Abstract
시냅스 대상 클로스 트리 디움 신경독 (탄소 나노 튜브)의 치료 기작 연구 기능 시냅스를 생성하고 중독에 생리적 반응을 거쳐 확장 성, 셀 기반 모델의 필요성에 의해 제한되고있다. 여기에서 우리는 효율적으로 시냅스 활성, 네트워크 뉴런의 정의 계통에 쥐의 배아 줄기 세포 (는 ESC)를 구별하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다. 8 일 분화 프로토콜에 따라, 마우스 배아 줄기 세포 유래 신경 세포 (하는 ESN)를 신속하게 표현하고 neurotypic 단백질을 구획 신경 세포의 형태학을 형성하고 고유의 전기적 반응을 개발할 수 있습니다. 억제 밸런스 : 차별화 후 18 일 (DIV 18)으로하는 ESN이 활성화 글루탐산과 γ - 아미노 부티르산 (GABA) ergic 시냅스와 흥분을 특징으로 응급 네트워크 동작을 나타낸다. 탄소 나노 튜브와 중독 기능적으로하여 일을 복제, 시냅스의 신경 전달을 길항 있는지 여부를 확인하려면전자의 보툴리누스 중독 또는 파상풍의 임상 양상에 대한 책임 병태 생리, 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학은 파상풍 신경 독소 (텐트) 또는 보툴리눔 신경 독소에 노출하는 ESN 자발적 소형 흥분성 시냅스 후 전류 (mEPSCs) (본트)을 정량화하는 데 사용 된 생체 혈청 형 / A- / G. 모든 경우에, 20 시간하는 ESN 내 시냅스 활성의 거의 완전한 손실을 나타냈다. 변경 쉬고 막 잠재력과 고유 전기 반응에 의해 입증 된 바와 같이 술에 취한 뉴런, 가능한 남아 있었다. 또이 방법의 민감도를 특성화하기 위해, 시냅스 활성에 중독의 투여 량 - 의존적 효과 본트 / A 첨가 한 후 20 시간을 측정 하였다. 0.005 μM의 본트 / A와 중독은 0.013 (PM)의 평균 억제 농도 (IC 50)와, mEPSCs에 상당한 감소 결과. 중간 용량의 비교는 시냅스 억제 기능 측정이 빠르고, 더 구체적이고 SNARE보다 더 민감하다는 표시절단 분석법 또는 마우스 치사 분석. 이러한 데이터는 탄소 나노 튜브의 민감도와 특이도가 매우 높은 검출을위한 시냅스 결합, 줄기 세포 유래 신경 세포의 사용을 확인합니다.
Introduction
이 방법의 전체 목표는 기능적으로 클로스 트리 디움 신경독에 노출 된 줄기 세포 유래 신경 세포 배양에서의 네트워크화 시냅스 활성을 평가하는 것이다. 이 기능 보툴리누스 중독의 임상 양상에 대한 책임 pathophysiologies 복제 및 탄소 나노 튜브, 치료 검사 및 역학적 연구의 검출을위한 적합한 모델로하는 ESN의 유효성을 검사 체외 파생 모델의 첫 번째 데모입니다.
BoNTs은 클로 스트 리듐 종의 구성원에 의해 생성 된 매우 치명적인 박테리아 신경 독소입니다. 최근에 제안 된 본트 / H를 포함, 여덟 항원 별개의 본트의 혈청 형 (/ A- / H) 1, 2를 설명 하였다. 모든 혈청 형이있다 150 kDa의 펩타이드로 표현 번역 후 3 이황화 결합에 의해 연결된 100 kDa의 중쇄 (HC)로 이루어지는 dichain 및 50 kDa의 경쇄 (LC)이 생성하는 칼자국. HC는 시냅스 수용체와 ENT에 결합 중재시냅스 엔도 시토 시스를 통해 신경 세포에 독소의 공예. 엔도 솜 처리 중에, HC는 시냅스 세포질 내로 LC의 전좌를 촉진 소포 막에 공극을 형성하는 구조 개편을 겪는다. LC는 다음 구체적 대상과 연접 구획 절단 용해 N -ethylmaleimide에 민감한 융합 부착 단백질 수용체 (SNARE) 단백질 : SNAP-25 (본트 / A / C / E), VAMP2 (본트 / B, / D, / F / G) 또는 신택 (본트 / C) 1. 이 SNARE 단백질 중 어느 절단하여 신경 전달 물질의 방출을 차단, 시냅스 세포 외 유출 기계의 조립을 방지 할 수 있습니다. 효율적인 타겟팅 및 시냅스 전 신경 지역화의 조합은 가장 강력한 독 0.1 정도의 낮은 추정 된 인간 치사량 공지 BoNTs 렌더링 - NG를 1 / 1 kg이다.
생화학 적 분석은 감도가 높은 CNT의 LC의 존재 또는 활성을 검출하기 위하여 이용 될 수있다. 그러나 이러한 방법은 내가 실패바인딩 입력 독소 nterrogate 능력을 활성화하고 뉴런 내 기능, 따라서 활성 독소의 존재와의 간접적 인 측정 가능한 오해이다. 대조적으로, 이러한 마우스 치사 분석 (MLA) 등의 기능 분석 중독 종합적 독소 활성의 구체적인 관련성 평가를 제공 성공적 흡수 및 활성화의 모든 단계를 협상하는 탄소 나노 튜브의 능력을 평가한다. MLA는 본트 검출 금 표준이지만, 그것은 종단점으로 죽음을 사용 생체 방법이며, 따라서 연구 플랫폼으로 제한 유틸리티를 갖는다. 역학적 연구와 치료 심사에 적합한 CNT 중독의 셀 기반 모델을 개발하는 시도는 상당한 한계를 겪었다. 일차 배양 신경 생리 학적 관련성이 높은 수준을 제공하지만, 이들의 사용은 높은 리소스 비용, 상대적으로 낮은 수율, 여러 신경 하위의 존재를 포함하여 다수의 인자에 의해 복잡유형과 동물의 사용과 관련된 광범위한 규제 및 관리 감독. 차 뉴런에 대한 대안으로서, 예컨대 신경 아세포종 세포 및 부신하는 chromaffin 등 (화학적 자극에 의한 신경 세포와 유사한 특성을 채택하도록 유도 될 수있다) 신경성 세포주를 중독의 시험 관내 모델로서 사용되어왔다. 이러한 세포를 유도하기 전에 지속적으로 배양하기 때문에, 그들은 고도의 확장 성 및 중간 처리량 접근 방식에 대한 따라서 적합하다. 유도 표현형은, 일반적으로 이질적 탄소 나노 튜브에 제대로 민감하고 기능 시냅스 (4)에 조립 사전 및 사후 시냅스 구획을 형성하는 무능력을 포함하여 중요한 신경 행동을 전시하는 데 실패하기 때문에, 자신의 관련성이 의심됩니다. 생리 그대로 연접 구획 부재에서 독소의 전체 범위 : 신경 세포의 상호 작용은 복제 될 수없고, 따라서 기능적 중독 측정은 5 불가능하다. 아니t은 놀라 울 정도로, 기계 론적 연구 또는 유도 된 신경 인성 세포주를 사용하여 BoNTs에 대한 약물 검사에서 생체 및 기본 신경 세포 연구 (6)과 일치하지 않는 결과로 이어질를 수행하려고 시도합니다.
이것은 세포 - 유래 중추 신경계 (CNS) 신경 세포를 배양 세포주 7-10의 유연성 차 뉴런의 관련성을 결합 본트 연구를위한 차세대 셀 기반 플랫폼을 제공 할 수있다 줄기 것이 제안되었다. 특히, 마우스 줄기 세포 유래 신경 세포 (하는 ESN)는 본트 / A- / G의 생리적 용량에 매우 민감하게 차동 persistences 활동 강화 중독 및 혈청 형을 포함하여 중독에 대한 생체 반응, 많은 복제하는 것으로 밝혀졌다 - 특정 효능 5,8,11. 이러한 동작은 본트 흡수, 처리, 인신 매매와 활동의 생체 메커니즘에하는 ESN에 보존되는 것이 좋습니다. 시냅스 activit의 그러나 억제Y는 보툴리누스 중독의 서명 표현이다, 따라서 탄소 나노 튜브에 의해 중독 다음 시냅스 활동의 손실을 입증하는하는 ESN은 CNT 연구를위한 생체 유래 세포 기반 모델에 적합한 지 판단하기에 앞서 필수적이다.
시냅스 활성에 탄소 나노 튜브와 중독 효과를 측정하기 위하여, 전체 세포 패치 - 클램프 전기 생리학은 비히클 - 처리 된 또는 처리 된 CNT DIV 21 + monosynaptic하는 ESN에 전류를 정량화하는 데 사용되었다. 우리는 본트 / A- / G 또는 텐트하는 ESN의 중독은 모든 경우에 20 시간 내에 시냅스 활동의> 95 %의 손실이 발생했습니다. 본트 / A는 0.005 μM의 아래 검출 한계와 0.013 오후 IC (50) 값으로, 시냅스 활동에 용량 의존적 효과를 밝혀와 또한 특성은 중독 후 20 시간을 실시했다. 이러한 연구 결과는 중독의 전기 생리 검출 감도 및 시간 프레임이 상당히 유사한 면역 기반 아나보다 개선되어 있다는 것을 나타내시냅스 활성 신경 세포 배양 중독의 기능 측정이 더 민감한 특정하고 빠른 방법을 용이하게 할 수 있음을 입증하는 SNAP-25 분열의 생체 마우스 치사 분석에 lyses는 본트에 대한 세포 반응의 특성을합니다.
Protocol
는 ESC 1. 적응은 무 세포 현탁 배양 피더
- 37 ° C에서 해동는 ESC 얼음의 은색이 남을 때까지.
- 10 6 예열 ESC 배지 10 ㎖를 함유하는 비 - 조직 배양 - 처리 된 접시는 ESC 해리 X 2.5 - P1000 피펫을 사용하여 조심스럽게 1 옮긴다. 37 ° C에서 20 시간 및 5 % CO 2의 가습 된 조직 배양기에서 배양한다.
- 20 시간 후, 부드럽게 10 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 현탁 배양을 전송하여 세포를 씻으십시오. 200 x g에서 3 분간 펠렛는 ESC. 회전하는 동안, 저 밀착성 접시 ESC 다시 신선한 배지를 가하여 10.
- 대기음 상층 액을주의하면서 세포 펠렛을 빠지 피하고, 1 ml의에게 펠렛 셀 신선한 ESC 매체를 추가 할 수 있습니다. P1000 피펫을 사용하여 박테리아 접시에 세포를 전송하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 집계는 육안 (일반적으로 4에 표시 될 때까지 매일 세포를 관찰 - 8 일 (D) 집계는 0.2이됩니다- 0.5 mm). 집계는 4 일 후 식별 할 수없는 경우, 1.3 단계를 반복합니다. 집계 볼 수 있습니다되면, 해리 및 제 2 항에 설명 된대로는 ESC를 유지한다.
2. ESC과 Passaging 및 유지 관리
- ESC는 15 ml의 멸균 10 ML의 피펫을 사용하여 원뿔 튜브를 집계 전송하고 집계 소형 펠릿에 정착 할 수 있도록 (일반적으로 3-5 분). 대기음 뜨는, 조심하면 세포 펠렛을 방해하지 않도록, 5 ml의 PBS로 집계를 씻어. 중력 침강 2.5 분 동안 100 XG에서, 또는 펠렛 세포를 사용하는 것이 좋지만 대신 시간을 저장합니다.
- 대기음 PBS 500 μL 트립신을 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 3 분 동안 트립신의 집계를 품어. 트립신을 희석 부드럽게 집계를 깰 P1000 피펫으로 10 번 씹다 500 μL ESC 매체를 추가합니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 펠렛은 1.0의 최종 농도로 재현 탁하고 200 XG 세포에서 3 분 동안 세포를 해리ESC 매체 X 107 세포 / ml. 전송 (150) 10cm 박테리아 접시에 신선한 ESC 배지 10 ㎖에 μL (1.5 × 10 6 세포), 48 시간 동안 조직 문화 인큐베이터로 돌아갑니다. 10 % DMSO, 또는 폐기 보충 된 90 % ESC 배지에서 5 × 106 세포 / ml - 과잉는 ESC 1에서 동결 보존 차별화 될 수있다.
- 통로마다 48 시간을 집계합니다. 통과를 위해 준비 골재는 0.5 mm를 초과하는 직경, 명확하게 볼 수 있습니다.
참고 : - 1.4 냉동 보관, 서스펜션 적응 세포의 해동과 문화가 단계 1.2 당 달성된다. 72 시간 - 집계 (48) 내에서 계대에 대한 준비가 될 것입니다.
3. 신경 세포의 분화
참고 : - 정오 이후 이전에 정오에 3.5 단계 3.7 행동 3.1 단계를 반복합니다. 분화 절차의 개요는도 1a에 표시됩니다.
- 2.5 - 단계 2.1로는 ESC를 떼어 놓다. 해리의 전송 350 μL (3.5 × 10 6)25 ㎖ 분화 배지를 함유 10cm 둘러 부착 접시는 ESC D. 5 % CO 2, 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터 안에 45 RPM - 30으로 설정 진탕에 놓는다. 이 차별화의 첫 날, 시험 관내 (DIV)에서라고 일 -8.
참고 : 매우 낮은 첨부 접시의 사용 방법의 비용을 증가하지만, 집계 가끔 배양 접시에 부착 할 수 있기 때문에 세균 배양 접시보다 약간 큰 수익률을 생산하고 있습니다. 다른 접시 크기를 선호하는 경우, 중간 볼륨 및 세포 수를 그에 따라 확장 할 수 있습니다. - 48 시간 (DIV의 -6) 한 후, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 분화 세포 집합체를 전송하기 위해 25 ㎖ 피펫을 사용한다. 즉시 페트리 접시에 차별화 매체의 신선한 25ml를 추가합니다.
- 2 mm의 깊이 - 1 볼 펠렛을 생산, 5 분 - 골재가 2 이상을 해결 할 수 있습니다. 서스펜션에 남아있는 단일 세포 또는 작은 집계를 무시합니다. 조심스럽게 매체를 대기음 CE를 전송LL 다시 P1000을 사용하여 배양 접시에 펠렛. 조직 문화 인큐베이터에서 회전 진탕에 놓습니다.
- DIV -4 단계를 반복 3.2에서. 4 mm의 깊이 - 펠렛 2 될 것입니다. 페트리 접시에 6 μm의 모든 트랜스 레티노 산 (RA)로 보충 30 ml의 차별화 매체를 교체합니다. 추가로 48 시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 회전 진탕으로 돌아갑니다.
- DIV -2 단계를 반복 3.3에서. 이 시점에서 깊이 8 MM - 펠렛 4 될 것입니다.
- DIV -1에서, 제 4 장에서와 같이 도금 표면을 준비합니다.
- 조직 배양 후드에서 10 분 플레이스 - DIV 0, 5, 37 ° C에서 미리 분취 및 냉동 NPC를 트립신 처리 배지 5 ㎖를 해동. 이전 50 ML 원뿔 튜브에 집계를 차별화, 25 ML의 피펫을 사용하여. 집계가 정착 조심스럽게 흡인 매체하도록 허용합니다. 워시 집계 세척 사이에 정착 할 수 있도록, 10 ml의 PBS로 두 번 펠렛.
- 제 PBS 세척 후에, 펠릿 NPC의 트립신 처리 배지 5 ㎖를 추가하여 37 ℃에서 부화6; 5 분 C. 부드럽게 2.5 분 후에 튜브를 가볍게.
- 트립신을 비활성화하고 반전 혼합 0.1 % 대두 트립신 억제제 (STI)의 5 ML을 추가합니다. 비교적 균질 세포 현탁액이 생성 될 때까지 10 ㎖의 혈청으로 15 회 피펫 - 부드럽게 10 연화.
- 천천히 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 위치도 40㎛ 70㎛, 셀 스트레이너에 세포 현탁액을 전송. 모든 현탁액을 여과 한 후, 필터를 통해 남아있는 세포를 세척하고 200 x g에서 6 분 동안 해리 된 세포 현탁액을 펠렛 N2 배지 1 ㎖를 추가한다.
- 펠렛을 방해하지 않고 대기음 매체. 200 XG에 5 분 동안 세포를 펠렛 및 P1000과 세척 사이에서 분쇄하여, 10 ml의 N2 매체로 두 번 세포를 씻으십시오. 두 번째 세척하기 전에 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- / cm 2 셀 200,000 - 150,000의 세포 밀도로하는 ESN ㎖의 판 당 1 × 107 세포에서 N2 배지에서 세포를 재현 탁.
- 새로 PLAT 이동가습 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터 5 % CO 2 ED하는 ESN과 5 절에서와 같이 유지한다.
DIV 0 도금 신경 전구체에 대한 문화 표면 준비 (4)
- 도금에 최소 1 일전 조직 배양 처리 된 요리를 준비합니다. (PEI를, 멸균 H 2 O 25 ㎍ / ml)에 충분한 폴리에틸렌 이민을 추가 또는 폴리 D 라이신 (PDL을 100 ㎍ / ml의 멸균 H 2 O에)에서 O / N을 플라스틱 요리를 조직 문화가 처리 된 커버 배양 37 ° C.
- 도금의 아침, 두 번 증류 H 2 O로 두 번 설거지를 한 번 PBS와. 최종 세척 후 요리를 커버 할 수있는 충분한 N2 매체를 추가 (예를 들어, 12 잘 접시 잘 당 1 ml의 또는 6cm 접시 당 4 ㎖).
- 적어도 전날 신경 도금 18mm 커버 글라스를 준비합니다. 플라즈마 클리닝 4 분으로 청소 된 커버.
- 즉시의 바닥 에탄올 세척하고 파라 필름으로 세정 된 커버를 전송할큰 멸균 요리와 단계 4.1에서와 같이 제조 PEI 또는 PDL 솔루션의 400 μl를 추가. 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 O / N을 품어.
- 아침에, 세척 물로 3 회 된 커버는 1 PBS에 5 ㎍ / ㎖의 라미닌을 추가 - 37 ° C에서 3 시간. 이전 신경 세포를 해리로, 라미닌을 대기음 즉시 직면 처리 된면을 유지해야되는 NPC 배지 1 ㎖를 포함하는 12 잘 접시의 잘에 커버 슬립을 전송합니다.
- 저장 요리와 37 ° C에서 커버 슬립의 NPC 판 할 준비가 될 때까지.
뉴런 5. 유지 보수
- 그리고 DIV 1, 흡인 매체에서 N2 배양액으로 교체합니다.
- 그리고 DIV 2, 4, 흡인 매체에서 B27 배양 배지로 교체.
- DIV 8에서 대기음 매체와 B27의 배지를 포함하는 유사 분열 억제제로 교체가 아닌 신경 세포를 오염 제거합니다.
- DIV 12, B27 배양 배지로 교체합니다.
- DIV를 제거하지 마십시오준비가 될 때까지 5 % CO 2 12 +하는 ESN은 사용할 수 있습니다.
미니어처 흥분성 시냅스 후 전류를 정량화를위한 시냅스 전달 (MIST) 분석 6. 측정 억제
주의 : - 1 NG / kg 클로스 트리 디움 신경독 0.1의 낮은 예상 인간의 LD 50 값으로 알려진 가장 독성 물질이다. 이 독소를 사용하여 적절한 예방 조치를 사용하기 전에 필요한 승인을 얻습니다.
- 조심스럽게 37 ºC에 원하는 최종 ESN 배양 배지의 농도와 따뜻한을 100 배 본트 / A를 희석. 21 + ESN 문화를 DIV 배양 접시를 소용돌이 및 인큐베이터로 돌아 독소의 적절한 볼륨을 추가합니다.
- 세포가 중독 후 4 개 이상의 시간을 분석 할 경우, 이러한 직접 인큐베이터에서 또는 일정한 CO 2 실에서, 5 % CO 2에서 제거하지 않고 요리와 소용돌이에 독소를 추가합니다.
- 적절한 시점에서, ASPIRATE ESN 배양 배지 및 세포 외 기록 버퍼 (ERB)로 두 번 세척 하였다. ERB의 추가 4 ㎖를 각각 활동 전위를 차단하고 GABA에게 수용체 활동을 반감, 5.0 μM 테트로도톡신 10 μM의 bicuculline 보충.
- 전기 생리학 장비에 접시를 전송합니다. 어느 관류도 온도 제어는 MIST 분석이 필요합니다.
- 저항의 5 ~ 10 밀리 옴으로 기록 피펫을 생산하고 세포 내 기록 버퍼 채우기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리를 잡아 당깁니다. 부드럽게 기록하기 전에 시약을 siliconizing 채워 기록 피펫을 찍어.
- 기록 피펫은 ERB 내로 하강으로 공기 - 충전 된 주사기를 사용하여, 양압을 제공한다. 부드럽게 기록되는 뉴런 소마상의 기록 피펫 착륙 후 양압을 제거한 기가 시일을 형성한다. MV -70 유지 전압을 낮 춥니 다. 조심스럽게 전체 셀 구성에 침입 음압을 적용합니다.
- 모니터링하고 막 잠재력을 휴식 기록하는 전류 클램프로 전환합니다. 액체 접합 전위에 대한 조정없이, 휴식 막 잠재력은 -82에 -67 사이의 MV 될 것입니다.
- 소형 흥분성 시냅스 후 전류 (mEPSCs)를 검출하기 위해 5 분 - 4 연속 -70 MV 전압 클램프 녹음을 수행합니다.
- 다음과 같은 설정으로 스파이크 탐지 소프트웨어를 사용하여 mEPSC 검출을위한 기록 된 데이터의 4 분 분석 : 임계 값, 5; 기간은 로컬 최대를 검색, 10,000 마이크로 초; 기준에 대한 피크 전에 시간, 5,000 마이크로 초; 기간은 감쇠 시간을 검색하려면 20,000 마이크로 초; 피크의 분수는 0.37를 감쇠 시간을 찾기 위해; 기간이 기준을 평균 1,000 마이크로 초; 임계 영역, 20; 평균 피크, 1 점의 수; 피크의 방향, 음.
- 수집 및 감지 이벤트에 대한 정보를 저장합니다. mEPSC Hz 단위 주파수를 결정하기 (240)에 의해 4 분에서 검출 된 이벤트의 수를 나눈다.
- 12 계속 - 8 mEPSC 주파수를 수집rols 8 - 각각의 노출 조건에 대한 12 본트 처리 된 샘플. 나이와 많은-대조군에 대한 주파수를 분석 할 수 있습니다. 일원 분산 분석 테스트 및 던넷 사후 테스트를 사용하여 시냅스 활동의 억제 %의 통계적 유의성을 확인합니다.
Representative Results
우리는 (그림 1A에 설명) 마우스는 ESC에서 고순도의 줄기 세포 유래 신경 세포의 대량의 경제적 생산 8,11 수있는 분화 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 재현성 정의 계통 12-14 뉴런 생성 개인적 및 상업적으로 입수 한 ESC 라인 차별화 년의 기간 동안 사용되어왔다. 이 프로토콜의 중요한 요소는 무 세포 현탁 배양 피더는 ESC (1) 적응을 포함한다; 현탁 배양 (2) 적절한 유지 관리; 회전 상태에서 (3) 차별화. 현탁 배양으로 전환 극적 ESC 시간과 유지 보수 비용을 감소시키고, 분화 이전에 피더 세포를 제거 할 필요성을 제거한다. 서스펜션 적응 다음, OCT3 / 4 식 (그림 1B-D 능성 마커의 발현을 변경하지 않는 서스펜션 적응을 나타내는, 적어도 30 통로를 통해 일치 7 세포를 초과하면는 ESC는 신경 세포의 분화에 적합하다. 이것은 일반적으로 서스펜션 적응 후 열 단락 또는 이전에 정지 적응 하였다는 ESC의 해동 후 5 통로 내에서 발생합니다. 집계를 차별화 기계 회전도 증가 신경 세포 수율에 중요한 것으로 밝혀졌다. 회전 진탕의 첨가는 총 생존율을 증가시키고 0 DIV (도 1E)에 신경 전구 세포 (NPC들)의 수율 ~ 300 % 증가를 생성 슈퍼 골재 형성을 제거.
전형적인 차별화 DIV에서 3.5 × 10 (6)는 ESC로 시작 -8 생존 및 신경 세포가 될 것이다 대략 60 % 어느 DIV 0에서 115 × 106의 NPC를 생성합니다. 나머지 40 %는 비 신경 세포를 포함하고, 주로 0 DIV 사이 혈청 결핍에 의해 제거된다 - 신경교 퍼시스턴스 소수가 유사 분열 INH의 첨가에 의해 제거 될 수있다 1.DIV에서 ibitors는 2-4 또는 DIV (8) - (12) 도금 밀도 DIV 0 중요하다; 너무 띄엄 띄엄 도금 뉴런 2 주 이상 생존하지 않습니다. 도금의 일 이내에, 차별화 된 신경 세포는 신경 세포의 형태학을 전시 및 somatodendritic 마커 MAP2와 축삭 마커 타우 (그림 2A)로 neurotypic 단백질, 구획. DIV (14)에 의해 synapsin-1 + puncta에가 버렸네 형성을 암시 axodendritic 인터페이스에서 확인할 수있다. 이는도 7을 8,11 DIV 시냅스 이전 마커 단백질의 발현과 일치한다. 신경 세포의 형태학은 DIV (21)를 통해 성숙하는 시간 문화가 정교한 axodendritic 아버 큰 시냅스 puncta의 (그림 2A)를 전시하는 것을 계속한다. 적절하게 유지하면하는 ESN 도금 후 최소 4 주 동안 실행 가능하고 활성 상태로 유지됩니다.
RNA 시퀀싱을 사용하여 세로 발현 프로파일 링은 신경 사양의 형태 학적 및 프로테옴 증거를 뒷받침11, 15를 성숙 거라고. 개발 진행의 대표 마커는 OCT3 / 4, 네 스틴, DCX, NeuN과 KCC2 (그림 2B)를 포함하여 단계 별 발현 양상을 보였다. DIV 0으로하는 ESN은 MAP2와 타우를 포함하는 신경 세포 고유의 구조 단백질, 풍부한 사본을 표명했다. 이전 연구 결과와 일관되게, 두 개의 신경 세포의 하위 유형에 대한 마커가 관찰되었다 : vGluT2 발현 후뇌 / 중뇌 글루타메이트 신경 세포와 GABA 성에서의 interneurons 8. 이에 대응하여, 글루타메이트와 GABA 성 마커의 다양한는 신경 전달 물질 방출에 필요한 사전 시냅스 SNARE 단백질을 포함 DIV 0 DIV 7 사이의 표현의 급격한 증가, 전시; 시냅스 후 반응에 필요한 신경 전달 물질 수용체; 비계 단백질은 시냅스 후 막에 수용체를 밧줄해야합니다. 뉴런은 DIV에 의해 DIV (14)과 자연 소형 흥분성 시냅스 후 전류에 의해 성숙 고유의 전기적 특성을 나타내는16 16.
시냅스 전달 (MIST) 분석의 측정 된 억제는 시냅스 활성에 중독 효과를 평가 하였다. 술에 취한 차량 처리 DIV 사이 24 +하는 ESN을 mEPSC 주파수를 비교함으로써, MIST는 시냅스 활동 (그림 3A)의 기능 억제를 기반으로 중독의 양적, 특정 측정을 제공합니다. MIST는 각 독소의 목욕 첨가 한 후 20 시간에하는 ESN에서 시냅스 활동에 본트 / A- / G 또는 텐트의 효과를 측정 하였다. 독소에 등가 농도로 첨가 이전에 10 배량 SNARE 단백질 절단 (11)의 면역 블롯 분석에 의해 결정되는 바와 같이, EC (50)의 값. 독소는 모두 차량의 제어 처리 5 % 미만 mEPSC 주파수를 감소시켰다. 시냅스 비율의 감소는 술에 취한하는 ESN이 패치를 적용 할 때부터, 사망 또는 변경 고유 응답을 셀에 기인하지 않았다 반복되는 활동 전위를 해고및 전류 주입에 대한 응답으로 막 전위 (그림 3B, C)를 휴식에 큰 변화를 나타내지 않았다.
탄소 나노 튜브, 탐지 및 평균 억제 농도의 한계 (IC 50)을 감지하는 기존의 방법에 MIST의 감도를 비교하기 위해하는 ESN로 본트 / A를 첨가 한 후 20 시간을 측정 하였다. 적은 0.005로 μM의 본트 / A에 의한 중독은 IC (50) 0.013 (PM)의 값 0.5시 (도 4a) 위의 시냅스 활동의 완전한 침묵으로, mEPSC 주파수에서 통계적으로 유의 한 감소를 생산했다. 이 IC (50) 값은 약 0.5 마우스 치명적인 단위 / ㎖, 그 MIST을 제안하는 것은 민감한 두 배 및 2에 본트 / A의 존재를 검출에 빠르게 MLA보다 4 배에 해당한다. SNAP-25 분열의 면역 측정 MIST 약 민감한 30 배임을 나타냅니다 오후 12시 38분 0.05 오후 감지 할 수있는 최소 용량의 EC (50) 값을 생성절단 SNARE 단백질 (그림 4B)의 면역 기반 탐지보다.
그림 1. 서스펜션 적응하는 ESN은 mitotically 안정적으로 유지하고 능성의 마커를 표현한다. ESC 유지 보수 및 분화 (A) 도식. 레티노 산 (RA) 또는 백혈병 억제 인자 (LIF)의 유무 또는 +로 표시된다 -. 차 신경 세포 배양에 대한 시험 관내 (DIV)과 고전 발달 단계 (DS)에서 일 사이의 비교 (17)을 제공한다. R1, D3 및 C57BL / 6J ES 세포 라인 (B) 확산 속도는 현탁 배양 전환 후 5 구절에 의해 안정. (C) 데이터는 현탁 배양에서 25 구절을 통해 측정 된 R1, D3 및 C57BL / 6J ES 세포주에서 OCT3 / 4 식의 실질적인 변화를 입증하지 계측법 (흐름n은 각각 6). (D) 유로 5와 30 (검은 선) 사이에서 측정 된 현탁액 적응 R1 ESC 라인에 대한 일상적인 계대 동안 실제 세포 수율. 어떤 세포를 계대 동안 폐기되지 않는 경우 이론적 누적 수익률은 (빨간 선)되게됩니다. (E) 정적 (왼쪽) 또는 회전 상태 (오른쪽)에서 생산 DIV 0 골재의 밝은 필드 이미지. 로타리 조건은 응집없이 구형 집계를 생산 (P <0.001 학생의 t-test를 이용하여 결정) NPC가 3 배를 얻을 수 증가 (11). *은 P <0.05를 나타냅니다. 이 그림은 허바드 등. (11)에서 수정 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 형태 학적, 홍보신경 사양과 성숙의 oteomic 및 transcriptomic 증거 DIV 7에서 (A) 면역 세포 화학 -. DIV (49)는 신경 arborization 및 axodendritic 인터페이스에서 시냅스 puncta의의 모습을 보여줍니다. 축삭이 타우 (녹색)으로 표시되며, 수상 돌기가 MAP2 (적색)로 표시되어, 미리 시냅스 구획 synapsin (흰색)으로 표시하고 있으며, 핵은 DAPI (파란색)로 염색한다. (B) 발달 단계 - 특이 적 발현을 설명하고 신경 세포의 서브 타입을 지정하는 대표적인 유전자의 종 발현 프로파일 링. 모든 유전자 성적표는 셀 당 성적 증명서의 대략적인 숫자로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3.하는 ESN에서. 본트 / AG 천막에 노출되었을 때 시냅스 활성의 억제를 이동 (A)하는 ESN에서 대표 흔적 목욕 첨가 한 후 20 시간 수집 ~ 10 × EC 본트 / A의 50 값 - / G, 텐트 또는 차량. 각각의 신경 독소 컨트롤에 비해 이상 95 %에 의해 시냅스 활동을 감소시켰다. > N (B) 비음 주군 뉴런 (본트 / A 시연 있지만, 모든 음주 문화에서 관찰)와 (C)는 C (잠재적 인 부정적 휴식 막에 어떤 변화를 나타내지 않았다 전류 주입을 탈분극에 대한 응답으로 반복 AP를 발사 할 수 남아 각각의 치료를 위해 18). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
본트 / 안개의 감도 그림 4. 결정은 처리하는 ESN. (A) 본트 / 목욕 첨가 한 후 시냅스 활동 20 시간의 MIST 측정. 주제 전압 클램프 추적 세그먼트 본트 / A 노광 (왼쪽)은 다음 mEPSC 주파수의 감소를 나타냈다. mEPSC 주파수의 정량 (막대 그래프, 오른쪽, n은 컨트롤 = 20; 11 명 - 각 용량에 대한 22) mEPSC 주파수의 용량 의존적 감소를 확인합니다. 중앙값 저지 농도는 네 매개 변수 슬로프 (> 0.91 R 2)를 사용하여 비 - 선형 회귀 적합 최소 제곱 법으로 결정 하였다. 하는 ESN에 안개가 검출 한계 참고 적어도 0.005 분. (B) 본트 / SNAP-25의 절단에하는 ESN 결과 중독 겔 이동성의 변화에 의해 같은 시각 (오른쪽 SNAP-25 분열의 막대 그래프 표시 정량으로 왼쪽에있는 대표적인 서양 얼룩을, N = 4) . 엔드 포인트로 SNARE 단백질 절단 (SNAP-25)를 사용하여 감소 감도를 참고 (EC 오후 12시 36분 50) 대 50). *는 P <0.05을 나타낸다; ***는 P <0.001을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
CNT 검출, 혈청 판별 및 정량 황금의 현재 표준은 MLA이다. MLA는 호스트의 전체 범위를 질의한다 : 기질의 생체 내에서 발생할 중독 필요한 독소의 상호 작용 (예를 들어, 독소, 세포 표면 수용체의 세포질 내로 독소 수용체 복합체, LC 전좌의 내재화를 결합, LC가 매개 된 절단 및 시냅스의 신경 전달의 억제) 18. MLA는 중독의 생리 학적으로 관련 모델을 제공하지만, 그러나, 오염 물질에 의해 혼동 할 수있다, 리소스를 많이하고 엔드 포인트로 죽음 마우스의 큰 숫자를 포함한다. 대안 적으로, 본트 검출 및 정량 용 세포 기반 분석법은 또한 동물의 사용 또는 시냅스를 형성하고 전형적 신경독 8 불량한 감수성을 나타내는 실패 신경 아세포종 세포주해야 차 신경 세포 배양에 한정되어왔다. 일에 중독 현재까지 대부분의 측정ESE 셀 기반 플랫폼은 SNAP-25, VAMP1 / 2 또는 신택-1 (11)의 단백질 분해 분열의 검출에 의존하고있다. SNARE 단백질 절단 정확하게 19,20 중독 또는 중독으로부터 회복을 나타낼 수없는 비선형 따라서 생체 내에서 시냅스 억제와 연관된 것으로 도시되어 있기 때문에이 문제가된다.
CNT 검출을위한 이상적인 셀 모델 - 기반 시스템은 (ⅰ) 뉴런 - 기반 일 것이다; (II)는 시냅스 neurotypic 전기 반응과 결합 될; (ⅲ) 모든 CNT 혈청 형 또는 서브 타입에 매우 민감 할 수; 및 (ⅳ) MLA를 통해, 저렴한 비용으로, 동물의 사용을 요구하지 않고 동등 또는 개선 제안 확장 성, 처리량 및 분석 시간. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해, 우리는 시판 마우스 ESC 라인으로부터 고농축 네트워크화 글루타메이트의 문화와 GABA 성 신경 세포를 대량 생산하는 방법을 개발 하였다. 우리는 다음 정량 MIST 분석을 개발응답 시냅스 억제는 텐트와 본트 / A- / G와 중독. MIST 분석이 어떤 시냅스 활성 신경 세포 집단 (예를 들어, 기본 뉴런이나 뇌 조각)에 실시 될 수 있지만, 현재하는 ESN 재현성 응급 네트워크 동작을 개발하고, 따라서 MIST 분석에 적합한 유일한 체외 유래 신경 세포 모델이다.
ESC 배양 및 분화의 여러 혁신은 탄소 나노 튜브 연구에 대한 정의 혈통의 신경 세포의 충분한 양을 필요한 생산. 우선, 선택에 대한 적응 및 현탁액을 견딜 수는 ESC를 배양함으로써 피더 세포와 분화의 개시시는 ESC에서 피더 세포를 정제 할 필요성에 의한 오염의 가능성을 제거. 서스펜션 적응을 기본 분자 메커니즘은 알 수 있지만, 서스펜션 적응는 ESC가 mitotically 활성 상태로 유지, OCT3 / 4 식을 유지하고 신경 인성 계속. 이 방법을 사용하여, 1.5 × 106 ~ 7 ESCS는 일반적으로 각각의 통과를 복구됩니다. 둘째로, 제조의 NPC 표면적으로 응집체의 내부에 영양소 접근성을 증가 분화 중에 응집을 방지하기 위해 기계적 교반을 혼입함으로써 ~ 300 % 증가 하였다. 이 과정에서 우리는 ESC 문화와 신경 세포의 분화에 사용되는 혈청 신경성는 ESC를 유지에서 가장 중요한 구성 요소입니다 것으로 나타났습니다. 최고의 성공을 위해, 우리는 서스펜션 혈청의 각 로트에 ES 세포를 적응 및 유효 기간을 통해 ESC 문화와 신경 세포의 분화를 지원하기 위해 -20 ° C에서 혈청을 비축하는 것이 좋습니다.
대부분의 시냅스 활성 문화와 마찬가지로, DIV 14 +하는 ESN은 2 농도가 24 시간 내에 신경 독성이 발생할 수 있습니다 pH의 급격한 변화, 대기 CO 심지어 간단한 노출에 매우 민감하다. O는 / N 이상, 신경 세포를 직접 취급 할 필요가 지속 배양 한 다음 문화의 치료를 필요로하는 실험 전인큐베이터 또는 실험 이전에 일정한 CO 2 챔버로 이송 명.
다양한 기술 ICC, 전사 프로파일 및 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 포함한 신경과 신경 세포의 성숙을 확인했다. 유전자 발현 및 신경 세포 형태의 시간적 변화는 신경의 발달 단계를 통해 빠른 진행과 일치했고, DIV (16)에 의해,하는 ESN은 흥분성 및 응급 네트워크를 억제 소형 시냅스 후 전류가 16 행동들 나타냈다. 시냅스 활동의 증거하는 ESN은 보툴리누스 중독 및 파상풍의 임상 양상에 대한 책임 pathophysiologies을 복제 할 수 있음을 제안했다. 이것은 본트 / A- / G 또는 비히클 - 처리 또는 미처리 뉴런 비교> 95 %에 의해 텐트 손상 mEPSC 주파수와 그 중독 보여 MIST를 사용하여 확인 하였다.
본트 / A에 대한 MIST의 감도 측정은 평균 억제를 표시농도 0.013 (0.5 마우스 치명적인 단위 / ㎖에 해당) 오후 제한-의 검출 0.005 μM의 아래의 (IC 50), 목욕 첨가 한 후 20 시간에서 측정. 4 배 빠른 MLA보다 및 절단 SNAP-25의 면역 기반 탐지보다 더 민감한 30 배 -이 값을 바탕으로, MIST 2로 약 두 배 민감하고.
종합적으로, 이러한 데이터는 줄기 세포 유래 신경 세포의 네트워크로 인구가 중독의 생리적 관련, 셀 기반 모델을 제공하는 것이 좋습니다. 보다 신속 민감한 특정 측정 값을 제공하면서 현탁액 적응는 ESC로부터 네트워크 ESN 배양을 유도하는 개선 된 방법과 조합 MIST의 사용은 동물 실험과 관련된 단점, 비용 및 MLA의 윤리적 문제에 대한 필요성을 감소시켜야 중독. 전 세포 패치 - 클램프 전기 생리학 신경독 활성의 존재를 식별하기위한 낮은 처리량 방법이 있지만, 해상도 및 SPE을 구비분자 방법을 사용하여 복구되지 에디션. 이러한 결과는 활성 - 의존성 방식의 어플리케이션이 시냅스 활성을 평가하고, 네트워크 동작은 신경독의 신속한 특정 검출을 가능하게 할 수 있다는 증거를 제공한다. 이러한 높은 처리량 방법은 탄소 나노 튜브를 포함 neuromodulatory 에이전트의 넓은 배열 가능한 기계 론적 연구, 치료 검사 또는 진단 분석을 만들 것입니다.
Acknowledgments
공동 과학 기술 사무실, 의료 S & T 부문 (승인 번호 CBM.THRTOX.01.10 -이 작품은 보건 국립 알레르기 전염병 연구소 (IAA 번호 AOD12058-0001-0000)과 국방 위협 감소 기관의 국립 연구소에 의해 투자되었다 .RC.023 및 CBM.THRTOX.01.RC.014). PB는 국방 위협 감소 기관 - 국가 연구위원회 연구 Associateship 상을 개최 KH는 국가 연구위원회 연구 Associateship 상을 개최하면서이 연구를 수행 하였다. 우리는 안젤라 애드킨스 및 기술 지원을 Kaylie Tuznik (USAMRICD를) 감사합니다; 및 편집에 도움 신디 Kronman (USAMRICD). 본 기사의 의견은 저자의 견해이며 육군 부, 국방부, 또는 미국 정부의 공식 정책을 반영하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
- Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
- Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
- Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
- Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
- Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
- Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
- Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127 (2012).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
- Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423 (2013).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
- Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).
