Abstract
מחקרים טיפוליים ומכאניים של neurotoxins הממוקד Presynaptically clostridial (הצינוריות) היו מוגבלים על ידי הצורך במודל שמייצר סינפסות מתפקדות ועובר תגובות פיסיולוגיות לשיכרון מדרגי, המבוסס על תאים. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה וחזקה כדי להבחין ביעילות תאי גזע עובריים עכבריים (ESCs) לשושלות מוגדרות של תאי עצב synaptically פעיל, ברשת. בעקבות פרוטוקול בידול 8 יום, נוירונים גזע העוברי של עכבר שמקורן בתאים (ESNs) במהירות להביע ולמדר חלבוני neurotypic, יוצרים מורפולוגיות עצביות ולפתח תגובות חשמליות פנימיות. על ידי 18 ימים לאחר התמיינות (DIV 18), ESNs תערוכת glutamatergic הפעיל וγ-aminobutyric חומצה (GABA) סינפסות ergic והתנהגויות רשת המתהווה מאופיינות מעורר: איזון מעכב. כדי לקבוע אם שיכרון עם צינוריות תפקודי עוינות עצבית הסינפטי, ובכך משכפלים הדואר in vivo הפתופיזיולוגיה כי הוא אחראי על ביטויים קליניים של בוטוליזם או טטנוס, אלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון כל התא הייתה בשימוש לכמת זרמים ספונטניים זעירים מעוררים פוסט-סינפטי (mEPSCs) בESNs נחשף לרעלן עצבי טטנוס (אוהל) או עצבים בוטולינום (בונט) קפסיד / A- / G. בכל המקרים, ESNs הציג הפסד של פעילות הסינפטית כמעט מלא תוך 20 שעות. נוירונים שיכורים נשארו קיימא, כפי שהודגמו על ידי פוטנציאלי קרום מנוחה ללא שינוי ותגובות חשמליות פנימיות. כדי לאפיין את הרגישות של גישה זו עוד יותר, אפקטים תלויי מינון של שיכרון על פעילות הסינפטית נמדדו 20 שעות לאחר תוספת של ונט /. שיכרון עם 0.005 PM ונט / הביא פחת משמעותית בmEPSCs, עם ריכוז החציוני מעכב (IC 50) של 0.013 PM. השוואות של מינוני חציון מצביעות על כך שמדידות פונקציונליות של עיכוב סינפטי הן מהיר יותר, מדויק יותר ורגישות יותר ממלכודתמבחני מחשוף או assay הקטלני עכבר. נתונים אלה לאמת את השימוש בתאי העצב שמקורם בתא יחד synaptically, נובעים לגילוי הספציפי ורגיש ביותר של צינוריות.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעריך תפקודי פעילות הסינפטית בתרבויות ברשת של תאי עצב שמקורם בתאים גזע החשופים לneurotoxins clostridial. זוהי ההפגנה הראשונה של מודל נגזר במבחנה שתפקודית משכפל את pathophysiologies האחראי לביטויים קליניים של בוטוליזם ומאמת ESNs כמודל מתאים לזיהוי של צינוריות, הקרנה טיפולית ומחקרים מכניסטית.
BoNTs הוא neurotoxins חיידקים הקטלני ביותר המיוצר על ידי בני מין Clostridium. כולל בונט / H הציע לאחרונה, שמונה זנים אל ונט antigenically שונים תוארו (/ A- / H) 1,2. כל הזנים אל באים לידי ביטוי כ-150 פפטידים kDa שהם פוסט-translationally חתוכות לייצר dichain מורכב 100 שרשרת כבדה kDa (HC) ושרשרת 50 אור kDa (LC) מקושר על ידי קשר דיסולפיד 3. HC מתווך מחייב את הקולטנים ואף אוזן גרון presynapticר"י של רעלן לתוך תא העצב באמצעות אנדוציטוזה הסינפטי. במהלך עיבוד endosomal, HC עובר ארגון מחדש מבני כדי ליצור נקבובית בקרום השלפוחית, להקל על טרנסלוקציה של LC לcytosol presynaptic. LC אז במיוחד מטרות ודבק קולט חלבון המסיס N מצורף היתוך -ethylmaleimide רגיש חלבונים (מלכודת) בתא presynaptic: SNAP-25 (בונט /, / C, / E), VAMP2 (בונט / B, / D, / F, / G) או syntaxin (בונט / C) 1. מחשוף של כל אחד מחלבוני מלכודת אלה מונע ההרכבה של מכונות exocytosis הסינפטי, ובכך חוסם את שחרור הנוירוטרנסמיטר. שילוב זה של מיקוד עצבי יעיל ולוקליזציה presynaptic הופך BoNTs הרעלים החזקים ביותר הידועים, עם מינונים קטלניים אנושיים משוערים נמוכים כמו 0.1 - 1 ננוגרם / 1 קילוגרם.
מבחני ביוכימיים יכולים לשמש כדי לזהות את נוכחותו או פעילות של LCS לCNT עם רגישות גבוהה. עם זאת, שיטות אלה אינן interrogate היכולת של הרעלן להיקשר, להיכנס, להפעיל ותפקוד בתוך תאי עצב, ולכן הם אמצעים עקיפים ואולי מטעים של הנוכחות של רעלן פעיל. בניגוד לכך, מבחני פונקציונליים של שיכרון כגון assay הקטלני עכבר (MLA) באופן מקיף להעריך את היכולת של צינוריות לנהל משא ומתן בהצלחה את כל השלבים של ספיגה והפעלה, המספקים הערכות רלוונטיות יותר וספציפיות של פעילות רעלן. בעוד MLA הוא הזהב הסטנדרטי של זיהוי בונט, זה שיטת in vivo המשתמשת במוות כנקודת סיום, ולכן יש תועלת מוגבלת כפלטפורמת מחקר. גם ניסיונות לפתח מודלים מבוססי תאים של שיכרון CNT המתאים למחקרים מכניסטית והקרנה טיפולית סבלו מגבלות משמעותיות. בעוד תרבויות נוירון עיקריות מציעות רמה גבוהה של רלוונטי פיסיולוגי, השימוש בם הוא מסובך על ידי מספר הגורמים, כולל העלות גבוהה של משאבים, תשואה נמוכה יחסית, הנוכחות של תת עצביים מרוביםסוגים ופיקוח רגולטורים וניהוליים נרחב מעורב עם שימוש בבעלי חיים. כחלופה לנוירונים עיקרי, שורות תאים עצביות (שיכול להיגרם לאמץ תכונות כמו נוירון, על ידי גירוי כימי) כגון נוירובלסטומה ותאי chromaffin יותרת הכליה שימשו כמודלים במבחנה של שיכרון. מאחר ותאים אלה ברציפות תרבותיים לפני גיוס, הם ניתנים להרחבה ולכן מתאימים היטב לגישות מתונה תפוקה. עם זאת, את הרלוונטיות שלהם מוטלות בספק מאז פנוטיפים מושרה הם בדרך כלל הטרוגנית, הם גרועים רגישים לצינוריות ולא מצליחים להציג התנהגויות עצביות קריטיות, לרבות חוסר היכולת ליצור תאים לפני ואחרי סינפטי שיותכו סינפסות מתפקדת 4. בהעדר תאי presynaptic פיזיולוגי שלמים, מגוון רחב של רעלן: אינטראקציות תא עצב לא יכול להיות משוכפל ומדידות לכן פונקציונליות של שיכרון אינן אפשריות 5. לאt מפתיע, מנסה לנהל מחקרים מכניסטית או הקרנת סמים לBoNTs באמצעות שורות תאים עצביות הנגרמות הביאו לממצאים שאינם מתיישבים עם in vivo ומחקרי נוירון עיקריים 6.
זה כבר הציע שנובע נוירונים שמקורן בתאי מערכת עצבים מרכזיים (CNS) עשויים לספק פלטפורמה מבוססת תאי הדור הבא למחקר בונט, המשלבת את הרלוונטיות של נוירונים העיקרי עם הגמישות של שורות תאים בתרבית 7-10. בפרט, נוירונים גזע עכבר שמקורן בתאים (ESNs) כבר נמצאו להיות רגיש מאוד למינונים פיסיולוגיים של ונט / A- / G ולשכפל רבים בתגובות vivo לשיכרון, כוללים persistences ההפרש, שכרות משופר פעילות, וסרוטיפ חוזקי -specific 5,8,11. התנהגויות אלה מראים כי במנגנוני vivo של ספיגה בונט, עיבוד, סחר ופעילות נשמרות בESNs. עם זאת, עיכוב של activit הסינפטיy הוא ביטוי החתימה של בוטוליזם, ולכן הפגין הפסד של פעילות הסינפטית הבא שיכרון ידי צינוריות הוא חיוני לפני הגיע למסקנה שESNs הם מתאים במודל מבוסס תאים נגזר מבחנה ללימודי CNT.
כדי למדוד את ההשפעה של סמים עם CNTs על פעילות הסינפטית, אלקטרופיזיולוגיה תיקון- clamp כל התא הייתה בשימוש לכמת זרמי monosynaptic ב 21 + ESNs רכב שטופל או DIV שטופל CNT. מצאנו שיכרון של ESNs עם ונט / A- / G או באוהל שנגרם הפסד> 95% מפעילות הסינפטית בתוך 20 שעות בכל המקרים. אפיון נוסף שנערך 20 שעות לאחר כרות עם ונט / חשף השפעה תלויה-מינון בפעילות הסינפטית, עם הגבלה של הגילוי להלן 0.005 בערב, וערך IC 50 של 0.013 PM. ממצאים אלה מצביעים על כך שמסגרת הרגישות והשעה של זיהוי אלקטרו של שכרות הם השתפרו במידה ניכרת במהלך ana מבוסס immunoblot הדומהlyses של SNAP-25 מחשוף ובמבחנים קטלני עכבר vivo, הוכחה לכך שמידות פונקציונליות של שיכרון בתרבויות נוירון synaptically פעילים עשויות להקל שיטות רגישות יותר, ספציפיות ומהירה כדי לאפיין את התגובה התאית בונט.
Protocol
1. התאמת ESCs מזין תרבות השעיה ללא סלולארי
- ESCs הפשרה על 37 מעלות צלזיוס עד רסיס קרח נשאר.
- באמצעות pipet P1000, בעדינות להעביר 1-2.5 x 10 6 ניתקו ESCs לצלחת שטופלה תרבות הלא-רקמה המכילה 10 מיליליטר של מדיום ESC מחומם מראש. דגירה בתרבית רקמת חממת humidified במשך 20 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר 20 שעות, לשטוף תאים בעדינות על ידי העברת תרבות ההשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר באמצעות pipet סרולוגיות 10 מיליליטר. גלולה ESCs 3 דקות ב 200 x גרם. במהלך ספין, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום ESC הטרי חזרה למנה נמוכה הידבקות.
- לשאוב supernatant, לטפל כדי למנוע פירוק התא גלולה, ולהוסיף 1 מיליליטר בינוני ESC טרי ועד לתא גלולה. העבר את התאים לצלחת החיידקים באמצעות pipet P1000 ולחזור לחממה.
- שים לב תאים יומי עד אגרגטים להיות גלויים לעין בלתי מזוינת (בדרך כלל 4-8 הימים (ד); אגרגטים יהיו 0.2- 0.5 מ"מ). אם המצרפים אינם נראות לעין לאחר 4 ד, חזור על שלב 1.3. ברגע שאגרגטים גלויים, לנתק ולשמור על ESCs כפי שתואר בסעיף 2.
2. ESC Passaging ותחזוקה
- העבר את ESC אגרגטים לצינור חרוטי 15 מיליליטר באמצעות pipet 10 מיליליטר סטרילי ולאפשר אגרגטים להתיישב לגלולה קומפקטית (3 בדרך כלל - 5 דקות). לשאוב supernatant, להיות זהיר, כדי למנוע שיבוש התא גלולה, ולשטוף אגרגטים עם 5 מיליליטר PBS. למרות שיישוב כובד מומלץ, תאים לחלופין גלולה ב 100 XG במשך 2.5 דקות על מנת לחסוך בזמן.
- לשאוב PBS ולהוסיף 500 טריפסין μl. דגירה אגרגטים בטריפסין במשך 3 דקות באמבט מים ב 37 ° C. הוסף 500 בינוני ESC μl לדלל את טריפסין ועדינות triturate 10 פעמים עם pipet P1000 כדי לשבור את המצרפים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
- גלולה ניתקה תאים במשך 3 דקות ב 200 תאי XG וגלולים לריכוז סופי של 1.0x 10 7 / מיליליטר תאים בינוני ESC. העברה 150 μl (1.5 x 10 6 תאים) עד 10 מיליליטר של מדיום ESC הטרי בצלחת חיידקי 10 סנטימטרים ולחזור לתרבית רקמת חממה במשך 48 שעות. יכול להיות מובחן ESCs העודף, cryopreserved ל 1 - 5 x 10 6 תאים / מיליליטר ב 90% בינוניים ESC בתוספת 10% DMSO, או שהושלך.
- מעבר אגרגטים כל שעה 48. מצרפים מוכנים למעבר יהיו ברור לעין, בקטרים העולים על 0.5 מ"מ.
הערה: הפשרה ותרבות של תאי cryopreserved, מותאם השעיה הם השיגו לצעדים 1.2-1.4. מצרפים יהיו מוכנים לpassaging בתוך 48-72 שעות.
3. הבחנה עצבית
הערה: ניהול השלבים 3.1-3.5 לפני הצהריים וצעד 3.7 לאחר הצהריים. סקירה של נהלי הבידול מוצגת באיור 1 א.
- לנתק ESCs כמו בשלבים 2.1-2.5. μl העברה 350 (3.5 x 10 6) של לנתקESCs ד למנה נמוכה מצורף 10 סנטימטרים המכילה בינוני בידול 25 מיליליטר. מניחים על שייקר מסלולית מוגדרת 30 - 45 סל"ד בתוך תרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זה הוא היום הראשון של בידול, היום כינה במבחנה (DIV) -8.
הערה: השימוש במנת קובץ מצורף נמוכה במיוחד מגדילה את העלות של השיטה, אבל מייצרת תשואות מעט גדולות יותר מצלחות פטרי חיידקים מאז אגרגטים לעתים יכולים לדבוק צלחות פטרי. אם גדלים שונים מנה מועדפים, וניתן לשנות כמויות בינוניות ומספרים סלולריים בהתאם. - לאחר 48 שעות (-6 DIV), השתמש 25 מיליליטר pipet להעביר אגרגטים תא הבחנה לצינור חרוטי 50 מיליליטר. מייד להוסיף 25 מיליליטר טרי של מדיום בידול לצלחת פטרי.
- לאפשר אגרגטים להתיישב על 2-5 דקות, הפקת גלולה גלויה שהיא 1 - 2 מ"מ עמוק. להתעלם תאים בודדים או אגרגטים קטנים שנותרו בהשעיה. בזהירות לשאוב הבינוני ולהעביר את cell גלולה חזרה לצלחת פטרי באמצעות P1000. מניחים על שייקר סיבובי בתרבית רקמת חממה.
- בחזור על השלב -4 DIV 3.2. גלולה תהיה 2-4 מ"מ עמוק. החלף בינוני בידול 30 מיליליטר בתוספת 6 מיקרומטר כל-טרנס החומצה רטינואית (RA) לצלחת פטרי. חזור אל ייקרתי סיבובי בתרבית רקמת החממה ל48 שעות נוספות.
- בחזור על השלב -2 DIV 3.3. גלולה תהיה 4-8 מ"מ עמוק בשלב זה.
- בDIV -1, להכין משטחי ציפוי בסעיף 4.
- בDIV 0, להפשיר 5 מיליליטר של מדיום trypsinization NPC-aliquoted מראש וקפוא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות ומקום במכסת מנוע בתרבית רקמה. באמצעות pipet 25 מיליליטר, העברת הבחנה אגרגטים לצינור חרוטי 50 מיליליטר. לאפשר אגרגטים להתיישב ובינוניים לשאוב בזהירות. לשטוף גלולה פעמיים עם 10 מיליליטר PBS, המאפשרת המצרפים ליישב בין שוטף.
- לאחר לשטוף PBS השני, להוסיף 5 מיליליטר של מדיום trypsinization NPC לגלולה ולדגור על 376; צלזיוס למשך 5 דקות. בעדינות קפיצית הצינור לאחר 2.5 דקות.
- הוסף 5 מיליליטר של 0.1% מעכבי טריפסין הסויה (STI) כדי להשבית טריפסין ומערבבים על ידי היפוך. בעדינות triturate 10-15 פעמים עם pipet 10 מיליליטר סרולוגיות עד השעיה תא הומוגני יחסית מיוצרת.
- לאט לאט להעביר את ההשעיה התא למסננת תא 40 מיקרומטר או 70 מיקרומטר ממוקמת בחלקו העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. ברגע שכל ההשעיה סוננה, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום N2 לשטוף תאים הנותרים דרך המסנן וגלולת ההשעיה התא ניתק במשך 6 דקות ב 200 x גרם.
- בינוני לשאוב מבלי להפריע גלולה. שטוף תאים פעמיים עם מדיום N2 10 מיליליטר, pelleting תאים למשך 5 דקות ב XG 200 וtriturating בין שוטף עם P1000. לפני לשטוף את השני, לספור תאים באמצעות hemocytometer.
- תאים גלולים במדיום N2 ב1 x 10 7 תאים לכל ESNs מיליליטר וצלחת בצפיפות תאים של 150,000 - 200,000 תאים / 2 סנטימטר.
- העבר את פלאט חדשed ESNs לחממת humidified תרבית רקמה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולשמור בסעיף 5.
4. הכנת משטחים לציפוי תרבות עצבית מבשרי בDIV 0
- להכין מאכלים שטופל בתרבית רקמה לפחות יום 1 לפני הציפוי. להוסיף polyethyleneimine מספיק (PEI; 25 מיקרוגרם / מיליליטר בסטרילי H 2 O) או poly-D- ליזין (PDL; 100 מיקרוגרם / מיליליטר בסטרילי H 2 O) כדי לכסות טופלה רקמות תרבות צלחות פלסטיק ודגירת O / N ב 37 ° C.
- בוקר של ציפוי, לשטוף כלים פעמיים עם H-מזוקק כפול 2 O ופעם אחת עם PBS. לאחר לשטוף הסופי, להוסיף בינוני N2 מספיק כדי לכסות את הצלחת (למשל, 1 מיליליטר לכל טוב של צלחת 12 גם או 4 מיליליטר למנת 6 סנטימטרים).
- הכן 18 מ"מ זכוכית coverslips לפחות יום אחד לפני ציפוי נוירון. coverslips נקי על ידי למשך 4 דקות לניקוי פלזמה.
- מייד להעביר coverslips ניקה לparafilm-שטף אתנול בתחתיתצלחת וסטרילי גדולים להוסיף 400 μl של פתרון PEI או PDL, מוכן כמו בשלב 4.1. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה.
- בבוקר, לשטוף coverslips שלוש פעמים עם מים ולהוסיף laminin / ml 5 מיקרוגרם בPBS ל1-3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לפני מתנער נוירונים, לשאוב את laminin ומייד להעביר את coverslip לטוב של צלחת 12-היטב המכילה 1 מיליליטר של מדיום NPC, להיות בטוח כדי לשמור על הצד שטופל פונה כלפי מעלה.
- מנות החנות וcoverslips על 37 מעלות צלזיוס עד NPCs מוכנים לצלחת.
5. תחזוקה של נוירונים
- בDIV 1, בינוני לשאוב ולהחליף עם מדיום תרבות N2.
- בDIV 2 ו -4, בינוני לשאוב ולהחליף עם מדיום תרבות B27.
- בDIV 8, בינוני לשאוב ולהחליף עם מעכבי mitotic מדיום תרבות B27 המכיל לחסל זיהום תאים שאינם עצביים.
- בגיל 12 DIV, להחליף עם מדיום תרבות B27.
- אל תסיר DIV12 + ESNs מ -5% CO 2 עד מוכן לשימוש.
6. עיכוב מדוד של Synaptic הילוכים (MIST) Assay לכימות זרמים מעורר פוסט-סינפטי מיניאטורי
זהירות: neurotoxins Clostridial הם חומרים הרעילים ביותר הידועים, עם LD האנושי המשוער 50 ערכים נמוכים כמו 0.1-1 ng / kg. קבלת אישורים נחוצים לפני שימוש רעלים אלו ולהשתמש באמצעי זהירות מתאימה.
- לדלל בונט / בזהירות כדי 100x הריכוז הרצוי סופי במדיום תרבות ESN וחם עד 37 מעלות צלזיוס. הוספת נפח המתאים של רעלן לדיב 21 ESN + תרבויות, לערבל את המנה התרבות, ולחזור לחממה.
- אם תאים ינותחו יותר מ -4 שעות לאחר הרעלה, להוסיף רעלן לצלחת והמערבולת מבלי להסיר מ5% CO 2, כגון ישירות בחממה או בCO 2 קאמרי קבועה.
- בנקודת זמן המתאימה, ASPIRAte ESN מדיום התרבות ולשטוף פעמיים עם חיץ תאי הקלטה (ERB). הוסף 4 מיליליטר של ERB בתוספת 5.0 מיקרומטר tetrodotoxin ו -10 bicuculline מיקרומטר, חסימת פוטנציאל פעולה וקומם על GABA פעילות קולטן, בהתאמה.
- העבר את הצלחת לאסדת אלקטרופיזיולוגיה. לא שליטת זלוף לא טמפרטורה דרושה לassay הערפל.
- משוך זכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ micropipette לייצר פיפטה הקלטה עם 5-10 mΩ של התנגדות ולמלא עם חיץ הקלטה תאית. בעדינות לטבול פיפטה הקלטה מולא בsiliconizing מגיב לפני ההקלטה.
- באמצעות מזרק מלא באוויר, לספק לחץ חיובי כפיפטה ההקלטה היא הורידה לERB. לאחר הנחיתה בעדינות פיפטה ההקלטה על סומה של נוירון שיירשם, להסיר את הלחץ חיובי ויוצר gigaseal. להקטין את מתח ההחזקה ל-70 mV. זהירות להחיל לחץ שלילי לפרוץ לתצורת כל התא.
- Switch to נוכחי מהדק כדי לפקח ולהקליט פוטנציאל מנוחה קרום. ללא התאמה לפוטנציאל צומת נוזלים, פוטנציאל הממברנה המנוחה יהיה בין -67 ל-82 mV.
- לבצע הקלטת מתח מהדק רציפה -70 mV ל4-5 דקות כדי לזהות זרמים מעוררים זעירים פוסט-סינפטי (mEPSCs).
- לנתח 4 דקות של הנתונים שנרשמו לגילוי mEPSC באמצעות תוכנת זיהוי ספייק עם ההגדרות הבאות: סף, 5; התקופה לחפש מקסימום מקומי, 10,000 μsec; זמן רב לפני שיא בתחילת מחקר, 5,000 μsec; התקופה לחפש זמן דעיכה, 20,000 μsec; חלק קטן משיא למצוא זמן דעיכה, 0.37; תקופה ממוצעת של בין תחילת המחקר, 1,000 μsec; אזור סף, 20; מספר נקודות לשיא ממוצע, 1; כיוון השיא, שלילי.
- לאסוף ולשמור את המידע על אירועים שזוהו. מחלקים את מספר האירועים שזוהו ב 4 דקות 240 על ידי כדי לקבוע את תדירות mEPSC בהרץ.
- לאסוף תדרי mEPSC ל8-12 המשךrols ו8-12 דגימות שטופלו בונט לכל מצב חשיפה. לנתח תדירות נגד גיל ובקרה בהתאמה הרבה. לקבוע את המובהקות הסטטיסטיות של עיכוב% מפעילות הסינפטית באמצעות כיוון אחד ANOVA בדיקה והבדיקה לאחר מעשה-של Dunnett.
Representative Results
פיתחנו פרוטוקול בידול המאפשר הייצור הכלכלי של כמויות גדולות של תאי עצב שמקורם בתאים גזע הטהור ביותר מESCs העכבר (מפורט באיור 1 א) 8,11. שיטה זו נעשתה שימוש על פני תקופה של שנים כדי לבדל reproducibly קווי ESC פרטי שנוצרו וזמינים באופן מסחרי לנוירונים של שושלות מוגדרות 12-14. אלמנטים קריטיים של פרוטוקול זה כוללים (1) הסתגלות של ESCs למזין תרבות השעיה תא ללא; (2) תחזוקה נאותה של תרבויות השעיה; ו- (3) בידול בתנאים סיבוביים. מעבר לתרבות השעיה מפחית באופן דרמטי את הזמן ועלות של אחזקת ESC, ומייתר את הצורך להסיר את התאים מזינים לפני ההתמיינות. בעקבות הסתגלות השעיה, Oct3 / 4 ביטוי עולה בקנה אחד באמצעות לפחות 30 קטעים, מצביע על כך שהסתגלות ההשעיה אינו משנה ביטוי של סמני pluripotency (איור 1 ב-D 7 תאים לכל קטע. זו מתרחשת בדרך כלל תוך עשרה קטעים לאחר הסתגלות השעיה או חמישה מעברים לאחר ההפשרה של ESCs שהיו בעבר מותאם השעיה. סיבוב מכאני של הבחנה אגרגטים נמצא גם להיות קריטי לתשואה עצבית מוגברת. התוספת של ייקר סיבובי בוטלה היווצרות סופר כוללת, הגדלת כדאיות כוללת והפקת עלייה ~ 300% בתשואה של תאים עצביים אב (NPCs) בDIV 0 (איור 1E).
בידול אופייני מתחיל עם 3.5 x 10 6 ESCs בDIV -8 ומייצר 115 x 10 6 NPCs בDIV 0, כ -60% מהם ישרוד והפכו נוירונים. 40% הנותרים מהווים תאים שאינם עצביים ובוטלו במידה רבה על ידי מניעת סרום בין DIV 1 - 0. המספר הקטן של מתמיד גליה ניתן להסיר על ידי תוספת של Inh mitoticibitors מDIV 2 - 4 או 8 DIV - 12. צפיפות ציפוי הוא קריטי בDIV 0; נוירונים מצופים גם בדלילות לא ישרדו מעבר 2 שבועות. ימים ספורים לאחר הציפוי, הנוירונים נבדלים תערוכת מורפולוגיות עצביות ולמדר חלבוני neurotypic, כגון MAP2 סמן somatodendritic וסמן axonal טאו (איור 2 א). ניתן לזהות על ידי 14 DIV synapsin-1 + puncta בממשקים axodendritic, מרמזים על היווצרות הסינפסה. זה עולה בקנה אחד עם הביטוי של חלבוני סמן הסינפטי לפני div 7 8,11. מורפולוגיות עצביות ימשיכו להתבגר דרך DIV 21, שבתרבויות הזמן להפגין סוכות axodendritic משוכללות וpuncta הגדול הסינפטי (איור 2 א). אם נשמר כראוי, ESNs להישאר קיימא ופעיל לפחות 4 שבועות לאחר ציפוי.
פרופיל ביטוי אורך באמצעות RNA-רצף אומת ראיות מורפולוגיים וproteomic של מפרט עצביד בשל 11,15. סמני נציג של התקדמות התפתחותית הציגו פרופילי ביטוי בשלב מסוים, כוללים Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN וKCC2 (איור 2). על ידי DIV 0, ESNs הביע עותקי שפע של חלבונים מבניים נוירון ספציפי, כוללים MAP2 וטאו. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים, סמנים רק לשני תת-סוגים עצביים נצפו: תאי עצב להביע VGLUT2 המוח התיכון / למוח האחורי glutamatergic וinterneurons GABAergic 8. במקביל, במגוון רחב של סמני glutamatergic וGABAergic הציג עליות חדות בביטוי בין DIV 0 ו -7 DIV, כוללים חלבוני מלכודת מראש הסינפטי הנדרשים לשחרור הנוירוטרנסמיטר; קולטני הנוירוטרנסמיטר נדרש לתגובות פוסט-סינפטי; וחלבוני פיגומים נדרשו לקשור קולטנים אלה קרום פוסט-סינפטי. נוירונים להציג מאפיינים חשמליים פנימיים בוגרים על ידי DIV 14 וזרמים מעוררים זעירים ספונטניים שלאחר הסינפטי על ידי DIV16 16.
העיכוב המדוד של הילוכים assay Synaptic (MIST) שימש כדי להעריך את ההשפעה של שכרות בפעילות הסינפטית. על ידי השוואה בין תדרי mEPSC DIV השיכור ורכב שטופל 24 + ESNs, אובך מספק מדידת כמותית והספציפית של שיכרון המבוססים על העיכוב התפקודי של פעילות הסינפטית (איור 3 א). הערפל היה משמש למדידת ההשפעות של ונט / A- / G או באוהל על פעילות הסינפטית בESNs ב 20 שעות לאחר בנוסף אמבטיה של כל רעלן. רעלים נוספו בשווה ערך לריכוז פי 10 ערך EC 50, כפי שנקבע בעבר על ידי ניתוח immunoblot של מחשוף חלבון מלכודת 11. כל הרעלים מופחתים תדרי mEPSC פחות מ -5% בקבוצת ביקורת שטופל ברכב. הפחתות בשיעורים הסינפטי לא היו מיוחסות למוות של תאים או תגובות פנימיות שינו, מאז ESNs השיכור היו מסוגל להיות טלאים, ירו פוטנציאל פעולה חוזר ונשנהבתגובה להזרקה נוכחית ולא הראה שום שינוי משמעותי בפוטנציאל מנוחה קרום (איור 3 ב, ג).
כדי להשוות את הרגישות של ערפל לשיטות קיימות כדי לזהות צינוריות, המגבלה של איתור וריכוז מעכב חציון (50 IC) נקבעו 20 שעות לאחר תוספת של ונט / לESNs. שיכרון על ידי קטן כמו 0.005 PM ונט / פיק ירידה משמעותית סטטיסטי בתדירות mEPSC, עם ערך IC 50 של 0.013 בערב, והשתקה של פעילות הסינפטית מעל 12:05 (איור 4 א) מלאה. ערך IC 50 זה מתאים ליחידות קטלניות כ 0.5 עכבר / מיליליטר, המצביע על הערפל שהיא פי שתיים רגיש ו2- לפי 4 מהר יותר מאשר MLA בגילוי הנוכחות של ונט /. מדידות immunoblot של SNAP-25 המיוצרים על מחשוף ערך EC 50 של 0.38 בערב, ומנה לגילוי מינימאלית של 0.05 בערב, מצביע על כך שהערפל הוא כ פי 30 יותר רגישמ זיהוי מבוסס immunoblot של חלבונים ביקעו מלכודת (איור 4).
1. ESNs מותאם השעיה איור להישאר יציב mitotically ולהביע את הסמנים של pluripotency. () סכמטי של תחזוקת ESC ובידול. הנוכחות או עדר של חומצה רטינואית (RA) או גורם המעכב לוקמיה (LIF) מתאפיינת ב+ או -. השוואה בין ימים במבחנה (DIV) ושלבי התפתחות קלאסיים (DS) לתרבויות נוירון עיקריות מסופקת 17. שיעורים (B) למניעת הפצת נשק לR1, D3 ושורות תאי C57BL / 6J ES לייצב על ידי חמישה מעברים לאחר מעבר לתרבות השעיה. (ג) זרימת נתוני cytometry להפגין לא חלה שינוי מהותי בOct3 ביטוי / 4 בR1, D3 ושורות תאי C57BL / 6J ES נמדד מעל 25 מעברים בתרבות השעיה (n = 6 לכל אחד). (ד) תשואות תא בפועל בpassaging השגרתי לקו R1 ESC מותאם השעיה נמדד בין קטעים 5 ו -30 (קו שחור). תשואות מצטברות תיאורטיות אם אין תאים מבוטלים במהלך passaging גם מוצגות (קו אדום). (E) תמונות בהירה שדה של אגרגטים DIV 0 מיוצרים תחת סטטי (משמאל) או תנאים סיבוביים (מימין). תנאי רוטרי מיוצרים אגרגטים כדוריים ללא מסכת והגדילו NPC תשואות של פי 3 (p <0.001, נקבעו באמצעות מבחן t) 11. * מציין P <0.05. נתון זה שונה מet al האברד. 11 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מורפולוגי, יחסי הציבורראיות oteomic וtranscriptomic של מפרט והתבגרות עצביים Immunocytochemistry () מDIV 7 -. DIV 49 מדגים arborization העצבי ואת המראה של puncta הסינפטי בממשקים axodendritic. אקסונים מסומנים עם טאו (ירוק), דנדריטים מסומנים עם MAP2 (אדום), תאים טרום-סינפטי מסומנים עם synapsin (לבן), וגרעיני מגואלות DAPI (כחול). פרופיל ביטוי של גני אורך נציג מפגינים ביטוי בשלב מסוים התפתחותיים ומפרטים תת עצבי (B). כל תעתיקי גנים באים לידי ביטוי כמספר משוער של תמלילים לכל תא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ESNs תחת. ללכת עיכוב של פעילות הסינפטית כאשר הם נחשפים לונט / AG ואוהל () עקבות נציג מESNs נאספו 20 שעות לאחר בנוסף אמבטיה של ~ 10 x 50 EC ערכים של ונט / - / G, אוהל או רכב. כל עצבים מופחתים פעילות הסינפטית על ידי למעלה מ -95% בהשוואה לקבוצת ביקורת. נוירונים שיכורים (B) נשארו מסוגלים לירות נקודתי גישה חוזרות ונשנות בתגובה לdepolarizing הזרקה נוכחית (כפי שהודגם בונט ל/, אבל נצפו בכל התרבויות השיכורים) ו- (ג) לא הראה שום שינויים בקרום המנוחה השלילי אפשרי (C; n> 18 לכל טיפול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טופלה קביעת איור 4. הרגישות של ערפל בונט /ESNs. () מדידות ערפל של פעילות 20 שעות הסינפטי לאחר תוספת של האמבטיה בונט /. מגזרי עקבות מתח מהדק נציג הציגו ירידה בתדירות mEPSC הבאה בונט / חשיפה (בצד שמאל). לכמת את תדירות mEPSC (גרף עמודות, צד ימין, n = 20 עבור פקדים; n = 11-22 לכל מנה) מאשר ירידה תלויה-מינון בתדירות mEPSC. הריכוז המעכב החציון נקבע עם ריבועים פחותים בכושר של רגרסיה שאינה ליניארי באמצעות מדרון ארבעה פרמטר משתנה (R 2> 0.91). שים לב לגבול של זיהוי על ידי ערפל בESNs הוא לפחות 0.005 PM. (ב) בונט / שיכרון של תוצאות ESNs במחשוף של SNAP-25 כמדמיין ידי משמרות ניידות ג'ל (כתם מערבי נציג בצד השמאל עם כימות גרף עמודות המציג של SNAP-25 מחשוף מהימין; n = 4) . שים לב לרגישות ירד באמצעות מחשוף מלכודת חלבון (SNAP-25) כנקודת סיום (EC 50 של 0.36 בערב) לעומת 50 של 0.013 PM). * מציין P <0.05; *** מצביע P <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
תקן הזהב הנוכחי לגילוי CNT, נחישות סרוטיפ וכימות הוא MLA. MLA חוקר את כל הטווח של מארח: מחשוף אינטראקציות רעלן הנדרשות לשיכרון להתרחש in vivo (למשל, רעלן מחייב לקולטן תא שטח, הפנמה של מתחם טוקסין הקולט, טרנסלוקציה LC לתוך הציטופלסמה, בתיווך LC של מצע ו עיכוב של העברה עצבית הסינפטי) 18. עם זאת, למרות שMLA מציע מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של שכרות, זה מצריך משאבים רבים, יכול להיות מבולבל על ידי מזהמים וכרוכים מספר גדול של עכברים עם מוות כנקודת סיום. לחלופין, מבחני מבוססי תאים לזיהוי בונט וquantitation היו מוגבלים לתרבויות נוירון העיקריות, שמחייבים גם שימוש בבעלי חיים, או לשורות תאי נוירובלסטומה, שאינן מצליחות ליצור סינפסות ובדרך כלל מפגין רגישות העניים neurotoxins 8. עד כה, רוב המדידות של שיכרון בהפלטפורמות מבוססות תאי ESE יש לסמוך על זיהוי של מחשוף מפרקי החלבונים של SNAP-25, VAMP1 / 2 או syntaxin-1 11. זה בעייתי כי מחשוף חלבון מלכודת הוכח להיות לא-ליניארי הקשורים לעיכוב סינפטי in vivo, ולכן ייתכן שלא לייצג במדויק שיכרון או התאוששות מהשיכרון 19,20.
מערכת מודל אידיאלית מבוסס תאים לגילוי CNT הייתה (i) תהיה מבוסס נוירון; (Ii) להיות יחד synaptically עם תגובות חשמל neurotypic; (Iii) להיות רגיש מאוד לכל הזנים אל או תת CNT; וכן (iv) פעמים ההצעה מדרגיות, תפוקה וassay שהן שווי ערך לאו השתפר MLA, במחיר נמוך יותר, וללא צורך בשימוש בבעלי חיים. כדי לעמוד בדרישות אלה, פיתחנו שיטה להפקת כמויות גדולות של תרבויות מועשרים, ברשת של glutamatergic ונוירונים GABAergic מקווי ESC העכבר זמינים מסחרי. לאחר מכן, אנו פיתחנו את assay MIST לכמתעיכוב סינפטי בתגובה לשיכרון עם אוהל וונט / A- / G. בעוד assay הערפל יכול להתנהל על כל אוכלוסיית נוירון synaptically פעילה (למשל, תאי עצב ראשוניים או פרוסות מוח), כיום ESNs הוא רק במודל נוירון מבחנה נגזרת שreproducibly מפתחת התנהגויות רשת מתהווה, ולכן מתאים לassay הערפל.
לייצר כמויות מספיקות של תאי עצב של שושלת מוגדרת ללימודי CNT נדרש כמה חידושים בתרבות ESC ובידול. ראשית, על ידי הבחירה ולculturing ESCs שיכול לשרוד השעיה-הסתגלות, אנו מבטלים את הפוטנציאל לזיהום על ידי תאים מזינים והצורך לטהר את התאים מזינים מESCs בתחילת הבידול. למרות המנגנונים המולקולריים שבבסיס השעיה-הסתגלות אינם ידועים, ESCs מותאם השעיה יישאר mitotically פעיל, לשמור Oct3 / 4 ביטוי וימשיך להיות מקור עצבי. באמצעות שיטה זו, ~ 1.5 x 10 7 Eמאמנים בדרך כלל הם התאוששו כל קטע. שנית, הייצור של NPCs הוגדל ~ 300% על ידי שילוב תסיסה מכאנית למנוע מסכת במהלך התמיינות, לכאורה הגדלת נגישות תזונתית לעיצוב הפנים של אגרגטים. במהלך התהליך, מצאנו כי בסרום משמש לתרבות ESC והבחנה עצבית הוא המרכיב הקריטי ביותר בשמירה על ESCs neurogenic. להצלחה הטובה ביותר, אנו ממליצים השעיה התאמת תאי גזע עובריים לכל מנה של סרום ולאגור סרום ב -20 ° C כדי לתמוך בתרבות ESC והבחנה עצבית ועד למועד הפקיעה.
כמו ברוב התרבויות synaptically פעילים, DIV 14 + ESNs רגישים מאוד לשינויים פתאומיים בpH, ואפילו חשיפה קצרה לCO באטמוספרה 2 ריכוזים יכולים לגרום לרעילות עצבית בתוך 24 שעות. לניסויים הדורשים טיפול של תרבויות ואחריו נמשך incubations O / N או יותר, יש להתייחס אליהם באופן ישיר נוירונים in החממה או הועבר לCO 2 קאמריים קבוע לפני ניסויים.
מגוון של טכניקות אישר הנוירוגנזה והבשלה עצבית, כולל ICC, פרופיל תעתיק ואלקטרופיזיולוגיה תיקון- clamp כל התא. שינויים זמניים בביטוי גנים ומורפולוגיה נוירון בקנה אחד עם התקדמות מהירה דרך שלבי התפתחות של neurogenesis, ועל ידי DIV 16, ESNs הציג מעורר וזרמי פוסט-סינפטי מיניאטורי מעכבים עם רשת מתהווה התנהגויות 16. ראיות לפעילות הסינפטית הציעו שESNs יכול לשכפל את pathophysiologies האחראי לביטויים הקליניים של בוטוליזם וטטנוס. זו אושרה על ידי השימוש בMIST להראות שכרות שעם ונט / A- / G או תדרי mEPSC אוהל נפגעים על ידי> 95% בהשוואה לתאי עצב רכב שטופל או לא טופלו.
מדידות של הרגישות של ערפל לונט / הצביעו מעכבת חציוןריכוז (IC 50) של 0.013 PM (שווה ערך ליחידות / מיליליטר קטלני 0.5 עכבר) וגבול-של-גילוי להלן 0.005 PM, נמדד ב 20 שעות לאחר בנוסף אמבטיה. בהתבסס על ערכים אלה, הערפל הוא בערך פי שניים רגיש ו2-4 פעמים מהר יותר מאשר MLA ופי 30 יותר רגישים מאשר זיהוי מבוסס immunoblot של SNAP-25 ביקע.
באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שאוכלוסיות ברשת של תאי עצב שמקורם בתאים גזע מציעות מודל של שיכרון רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, המבוסס על תאים. בשילוב עם שיטות משופרות לנובעות תרבויות ESN רשת מESCs מותאם השעיה, השימוש של ערפל צריך להפחית את הצורך בניסויים בבעלי חיים והחסרונות הנלווים, עלויות וחששות אתיים של MLA תוך מתן אמצעי מהיר יותר, רגיש וספציפי של שיכרון. למרות electrophysiology תיקון- clamp כל התא היא שיטה נמוכה תפוקה לזיהוי הנוכחות של neurotoxins הפעיל, היא מציעה רזולוציה וSPEed כי הוא בלתי ניתן להשגה תוך שימוש בשיטות מולקולריות. ממצאים אלה מספקים גם ראיות לכך שהיישום של שיטות פעילות תלויה להעריך פעילות הסינפטית והתנהגות רשת עשויה לאפשר זיהוי המהיר וספציפי של neurotoxins. גישות גבוהה יותר תפוקה כזו תגרום מחקרים מכניסטית, הקרנה טיפולית או מבחני אבחון ריאלי עבור מגוון רחב של סוכני neuromodulatory, כוללים הצינוריות.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות המכון לאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AOD12058-0001-0000 מספר רשות העתיקות) והפחתת סוכנות איום ביטחון - משותף למדע וטכנולוגית משרד, (CBM.THRTOX.01.10 מספרי מענק S & T אגף הרפואי .RC.023 וCBM.THRTOX.01.RC.014). מחקר זה בוצע בזמן שהחזיק PB איום ביטחון הפחתה-לאומי סוכנות מועצה למחקר מחקר Associateship פרס וKH נערך מחקר Associateship פרס מועצה הלאומית למחקר. אנו מודים לאנג'לה אדקינס וKaylie Tuznik (USAMRICD) לקבלת סיוע טכני; וסינדי קרונמן (USAMRICD) עבור עריכה סיוע. הדעות המובאות במאמר זה הן אלה של הכותבים ואינם משקפות את המדיניות הרשמית של המחלקה לצבא, משרד הגנה, או ממשלת ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
- Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
- Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
- Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
- Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
- Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
- Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
- Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127 (2012).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
- Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423 (2013).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
- Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).
