Abstract
Os estudos terapêuticos e mecanisticos das neurotoxinas clostridiais pré-sinapticamente alvo (CNT) têm-se limitado pela necessidade de adaptar um modelo, com base em células que produz sinapses funcionamento e sofre respostas fisiológicas a intoxicação. Aqui nós descrevemos um método simples e robusto para diferenciar de forma eficiente as células-tronco embrionárias de murino (CES) em linhagens definidas de neurônios, em rede synaptically ativos. Na sequência de um protocolo de diferenciação oito dias, derivadas de células-tronco embrionárias neurônios de rato (SNEs) rapidamente expressar e compartimentalizar proteínas neurotypic, formam morfologias neuronais e desenvolver respostas elétricas intrínsecas. Aos 18 dias após a diferenciação (DIV 18), ESNs exibem glutamatergic ativa e γ-aminobutírico (GABA) sinapses érgicos e comportamentos de rede emergente caracterizado por uma excitação: equilíbrio inibitório. Para determinar se a intoxicação com nanotubos de carbono antagoniza funcionalmente sináptica neurotransmissão, replicando assim the in vivo fisiopatologia que é responsável por manifestações clínicas de botulismo ou tétano, de célula inteira patch clamp eletrofisiologia foi utilizado para quantificar correntes espontâneas miniatura excitatórios pós-sinápticos (mEPSCs) em ESNs expostos a neurotoxina tetânica (tenda) ou neurotoxina botulínica (TB) sorotipos / A- / G. Em todos os casos, SNEs exibiu perda quase completa da actividade sináptica dentro de 20 horas. Neurônios intoxicados permaneceram viáveis, como demonstrado por inalteradas potenciais de membrana em repouso e respostas elétricas intrínsecas. Para caracterizar ainda mais a sensibilidade desta abordagem, os efeitos dose-dependentes da intoxicação sobre a actividade sináptica foram medidos 20 h após a adição de BoNT / A. Intoxicação com 0,005 pM de BoNT / A resultou em um decréscimo significativo na mEPSCs, com uma concentração inibidora média (IC50) de 0,013 pM. Comparações de doses medianas indicam que medidas funcionais de inibição sináptica são mais rápidos, mais específico e mais sensível do que SNAREensaios de clivagem ou o ensaio de letalidade do rato. Estes dados validam o uso de synaptically acoplados, decorrem neurônios derivados de células para a detecção altamente específica e sensível de nanotubos de carbono.
Introduction
O objetivo geral deste método é avaliar funcionalmente atividade sináptica em culturas em rede de derivados de células-tronco neurônios expostos a neurotoxinas de Clostridium. Esta é a primeira demonstração de um modelo derivado in vitro que funcionalmente replica os pathophysiologies responsáveis por manifestações clínicas de botulismo e valida ESNs como um modelo adequado para a detecção de nanotubos de carbono, triagem terapêutica e estudos mecanicistas.
BoNTs são neurotoxinas bacterianas altamente letais produzidos por membros da espécie Clostridium. Incluindo o recentemente proposto BoNT / H, oito sorotipos antigenicamente distintos BoNT foram descritos (/ A- / H) 1,2. Todos os serotipos são expressos como péptidos 150 kDa que são pós-tradução cortado para produzir um composto de dichain uma cadeia pesada de 100 kDa (HC) e um de 50 kDa da cadeia leve (LC) ligados por uma ligação dissulfureto 3. O HC medeia a ligação aos receptores pré-sinápticos e entry da toxina para o neurónio, através de endocitose sináptica. Durante o processamento endossomal, a HC é submetido a re-organização estrutural para formar um poro na membrana da vesícula, facilitando a translocação da LC para o citosol pré-sináptico. A LC então visa especificamente e se unirá receptores de proteína de ligação de fusão sensível ao etilmaleimida solúvel N (SNARE) proteínas no compartimento pré-sináptico: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, A / D, / F, / G) ou sintaxina (BoNT / C) 1. Decote de qualquer uma destas proteínas SNARE impede a montagem das máquinas exocitose sináptica, bloqueando assim a libertação de neurotransmissores. Esta combinação de direccionamento neuronal eficiente e localização pré-sináptica torna BoNTs os venenos conhecidos mais potentes, com doses letais estimadas humanos tão baixas como 0,1-1 ng / kg 1.
Ensaios bioquímicos podem ser utilizados para detectar a presença ou a actividade da CNT CLs com alta sensibilidade. No entanto, estes métodos não conseguem interrogate a capacidade da toxina para se ligar, entrar, e activar a função de neurónios no interior, e, por conseguinte, são medidas indirectas e possivelmente enganosos da presença de toxina activa. Em contraste, os ensaios funcionais de intoxicação, tais como o ensaio de letalidade do rato (MLA) avaliar exaustivamente a capacidade de nanotubos de carbono para negociar com sucesso todas as fases de absorção e a activação, fornecendo uma avaliação mais relevantes e específicos da actividade da toxina. Enquanto o MLA é o ouro-padrão de detecção de BoNT, é um método in vivo que usa a morte, como um ponto final e, portanto, tem uma utilidade limitada como uma plataforma de investigação. Tentativas de desenvolver modelos baseados em células de CNT intoxicação adequado para estudos sobre os mecanismos de triagem e terapêutica também sofreram limitações significativas. Enquanto as culturas de neurónios primárias oferecem um elevado grau de relevância fisiológica, a sua utilização é complicada por uma série de factores, incluindo o custo elevado dos recursos, rendimento relativamente baixo, a presença de várias sub neuronaltipos e extensa supervisão regulamentar e administrativo envolvido com o uso de animais. Como uma alternativa para os neurónios primárias, linhas de células neurogénicos (que podem ser induzidos a adoptar propriedades neuronais como, por estimulação química), tais como os neuroblastomas e células cromafins supra-renais foram utilizados como modelos in vitro de intoxicação. Uma vez que estas células são cultivadas continuamente antes da indução, elas são altamente expansível e, portanto, bem adequado para abordagens moderada rendimento. No entanto, sua relevância é questionável uma vez que fenótipos induzidas são tipicamente heterogêneo, são pouco sensíveis às CNT e não exibem comportamentos neuronais críticas, incluindo a incapacidade de formar compartimentos pré e pós-sinápticos que montam em sinapses funcionam 4. Na ausência de compartimentos pré-sinápticos fisiologicamente intactas, toda a gama de toxina: interações neurônio não pode ser replicado e medições, portanto, funcionais de intoxicação não são possíveis 5. Nãot surpreendentemente, as tentativas de realizar estudos sobre os mecanismos ou triagem de drogas para BoNTs utilizando linhas celulares neurogênicas induzidas resultaram em descobertas que são inconsistentes com estudos in vivo e de neurônios primários 6.
Tem sido proposto que a haste central do sistema nervoso (CNS) neurónios derivados de células pode proporcionar uma plataforma com base nas células da próxima geração para pesquisa de BoNT que combina a relevância dos neurónios primários com a flexibilidade de linhas de células cultivadas 7-10. Em particular, derivadas de células estaminais neurónios de rato (SNEs) foram encontrados para ser altamente sensíveis a doses fisiológicas de BoNT / A / L e de se replicar em muitos respostas in vivo a intoxicação, incluindo persistências diferenciais, intoxicação com actividade aumentada, e serotipo potências espec�icos 5,8,11. Esses comportamentos sugerem que em mecanismos in vivo de captação BoNT, processamento, tráfico e atividade são conservados em ESNs. No entanto, a inibição de activit sinápticay é a manifestação assinatura do botulismo, e, portanto, demonstrando uma perda de atividade sináptica seguinte intoxicação por nanotubos de carbono é essencial antes de concluir que ESNs são um adequado modelo baseado em células derivadas vitro para estudos da CNT.
Para medir os efeitos da intoxicação com nanotubos de carbono sobre a atividade sináptica, de célula inteira patch-clamp eletrofisiologia foi utilizado para quantificar correntes monosinápticos em 21 + ESNs tratados com o veículo ou tratados-CNT DIV. Descobrimos que a intoxicação de ESNs com BoNT / A- / G ou tenda causado perda> 95% da atividade sináptica dentro de 20 horas em todos os casos. A caracterização adicional realizada 20 horas após a intoxicação com BoNT / A revelou um efeito dependente da dose na actividade sináptica, com um limite de detecção inferior a 0,005 pM e um valor de IC 50 de 0,013 pM. Estes resultados indicam que a sensibilidade e ao prazo de detecção eletrofisiológica da intoxicação são melhorado consideravelmente ao longo comparável à base de immunoblot analise da SNAP-25 clivagem e ensaios in vivo rato de letalidade, demonstrando que medidas funcionais de intoxicação em culturas de neurônios synaptically ativos podem facilitar métodos mais sensíveis, específicos e rápidos para caracterizar a resposta celular ao BoNT.
Protocol
1. Adaptação do CES como alimentador de Suspensão Cultura livre-Cell
- CES descongelar à temperatura de 37 ° C até um pedaço de gelo permanece.
- Usando uma pipeta P1000, suavemente transferir 1-2,5 x 10 6 dissociada CES para um prato de cultura tratados com não-tecido contendo 10 ml de meio de ESC pré-aquecido. Incubar numa incubadora humidificada de cultura de tecidos durante 20 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Após 20 horas, lave as células através da transferência suavemente a cultura de suspensão para um tubo de 15 ml usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Pellet CES durante 3 min a 200 x g. Durante a rotação, adicionar 10 ml de meio fresco ESC volta para baixa aderência prato.
- Aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado de evitar a retirada do sedimento celular, e adicionar 1 ml de meio fresco ESC para a célula pellet. Transferir as células ao prato bacteriana utilizando uma pipeta P1000 e retornar para a incubadora.
- Observar as células ao dia até que os agregados se tornam visíveis a olho nu (tipicamente 4-8 dias (d); 0,2 agregados será- 0.5 mm). Se agregados não são aparentes após 4 d, repita o passo 1.3. Uma vez que os agregados são visíveis, dissociam-se e manter a CES, conforme descrito na Seção 2.
2. ESC Passaging e Manutenção
- Transferir CES agrega a um tubo de 15 ml usando uma pipeta estéril de 10 ml e permitir que os agregados em repouso para um sedimento compacto (normalmente 3-5 minutos). Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular, e lavar os agregados com 5 ml PBS. Embora a gravidade de sedimentação é recomendado, células alternativamente pelotas a 100 g durante 2,5 minutos em vez de poupar tempo.
- Aspirar PBS e adicionar 500 mL de tripsina. Incubar em agregados de tripsina durante 3 minutos num banho de água a 37 ° C. Adicionar 500 mL meio ESC para diluir a tripsina e gentilmente triturar 10 vezes com uma pipeta P1000 para quebrar agregados. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
- Pellet células dissociadas durante 3 min a 200 xg e ressuspender as células a uma concentração final de 1,0x 10 7 células / ml em meio de ESC. Transferir 150 ul (1,5 x 10 6 células) para 10 ml de meio fresco CES em um prato de 10 centímetros bacteriana e retornar à incubadora de cultura de tecidos durante 48 horas. CES excesso podem ser diferenciadas, criopreservado com 1 - 5 x 10 6 células / ml em 90% de meio CES suplementados com 10% de DMSO, ou descartadas.
- Passagem agrega todas as 48 horas. Agregados prontos para a passagem será claramente visível, com diâmetros superiores a 0,5 mm.
NOTA: O descongelamento e cultura de células, adaptado de suspensão criopreservados são realizadas por etapas 1,2-1,4. Agregados estará pronto para passaging dentro de 48-72 horas.
3. Diferenciação Neuronal
NOTA: Conduta passos 3,1-3,5 antes do meio-dia e passo 3.7 depois de meio-dia. Uma visão geral sobre os procedimentos de diferenciação é apresentada na Figura 1A.
- Dissociar CES como nos passos 2,1-2,5. Transferir 350 ul (3,5 x 10 6) de dissociarCES d para uma placa de 10 cm de baixo apego contendo 25 ml de meio de diferenciação. Coloque, num agitador orbital ajustado a 30 - 45 rpm dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO 2. Este é o primeiro dia de diferenciação, denominado dia in vitro (DIV) -8.
NOTA: O uso de um ultra-baixo prato de fixação aumenta o custo do método, mas produz rendimentos ligeiramente maiores do que os pratos de Petri bacterianas uma vez que os agregados podem ocasionalmente aderir a pratos de Petri. Se são preferidos diferentes tamanhos de prato, os volumes médios e os números de células podem ser dimensionadas em conformidade. - Após 48 horas (DIV -6), utilizar uma pipeta de 25 ml para transferir os agregados de células de diferenciação para um tubo de 50 ml. Imediatamente adicionar um frescos 25 ml de meio de diferenciação para a placa de Petri.
- Permitir agregados para resolver sobre 2-5 min, produzindo um pellet visível que é de 1 - 2 mm de profundidade. Ignorar células individuais ou pequenos agregados restantes em suspensão. Aspirar cuidadosamente a médio e transferir o cell sedimentar de volta para a placa de Petri usando um P1000. Colocar num agitador rotativo numa incubadora de cultura de tecidos.
- No DIV -4 repita o passo 3.2. O sedimento será 2 - 4 mm de profundidade. Substituir 30 ml de meio de diferenciação suplementado com 6 uM de ácido all-trans retinóico (AR) para a placa de Petri. Retornar para agitador rotativo na incubadora de cultura de tecidos para um 48 horas adicionais.
- No DIV -2 repita o passo 3.3. O pellet será 4-8 mm de profundidade neste momento.
- No DIV -1, preparar superfícies chapeamento como na Secção 4.
- No DIV 0, descongelar 5 ml de meio de pré-tratamento com tripsina aliquotas e congelada NPC a 37 ° C durante 5 - 10 min e em lugar de um capuz de cultura de tecidos. Utilizando uma pipeta de 25 ml, transferência diferenciar agregados para um tubo de 50 ml. Permitir agregados para liquidar e médio cuidadosamente aspirado. Lave o peletizado duas vezes com 10 ml de PBS, permitindo que os agregados se estabelecer entre as lavagens.
- Após a segunda lavagem com PBS, adicionam-se 5 ml de meio de tripsinização NPC para o sedimento e incubar a 376; C durante 5 min. Agite suavemente o tubo após 2,5 min.
- Adicionar 5 ml de 0,1% de inibidor de tripsina de soja (STI) para inactivar a tripsina e misturar por inversão. Triturar suavemente 10 - 15 vezes com uma pipeta de 10 ml serológico até uma suspensão de células relativamente homogénea é produzida.
- Transferir-se lentamente a suspensão de células para um filtro de células de 40 mm ou 70 mm colocada no topo de um tubo de 50 ml. Depois de toda a suspensão ter sido filtrado, adicionar 1 ml de meio N2 para lavar as células restantes através do filtro e o pellet a suspensão de células dissociadas durante 6 min a 200 x g.
- Aspirar meio sem perturbar o sedimento. Lavar as células duas vezes com 10 ml de meio de N2, a peletização células durante 5 min a 200 xg e trituração entre lavagens com um P1000. Antes da segunda lavagem, a contagem de células utilizando um hemocitómetro.
- Ressuspender as células em meio N2 a 1 x 10 7 células por ml e SNEs placa a uma densidade celular de 150.000 - 200.000 células / cm2.
- Transferir recém-plated SNEs para uma incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 e de manter tal como na Secção 5.
4. Preparar Cultura Surfaces para Galvanização Neural Precursores na DIV 0
- Preparar pratos de tecido de cultura tratados com pelo menos 1 dia antes do plaqueamento. Adicionar suficiente polietilenoimina (PEI; 25 ug / ml em H 2 O estéril) ou poli-D-lisina (PDL; 100 mg / ml em H 2 O estéril) para cobrir o tecido-cultura tratada com pratos de plástico e incuba-O / N a 37 ° C.
- Na manhã de chapeamento, lavar pratos duas vezes com H bidestilada 2 O e uma vez com PBS. Após a lavagem final, adicionar meio N2 suficiente para cobrir o prato (por exemplo, 1 ml por poço de um prato de 12 poços ou de 4 ml por disco de 6 cm).
- Prepare 18 mm lamelas de vidro, pelo menos, um dia antes da neurônio chapeamento. Lamelas limpos por por 4 min para limpeza de plasma.
- Transferir imediatamente limpos lamelas a uma parafilme lavado com etanol na parte inferior de umgrande prato estéril e adicionar 400 ul de solução de PEI ou PDL, preparado como no passo 4.1. Incubar O / N a 37 ° C num incubador de cultura de tecido.
- De manhã, lavagem lamelas três vezes com água e adicionam-se 5 ug / ml de laminina em PBS durante 1-3 horas a 37 ° C. Antes de se dissociar neurônios, aspirar o laminina e imediatamente transferir a lamela a um poço de um prato de 12 poços contendo 1 ml de meio de NPC, tendo a certeza de manter o lado tratado voltado para cima.
- Loja pratos e lamelas a 37 ° C até NPCs estão prontos para a chapa.
5. Manutenção de Neurônios
- No DIV 1, médio aspirado e substituir por meio de cultura de N2.
- No DIV 2 e 4, médio aspirado e substituir por meio de cultura B27.
- Em 8 DIV, o meio aspirado e substituir com inibidores mitóticos contendo meio de cultura de B27 para eliminar a contaminação de células não neuronais.
- No DIV 12, substitua-o por meio de cultura B27.
- Não retire DIV12 + ESNs de 5% de CO2 até que esteja pronto para uso.
6. inibição medida de Synaptic Transmission (MIST) Ensaio para Quantificação miniatura Currents Excitatory pós-sinápticos
ATENÇÃO: As neurotoxinas de Clostridium são as substâncias mais tóxicas conhecidas, com LD humano cerca de 50 valores tão baixos quanto 0,1-1 ng / kg. Obter as aprovações necessárias antes de usar estas toxinas e tomar as precauções apropriadas.
- Diluir cuidadosamente BoNT / A a 100 vezes a concentração final desejada em meio de cultura ESN e aquecer a 37 ºC. Adicionar volume apropriado de toxina para DIV 21 + ESN culturas, agite a placa de cultura, e retornar para incubadora.
- Se as células serão analisadas mais do que 4 horas após a intoxicação, adicionar toxina para o prato e redemoinho sem remoção de CO2 a 5%, tal como directamente na incubadora ou numa câmara constante de CO 2.
- No ponto de tempo apropriado, aspiraçãote ESN meio de cultura e lavar duas vezes com tampão de gravação extracelular (ERB). Adicione 4 ml de ERB suplementado com 5,0 mM tetrodotoxina e 10 mM bicuculina, bloqueando potenciais de ação e antagonizar GABA A atividade do receptor, respectivamente.
- Transferir prato para eletrofisiologia rig. Nem perfusão nem controle de temperatura é necessária para o ensaio de névoa.
- Puxe vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta para produzir uma pipeta de gravação com 5-10 mohms de resistência e encha com buffer de gravação intracelular. Delicadamente mergulhe preenchido pipeta de gravação em siliconização reagente antes da gravação.
- Usando uma seringa cheia de ar, fornecer pressão positiva como a pipeta de gravação é rebaixada para a ERB. Após o desembarque suavemente a pipeta de gravação na soma do neurônio a ser gravada, retire a pressão positiva e formar uma gigaseal. Diminuir a tensão de exploração para -70 mV. Cuidadosamente aplicar pressão negativa para quebrar em configuração de célula inteira.
- Mudar para a atual-clamp para monitorar e registrar potencial de repouso da membrana. Sem ajustamento para potenciais de junção líquida, o potencial de repouso da membrana será entre -67 a -82 mV.
- Realize uma contínua -70 mV gravação tensão-clamp para 4-5 min para detectar miniatura excitatórios correntes pós-sinápticos (mEPSCs).
- Analisar 4 min de dados gravados para a detecção mEPSC usando software de detecção de pico com as seguintes configurações: Threshold, 5; Período para procurar um máximo local, 10.000 ms; Tempo antes de um pico de referência, 5.000 ms; Período para procurar um tempo de decaimento, 20.000 ms; Fração de pico para encontrar um tempo de decaimento, 0,37; Período em média uma linha de base, 1.000 ms; Limiar Área, 20; Número de pontos de pico média, 1; Direção de pico, negativo.
- Recolher e guardar informações sobre os eventos detectados. Dividir o número de eventos detectados em 4 min por 240 para determinar a frequência em Hz mEPSC.
- Recolha freqüências mEPSC para 8-12 controls e 8-12 amostras tratadas com BoNT para cada condição de exposição. Analisar frequência contra idade e controles pareados por lote. Determinar a significância estatística da% de inibição da atividade sináptica através de uma via de testes de variância e teste post-hoc de Dunnett.
Representative Results
Nós desenvolvemos um protocolo de diferenciação que permite a produção económica de quantidades grandes de neurónios derivados de células estaminais altamente puro a partir de CES de ratinho (descrito na Figura 1A) 8,11. Este método tem sido utilizado ao longo de um período de anos para diferenciar reproducibly gerados privada e comercialmente disponíveis linhas ESC em neurônios de linhagens definidas 12-14. Elementos críticos deste protocolo incluem: (1) a adaptação dos CES para alimentador de cultura de suspensão livre de células; (2) a manutenção adequada das culturas em suspensão; e (3) a diferenciação em condições rotativos. A transição para a cultura em suspensão reduz drasticamente o tempo e custo de manutenção CES, e obvia a necessidade de remover células de alimentação antes da diferenciação. Após adaptação suspensão, OCT3 / 4 expressão é consistente através de pelo menos 30 passagens, o que indica que a adaptação suspensão não altera a expressão de marcadores de pluripotência (Figura 1B-D 7 células por passagem. Isso normalmente ocorre dentro de dez passagens após adaptação suspensão ou cinco passagens após o descongelamento dos CES que antes eram adaptados à suspensão. Rotação mecânica de diferenciar agregados também foi encontrado para ser crítico para o aumento da produtividade neuronal. A adição de um agitador rotativo eliminaram a formação de super-agregados, aumentando a viabilidade total e produzindo um aumento de ~ 300% no rendimento de células progenitoras neurais (NPCs) a 0 DIV (Figura 1E).
A diferenciação típica começa com 3,5 x 10 6 CES em DIV -8 e produz 115 x 10 6 NPCs na DIV 0, cerca de 60% dos quais vão sobreviver e se tornarem neurônios. Os restantes 40% compreendem células não-neuronais e são em grande parte eliminado por privação de soro entre DIV 0 - 1. O pequeno número de células da glia persiste pode ser removido pela adição de inh mitóticasibitors de DIV 2-4 ou DIV 8 - 12. densidade de revestimento é crítica em DIV 0; neurônios banhados muito pouco não vai sobreviver para além de 2 semanas. Poucos dias depois de chapeamento, neurônios diferenciados apresentam morfologias neuronais e compartimentalizar proteínas neurotypic, como o MAP2 marcador somatodendrítico eo marcador axonal Tau (Figura 2A). Por DIV 14 sinapsina-1 + puncta pode ser identificado nas interfaces axodendritic, sugestivos de formação de sinapses. Isto é consistente com a expressão de proteínas marcadoras sinápticos antes DIV 7 8,11. Morfologias neuronais continuam a amadurecer através DIV 21, altura em que as culturas de tempo exibem elaboradas mandris axodendritic e grande puncta sináptica (Figura 2A). Se mantido adequadamente, ESNs permanecer viável e ativo por pelo menos 4 semanas após o plaqueamento.
Profiling expressão Longitudinal usando RNA-seqüenciamento corroborada evidência morfológica e proteômica de neuronal uma especificaçãod maturação 11,15. Marcadores representativos de progressão do desenvolvimento exibiram perfis de expressão específico do estágio, incluindo OCT3 / 4, nestina, DCX, NeuN e KCC2 (Figura 2B). Por DIV 0, ESNs expressa cópias abundantes de proteínas estruturais específicos de neurónios, incluindo MAP2 e Tau. Consistente com os achados anteriores, foram observados marcadores para apenas dois subtipos de neurônios: mesencéfalo / hindbrain neurônios glutamatérgicos expressando vGluT2 e GABAergic interneurons 8. Do mesmo modo, uma grande variedade de glutamatérgicos e gabaérgicos marcadores exibiram fortes aumentos na expressão entre 0 e DIV DIV 7, incluindo proteínas SNARE pré-sinápticas necessárias para a libertação de neurotransmissores; receptores de neurotransmissores necessários para as respostas pós-sinápticos; e proteínas do andaime necessária para amarrar a estes receptores da membrana pós-sináptica. Neurônios apresentam características elétricas intrínsecas maduros por DIV 14 e correntes pós-sináptica excitatória miniatura espontâneas por DIV16 16.
A inibição medida de Synaptic Transmission (MIST) ensaio foi utilizado para avaliar o efeito da intoxicação na atividade sináptica. Ao comparar as frequências mEPSC entre DIV intoxicados e tratado com veículo + 24 SNEs, MIST proporciona uma medição quantitativa e específico de intoxicação com base na inibição funcional da actividade sináptica (Figura 3A). MIST foi usado para medir os efeitos da BoNT / A- / G ou barraca na atividade sináptica em ESNs em 20 horas após a adição de banho de cada toxina. As toxinas foram adicionados a uma concentração equivalente a 10 vezes o valor de EC 50, como previamente determinado por análise de imunotransf erência de proteína SNARE clivagem 11. Todas as toxinas reduzida frequências mEPSC para menos de 5% de controlos tratados com veículo. As reduções nas taxas de sinápticas não eram imputáveis à morte celular ou respostas intrínsecas alterados, uma vez que ESNs intoxicados foram capazes de ser remendado, disparou potenciais de ação repetidasem resposta à injecção de corrente e não exibiram nenhuma alteração significativa no potencial de repouso da membrana (Figura 3B, C).
Para comparar a sensibilidade de MIST aos métodos existentes para detectar os nanotubos de carbono, o limite de detecção e concentração inibidora média (IC50) foram determinados 20 h após a adição de BoNT / A para SNEs. Intoxicação por tão pouco quanto 0,005 pM BoNT / A produziu uma redução estatisticamente significativa na frequência mEPSC, com um valor de 0,013 pM IC 50 e silenciamento completa da atividade sináptica acima 12:05 (Figura 4A). Este valor de IC 50 corresponde a cerca de 0,5 unidades de rato letais / ml, sugerindo que a névoa é duas vezes mais sensível e de 2 a 4 vezes mais rápido do que o MLA na detecção da presença de substrato de BoNT / A. Medições Immunoblot de clivagem de SNAP-25 produziu um valor de EC 50 de 0,38 pM e uma dose mínima detectável de 0,05 pM, o que indica que MIST é aproximadamente 30 vezes mais sensíveisdo que a detecção à base de imunoblot de proteínas clivadas SNARE (Figura 4B).
Figura 1. ESNs adaptado de suspensão permanecem mitotically estável e expressam marcadores de pluripotência. (A) Esquema de manutenção e diferenciação ESC. A presença ou ausência de ácido retinóico (RA) ou factor inibidor de leucemia (LIF) é marcado com um + ou -. Uma comparação entre os dias in vitro (DIV) e fases de desenvolvimento clássicas (DS) para culturas de neurônios primários são fornecidas 17. Taxas (B) Proliferação de R1, D3 e linhas celulares de C57BL / 6J ES estabilizar por cinco passagens depois da transição para a cultura em suspensão. (C) A citometria de fluxo dados demonstram nenhuma mudança substantiva na OCT3 / 4 expressão na R1, D3 e linhas celulares C57BL / 6J ES medido ao longo de 25 passagens em cultura de suspensão (n = 6 para cada). (D) os rendimentos de células reais durante passaging rotina para uma linha R1 ESC adaptado à suspensão de medida entre 5 e 30 passagens (linha preta). Produções acumuladas teóricas se não houver células são descartados durante passaging também são apresentados (linha vermelha). (E) imagens de campo claro de DIV 0 agregados produzidos sob estática (esquerda) ou condições rotativos (direita). Condições agregados esféricos rotativos produzido sem aglomeração e aumento NPC produz 3 vezes (p <0,001, determinado pelo teste t de Student) 11. * Indica um P <0,05. Este valor foi modificado a partir Hubbard et al. 11 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. morfológica, previdência oteomic e transcriptómico de especificação neuronal e maturação (A) a partir de imunocitoquimica DIV 7 -. DIV 49 demonstra arborização neuronal e o aparecimento de pontos lacrimais sináptica nas interfaces axodendritic. Os axônios são rotulados com Tau (verde), dendrites são rotulados com MAP2 (vermelho), compartimentos pré-sinápticas são rotulados com sinapsina (branco), e os núcleos são corados com DAPI (azul). (B) a expressão de genes Longitudinal de perfis representativos demonstrando a expressão específica de estágio de desenvolvimento e especificando subtipos neuronais. Todos os transcritos do gene são expressos em número aproximado de transcritos por célula. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. ESNs sob. ir a inibição da atividade sináptica quando expostos a BoNT / AG e TeNT (A) traços representativos de ESNs coletadas 20 horas após a adição de banho de ~ 10 x EC 50 valores de BoNT / A - / G, barraca ou veículo. Cada neurotoxina diminuição da atividade sináptica por mais de 95% em comparação aos controles. (B) neurónios intoxicados continuou a ser capaz de disparar APs repetidas em resposta à despolarização de injecção de corrente (tal como demonstrado para BoNT / A, mas observada em todas as culturas intoxicado) e (C) não apresentaram alterações no potencial de membrana em repouso negativo (C; n> 18 para cada tratamento). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Determinação da sensibilidade do MIST em BoNT / A-tratadosESNs. (A) medições névoa de atividade sináptica 20 horas após a adição de banho de BoNT / A. Segmentos representativos de rastreio de tensão-grampo exibiram um decréscimo na frequência mEPSC seguinte BoNT / A exposição (lado esquerdo). A quantificação da frequência mEPSC (gráfico de barras, o lado direito, n = 20 para os controlos; n = 11-22 por cada dose) confirma uma diminuição dependente da dose na frequência mEPSC. A concentração inibidora média foi determinada com um ajuste de mínimos quadrados de uma regressão não linear usando uma inclinação variável de quatro parâmetros (R2> 0,91). Observe o limite de detecção por MIST em ESNs é de pelo menos 0.005 horas. (B) de BoNT / A intoxicação dos resultados SNEs na clivagem de SNAP-25, tal como visualizado por deslocamentos de mobilidade em gel (uma mancha de Western representativa do lado esquerdo com um gráfico de barras que mostra a quantificação da clivagem de SNAP-25, à direita; n = 4) . Observe a sensibilidade diminuída usando SNARE clivagem da proteína (SNAP-25) como um ponto final (EC 50 de 12:36) vs. (IC50 de 0,013 pM). * Indica um P <0,05; *** Indica um P <0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O padrão ouro atual para a detecção CNT, determinação sorotipo e quantificação é o MLA. O MLA interroga toda a gama de hospedeiro: clivagem interacções necessárias para a intoxicação por toxina para ocorrer in vivo (por exemplo, a ligação da toxina a um receptor na superfície da célula, a internalização do complexo receptor-toxina, LC translocação para o citoplasma, LC-mediada de substrato e inibição da neurotransmissão sináptica) 18. No entanto, embora o MLA oferece um modelo fisiologicamente relevante de intoxicação, é recurso intensivo, pode ser confundida por contaminantes e envolve um grande número de ratos com a morte como um ponto final. Alternativamente, ensaios baseados em células para a detecção e quantificação de BoNT têm sido limitados a culturas de neurónios primárias, que também requerem a utilização de animais, ou de linhas de células de neuroblastoma, que não conseguem formar sinapses e, tipicamente, têm baixa sensibilidade a neurotoxinas 8. Até à data, a maioria das medições de intoxicação em thplataformas baseadas em células ese têm contado na detecção da clivagem proteolítica de SNAP-25, VAMP1 / 2 ou 1 11-sintaxina. Isto é problemático porque a clivagem da proteína SNARE foi demonstrado ser não-linearmente relacionado com a inibição sináptica in vivo e, por conseguinte, não podem representar exactamente intoxicação ou recuperação a partir de intoxicação 19,20.
Um sistema ideal modelo baseado em células para a detecção CNT se (i) ser baseada em neurônio; (Ii) ser acoplado com sinapticamente respostas eléctricas neurotypic; (Iii) ser altamente sensíveis a todos os serotipos ou subtipos CNT; e (iv) oferecem escalabilidade, rendimento e de ensaio vezes que são equivalentes ou melhorado ao longo da MLA, a um custo menor e sem a necessidade de uso de animais. Para atender a esses requisitos, foi desenvolvido um método para produzir grandes quantidades de altamente enriquecido, culturas rede de glutamatérgica e neurônios GABAérgicos das linhas de rato ESC comercialmente disponíveis. Nós, então, desenvolveu o ensaio MIST quantificarinibição sináptica em resposta à intoxicação com barraca e BoNT / A- / G. Enquanto o ensaio de névoa pode ser realizado em qualquer população de neurônios synaptically ativo (por exemplo, os neurônios primários ou fatias de cérebro), atualmente ESNs são o modelo neurônio apenas in vitro derivada que reproducibly desenvolve comportamentos emergentes de rede e, portanto, adequado para o ensaio de névoa.
Produzir quantidades suficientes de neurônios da linhagem definida para estudos CNT necessárias várias inovações na cultura e na diferenciação ESC. Primeiro, por selecção de cultura e que podem sobreviver CES-suspensão adaptação, que eliminado o potencial de contaminação por células de alimentação e da necessidade de purificar a partir de células alimentadoras CES no início da diferenciação. Embora os mecanismos moleculares subjacentes a suspensão-adaptação são desconhecidas, CES adaptado de suspensão permanecem mitotically ativo, manter OCT3 / 4 expressão e continuam a ser neurogênica. Usando este método, ~ 1,5 x 10 7 ESCs são tipicamente recuperado cada passagem. Em segundo lugar, a produção de NPCs foi aumentada ~ 300% através da incorporação de agitação mecânica para evitar a aglomeração durante a diferenciação, ostensivamente aumentar a acessibilidade de nutrientes para o interior dos agregados. Durante o processo, verificou-se que o soro utilizado para a cultura CES e diferenciação neuronal é o componente mais importante na manutenção da CES neurogénicas. Para um melhor sucesso, recomendamos a suspensão adaptando células ES para cada lote de soro e armazenamento do soro a -20 ° C para apoiar a cultura ESC e diferenciação neuronal através da data de validade.
Tal como acontece com a maioria das culturas synaptically ativos, DIV 14 + ESNs são altamente suscetíveis a mudanças bruscas de pH, e até mesmo uma breve exposição ao CO 2 atmosférico concentrações podem resultar em neurotoxicidade dentro de 24 horas. Para as experiências que requerem tratamento das culturas, seguido por incubação com duração de O / N ou mais, neurónios deve ser tratado directamente in a incubadora ou transferidos para uma câmara de constante de CO 2 antes da experimentação.
Uma variedade de técnicas confirmou neurogénese e maturação neuronal, incluindo CCI, perfis de transcrição e de células inteiras de patch-clamp electrofisiologia. Mudanças temporais na expressão genética e morfologia dos neurônios foram consistentes com uma rápida progressão através dos estágios de desenvolvimento da neurogênese, e por DIV 16, ESNs exibiu excitatórios e correntes pós-sinápticos inibitórios em miniatura com a rede emergente comportamentos 16. Evidências de atividade sináptica sugeriu que ESNs pode replicar os pathophysiologies responsáveis pelas manifestações clínicas de botulismo e tétano. Isto foi confirmado usando MIST para mostrar que a intoxicação com BoNT / A- / G ou tenda prejudicada freqüências mEPSC de> 95% em comparação com os neurônios tratados com o veículo ou não tratados.
As medições da sensibilidade do MIST para BoNT / A indicaram uma média inibitóriaconcentração (IC50) de 0,013 pM (equivalente a 0,5 rato letal unidades / ml) e um limite-de-detecção abaixo de 0,005 pM, medida a 20 horas depois da adição do banho. Com base nestes valores, MIST é aproximadamente duas vezes mais sensível e como 2 - 4 vezes mais rápido do que o MLA e 30 vezes mais sensível do que a detecção à base de imunotransferência de clivada SNAP-25.
Em conjunto, esses dados sugerem que as populações de rede de neurônios derivados de células-tronco oferecem um modelo fisiologicamente relevante, baseado em células de intoxicação. Em combinação com métodos melhorados para derivar culturas ESN em rede a partir CES adaptado de suspensão, o uso de MIST deve reduzir a necessidade de ensaios em animais e as desvantagens associadas, os custos e as preocupações éticas do MLA, proporcionando uma medida mais rápida, sensível e específico de intoxicação. Apesar de células inteiras patch-clamp eletrofisiologia é um método de baixo rendimento para identificar a presença de neurotoxinas ativos, oferece uma resolução e speed que é exequíveis com a utilização de métodos moleculares. Estes resultados também fornecem evidências de que a aplicação de métodos dependentes de atividade para avaliar a atividade sináptica e comportamento da rede pode permitir a detecção rápida e específica de neurotoxinas. Tais abordagens de maior rendimento faria estudos sobre os mecanismos de triagem, terapêutico ou ensaios de diagnóstico viáveis para uma ampla gama de agentes neuromoduladores, incluindo os nanotubos de carbono.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (IAA número AOD12058-0001-0000) e da Agência de Defesa Redução de Ameaças - Joint Ciência e Tecnologia do Office, Medical S & T Division (números de subvenção CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 e CBM.THRTOX.01.RC.014). Esta pesquisa foi realizada enquanto PB realizou uma Defense Threat Reduction Agency Research Award Associateship-National Research Council e KH realizou uma Research Award Associateship Conselho Nacional de Pesquisa. Agradecemos Angela Adkins e Kaylie Tuznik (USAMRICD) para assistência técnica; e Cindy Kronman (USAMRICD) para obter assistência editorial. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não refletem a política oficial do Departamento de Exército, Departamento de Defesa, ou do Governo dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
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