A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

Daniel Basilio; Alessio Accardi

doi:10.3791/52369

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Articolo metodologico

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl

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DOI:

10.3791/52369

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20 aprile 2015

Daniel Basilio¹ , Alessio Accardi¹^,²^,³

¹Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, ²Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, ³Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

In questo articolo

Sommario

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

Abstract

Gli ultimi 15 anni sono stati caratterizzati da un'esplosione della capacità di sovraesprimere e purificare le proteine di membrana dagli organismi procarioti così come dagli eucarioti. Questo aumento è stato in gran parte guidato dal successo della spinta per ottenere informazioni strutturali sulle proteine di membrana. Tuttavia, la capacità di interrogare funzionalmente queste proteine non è progredita allo stesso ritmo ed è spesso limitata a saggi qualitativi di valore quantitativo limitato, limitando così le intuizioni meccanicistiche che possono fornire. Viene descritto un saggio per studiare quantitativamente l'attività di trasporto di canali o trasportatori di Cl^- ricostituiti. Il test si basa sulla misura del tasso di efflusso di Cl^- dai proteoliposomi in seguito all'aggiunta dello ionoforo K⁺ valinomicina per deviare il potenziale di membrana. Un elettrodo sensibile agli ioni viene utilizzato per seguire l'andamento temporale dell'efflusso ionico dai proteoliposomi ricostituiti con la proteina desiderata. Il metodo è particolarmente adatto per gli studi meccanicistici, in quanto consente la determinazione quantitativa delle proprietà chiave della proteina ricostituita, come la sua velocità di trasporto unitaria, la frazione di proteina attiva e la massa molecolare dell'unità funzionale. Il test può essere utilizzato anche per determinare l'effetto di composti di piccole molecole che inibiscono o attivano direttamente la proteina ricostituita, nonché per testare gli effetti modulatori della composizione della membrana o dei reagenti che modificano i lipidi. Ove possibile, il confronto diretto tra i risultati ottenuti con questa metodica è risultato in buona concordanza con quelli ottenuti con approcci elettrofisiologici. La tecnica è illustrata utilizzando CLC-ec1, uno scambiatore H⁺/Cl^- di tipo CLC, come sistema modello. Il saggio di efflusso può essere utilizzato per studiare qualsiasi canale/trasportatore conduttore di Cl e, con modifiche minime, può essere adattato per studiare qualsiasi proteina che trasporta ioni.

Introduzione

Negli ultimi due decenni la capacità di iperespressione e purificare proteine di trasporto di membrana è drammaticamente aumentato: i canali ionici, trasportatori primari e secondari sono ormai di routine purificati da sistemi di espressione eterologhi e fonti naturali. Nuovi approcci per monitorare l'espressione, di migliorare e facilitare l'estrazione e migliorare la stabilità di queste proteine sono in continua evoluzione ^1-5. Queste innovazioni tecnologiche sono state fondamentali per innescare l'esplosione di livello atomico informazioni sulla struttura delle proteine di membrana che, a sua volta, migliorato la nostra comprensione de....