к кластеру труб и приобрести образцы на поток цитометр.
- Определить процент 7AAD-положительных и CFSE-положительных клеток с помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (четыре образца доноров). T-критерию Стьюдента между обработанной и необработанной контрольных образцов проводили с использованием Excel программного обеспечения, а также сравнения Т-тест для всех процедур с соответствующими им управления. Статистическая значимость была указана: *, P <0,05; ** P <0,005; *** Р <0,0005.
Для измерения эффекта воздействия на WS-МС и никотина, РВМС обрабатывали различными концентрациями WS-МС и никотина в течение 3 ч или 24 ч. Гибель клеток измеряли прочной и надежной метода окрашивания 7AAD, как 7AAD встраивается в двухцепочечной нуклеиновой кислоты и может проникать через клеточные мембраны умирает или мертвых клеток 16. Дозозависимое увеличение гибели клеток наблюдалось с WS-см при 24 ч, с близкой смерти 80% клеток обнаружено в 4 мкг / мл равнодействующих никотина единиц (фиг.1А). Сопоставимы степень гибели клетокотмечены только у 3000 мкг / мл никотина (рис 1б). Так как мы подвержены РВМС в течение 3 ч с WS-МС и никотина, чтобы оценить их воздействие цитокинов индукции и способность убивать клетки-мишени, необходимо было определить, вызывает ли WS-CM значительное цитотоксичность следующий 3 ч лечения. РВМС обрабатывают 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц WS-МС не испытывали значительную токсичность (<5%; 1А). Лечение с никотином в течение 3 часов причиной измеримое (8%) гибель клеток только в 2000 мкг / мл (Фигура 1В). Таким образом, воздействие WS-CM или никотина в указанных дозах и сроках лечения не вызывает выраженной цитотоксичности в экспериментальных условиях.
Для измерения иммуномодулирующим действием, РВМС стимулировали LPS для различных периодов времени, и секретируемые цитокины были измерены с помощью анализа CBA. Для оптимизации времени стимуляции ЛПС, как мы показали МНПК к стимуляции ЛПС в течение 4 часов, 24 ч, 48 ч и 72 ч, и секретируемые цитокины были измерены. Например, ЛПС стимуляции в течение 24 ч давала максимальный секрецию цитокинов IL-6 и IL-8 (фиг.2), и длительных периодов времени не приводит к дальнейшему увеличению (IL-6) или уменьшается (IL-8) в цитокина секреции. Аналогичные результаты были получены с другими секретируемых цитокинов, таких как IL-10, IL-1β и TNF-α (данные не показаны).
Эксперименты пилот времени курс предположить, что максимальное производство цитокинов в ответах на TLR-4 стимуляции ЛПС происходит при 24 ч, а следовательно, и секретируемые цитокины были измерены при 24 ч во всех последующих экспериментах. Лечение с WS-МС и никотина, а затем стимуляции TLR-4 рецептора с ЛПС, приводит к зависимому от дозы уменьшению секретируемых цитокинов (фиг.3). Лечение с WS-МС в результате глубоких понижений IFN-γ (фиг.3А), TNF (фигура 3В), IL-10 (фиг.3С </ Сильной>) и ИЛ-6 (фиг 3D) при низких равнодействующих никотина единиц (1,56 мкг / мл). Подавление цитокинов было также очевидно с никотином. Тем не менее, подавление цитокинов с никотина происходит при значительно более высоких дозах, а степень подавления варьировать среди отдельных цитокинов. Например, IFN-γ-видимому, значительно подавлено с никотином в 50 мкг / мл, тогда как IL-6, было подавлено при самой высокой концентрации (4 мг / мл) тестируемого (Figurie 3D). Далее, мы измерили ИЛ-8 уровней в одних и тех же образцов с использованием анализа ELISA. IL-8 секрецию эффективно подавляется в WS-CM-инфицированными РВМС; в то время как подавляющие эффекты никотина были значимы на 2 мг / мл (рисунок 4).
Уровни внутриклеточных цитокинов количественно в WS-см-никотина и обработанных клеток после стимуляции ЛПС. Ранее мы стимулировали МНПК в течение 3 дней, и добавил Golgiplug в течение последних 6 ч инкубации измеритьвнутриклеточные цитокины 14. Мы в настоящее время значительно сократили инкубационный период путем объединения стимуляции ЛПС и Гольджи вилкой в общей сложности 6 ч и измеряется внутриклеточных цитокин-положительных клеток (рисунок 5). Рисунок 5 иллюстрирует процентное снижение дозы зависит в IFN-γ-позитивных клеток ( 5А), TNF-α-позитивных клеток (Фиг.5В) в обеих никотина и WS-см-воздействию РВМС, в то время как сокращение процентов дозозависимым в MIP-1α-позитивных клеток (фиг 5С) наблюдалось в WS-CM -exposed МНПК. В этом анализе мы наблюдали снижение количества внутриклеточных цитокинов-положительных клеток после воздействия WS-см при более низких на одинаковом никотина единиц (1,56 мкг / мл). Как секретируется цитокинов и внутриклеточных цитокинов анализы показали сходные результаты с точки зрения уровней IFN-γ или IFN-γ-позитивных клеток.
В качестве функционального меры, способность WS-СМ и никотинаобработанные МНПК, чтобы убить К562 цель была определена. 6А изображает представитель проточной цитометрии исходные данные 7AAD-позитивного окрашивания цели (CFSE-меченых К562) гибель клеток посредством контроля, WS-CM-подвержены, и никотина обработке МНПК. Цифры в поле представляют процента 7AAD-положительных CFSE-меченых клеток К562. Воздействие 1,56 мкг / мл WS-СМ значительно снижается смертельный способность эффекторных клеток в РВМС по сравнению с контролем и в более низких дозах. Никотин лечение при низких и высоких дозах не вмешиваться в гибели клеток. 6В показывает дозозависимое снижение в процентах K562 гибели клеток от нескольких доноров в одном эксперименте.
Рисунок 1. Гибель клеток из РВМС после воздействия возрастающих концентраций никотина равнодействующих единиц WS-МС (мкг / мл) и никотин (мкг / мл). (A) и с никотином в течение 3 ч и 24 ч (В). Гибель клеток измеряли 7AAD окрашивания. Каждая точка представляет собой среднее ± SD планки погрешностей четырех доноров от представителя эксперимента. Статистическая значимость свидетельствуют: * P <0,05; ** P <0,005, *** Р <0,0005.
Рисунок 2. Секреция IL-6 и IL-8 в МКПК, стимулированных ЛПС в различные моменты времени. РВМС стимулировали LPS в течение 4 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч. Уровни ИЛ-6 и ИЛ-8 цитокинов в супернатантах клеточных культур были определены с использованием человеческого цитокина Kit (CBA комплект) и проточной цитометрии. Эти данные представляют собой стержни среднее ± стандартное отклонение ошибки в одном из двух независимых экспериментов с использованием РВМС от трех различных доноров. Статистическая сиgnificance свидетельствуют: * P <0,05; ** P <0,005.
Рисунок 3. Снижение секреции цитокинов РВМС, обработанных с увеличением концентраций никотина равнодействующих единиц WS-МС (мкг / мл) и никотина (мкг / мл) следующие LPS стимуляции. РВМС воздействию различных концентраций WS-МС и никотина в течение 3 ч и стимулировали LPS в течение 24 ч. Уровни IFN-γ (A), TNF (В), ИЛ-10 (С), и ИЛ-6 (D) цитокинов в супернатантах клеточных культур определяли с помощью анализа Th1 / Th2 CBA и проточной цитометрии. Эти данные представляют собой среднее ± SD планки погрешностей из одного из трех независимых экспериментов с использованием РВМС от четырех различных доноров. Статистическая значимость свидетельствуют: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Высшее кон рации WS-CM также статистически значимое с *** Р <0,0005.
Рисунок 4. Ослабление ИЛ-8 секреции РВМС обрабатывали возрастающими концентрациями равнодействующих никотина единиц WS-МС (мкг / мл) и никотина (мкг / мл) после стимуляции ЛПС. РВМС подвергается WS-МС и никотина, стимулировали LPS в течение 24 ч, и секретируется ИЛ-8 измеряли с помощью ELISA. Эти данные представляют собой стержни среднее ± стандартное отклонение ошибки в одном из трех независимых экспериментов с использованием РВМС от четырех различных доноров. Статистическая значимость свидетельствуют: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Более высокие концентрации WS-CM также статистически значимое с *** Р <0,0005.
.jpg "/>
Рисунок 5. Снижение внутриклеточных цитокинов-позитивных клеток в РВМС, обработанных с увеличением концентраций никотина равнодействующих единиц WS-МС (мкг / мл) и никотина (мкг / мл). РВМС воздействию различных концентраций WS-МС и никотина в течение 3 ч и стимулировали LPS и Golgiplug в течение 6 ч. Управления транспортным средством для WS-CM и никотина было RPMI полной среды. Внутриклеточный IFN-γ-положительные (A), TNF-α-положительной (В) и MIP-1α-позитивных (C) клетки были количественно с помощью проточной цитометрии. Эти данные представляют собой стержни среднее ± стандартное отклонение ошибки в одном из четырех независимых экспериментах с использованием РВМС от четырех различных доноров. Статистическая значимость свидетельствуют: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Более высокие концентрации WS-CM также статистически значимое с *** Р <0,0005.
Рисунок 6. Снижение РВМС цели убивает способность с воздействием возрастающих концентраций никотина равнодействующих единиц WS-МС (мкг / мл) и никотина (мкг / мл). РВМС обрабатывали указанными концентрациями WS-МС и никотина для 3 ч и CFSE-меченые клетки К562 были затем добавлены в качестве клеток-мишеней и инкубировали в течение дополнительных 5 ч. Клетки окрашивали 7AAD и проточной цитометрии был использован для оценки способности убить. 6А показывает представительный проточной цитометрии с результатами процентов убийства, показанной в закрытых коробках. Стрелка указывает уменьшается процентов убийство в 1,56 мкг / мл, подвергшихся WS-CM. 6В показаны репрезентативные бары среднее ± SD ошибках из четырех независимых экспериментов с использованием МНПК от четырех разных доноров. Статистическая значимость свидетельствуют: ** Р <0,005; *** P <0,0005. Более высокие концентрации WS-CM также статистически значимое остроумиеч *** P <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы и другие ранее продемонстрировали, что лечение МНПК с ТЭС подавляет несколько ответов, в том числе экспрессии и секреции цитокинов и функциональных мер, таких как клетки-мишени убийство 14. Экспериментальные методы, описанные в предыдущей работе требуют более долгий инкубационный период и были скромными по величине 14. Учитывая потенциальные применения этой привлекательной Экс Vivo модели для фундаментальных и прикладных исследований, мы исследовали, может ли какой-либо из параметров анализа в этих многоступенчатых биологических анализов могут быть оптимизированы. Здесь мы представляем упрощенные методы для измерения TLR-опосредованных иммунных ответов, используя ТЭЦ-обработанной Экс Vivo РВМС модель.
Выделение жизнеспособной МНПК является ключевым требованием для этих бывших естественных условиях анализов. Учитывая индивидуальная изменчивость и физиологического состояния у потенциальных доноров, он идеально подходит для получения МНПК, которые реагируют. Для целей данного исследования, мы выделяемD МНПК от практически здоровых взрослых испытуемых с использованием ранее опубликованным методом 15. Кроме того, в этом исследовании, чтобы минимизировать изменчивость между донорами, мы исключили людей с аллергией, инфекции, или кто не предпринимали никаких предписаний или по борьбе с наркотиками, такими как аспирин. Кроме того, изоляция РВМС от только что собранной крови желательно, так как это обеспечивает оптимальное жизнеспособности и функции клеток в последующих экспериментах.
Предыдущие методы, используемые стимуляции с агонистами TLR для 67-72 ч, чтобы измерить внутриклеточные цитокины и секретируется цитокины 14. Время курс секреции цитокинов в TLR-стимулированных клеток (в контрольных условиях без каких-либо WS-CM или никотина) предположил, что максимальная секреция произошло в 24 час. Кроме того, мы объединили инкубации с агонистов TLR и Golgiplug и сократить время инкубации в общей сложности 6 ч для измерения внутриклеточных цитокинов. Хотя это требует отдельного анализа для измеренияцитокинов-позитивных клеток, данные являются более надежными по сравнению с предыдущим способом 14. В соответствии с предыдущими результатами, WS-CM сильно подавлен индукцию внутриклеточных и секретируемых цитокинов. Таким образом, эти модификации привели к существенно сократить время опробования и получают очень похожие результаты, как те, которые описаны в литературе. В то время как мы использовали проточной цитометрии и методы ELISA, чтобы оценить уровни цитокинов, другие методы, такие как в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (RT-КПЦР) также могут быть использованы в качестве дополнительного метода.
Исторически сложилось так, клетки-мишени убийство по эффекторных МНПК использованы меченые методы (например, 51 Cr-анализа высвобождения). Способ, описанный в этом отчете исключает использование радиоактивности и использует с загрузкой клеток с флуоресцентным красителем и присутствие которого можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Еще одним преимуществом описанного способа в данном описании в том, что это относительно быстрый и может быть ADAPTEd, чтобы с высокой пропускной анализов. Поскольку инкубационный период мишеней и эффекторных клеток 5 ч, этот анализ может быть завершена в 8 ч. Это, в контрастах с других опубликованных методов, которые сложнее, поскольку они требуют изоляции подтипов РВМС и активации / стимуляции в течение периода от нескольких дней, или анализ НК клетки и клеточные конъюгатов К562 контролировать цитотоксичность 17,18. Еще одно преимущество настоящего метода является то, что он использует криоконсервированных РВМС непосредственно в качестве эффекторных клеток, которые дает большую гибкость.
Таким образом, мы описали несколько анализов, чтобы определить эффект TLR-опосредованного иммунного ответа у горючих ТЭС-обработанных РВМС, которые могут быть легко применены для тестирования различных соединений. Использование криоконсервированных компонентов позволяет значительную гибкость и вместе с установленными способами, такими как цитометрии, анализы СВА, и ИФА, надежный и последовательные результаты могут быть быстро, полученного по другой лаборатории потокаоратории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа финансируется RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) под соглашение о сотрудничестве исследований с Wake Forest University школы медицины. GL Прасад полный рабочий день сотрудник RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
