Introduction
Nas últimas duas décadas, a capacidade para sobre-expressar e purificar proteínas transportadoras de membrana aumentou dramaticamente: canais de iões, os transportadores principal e secundário são rotineiramente purificado a partir de sistemas de expressão heterólogos, bem como as fontes naturais. Novas abordagens para monitorar expressão, melhorar e facilitar a extração e melhoram a estabilidade dessas proteínas estão sendo constantemente desenvolvidos 1-5. Estes avanços tecnológicos têm sido fundamentais para desencadear a explosão de informações estruturais em nível atômico em proteínas de membrana, que, por sua vez, reforçada a nossa compreensão das bases estruturais da sua função. Em contraste, a nossa capacidade para sondar as propriedades funcionais das proteínas purificadas não aumentaram com a mesma velocidade, de modo que, em alguns casos, a informação estrutural de alta resolução é acompanhada pelos dados funcionais qualitativos, limitando assim a capacidade de testar quantitativamente previsões baseadas em estrutura. Assim, o desenvot de ensaios funcionais quantitativos e generalizáveis é um passo fundamental para a elucidação das bases mecanicistas da função da proteína de membrana.
Descrevemos aqui um ensaio de efluxo que pode ser utilizado para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da purificados e reconstituídos Cl - canais e transportadores. Os princípios subjacentes a ensaio pode ser generalizada para uma variedade de sistemas de transporte, bem como para o transporte de proteínas não-iônicos. Os lipossomas são reconstituídos com purificados Cl - / canal transportadores, na presença de um grande gradiente de Cl - (Figura 1A, B). Cl - efluxo é iniciada pela adição de um ionóforo para permitir fluxo de contra-ião, no nosso caso, o K + ionóforo valinomicina, que desviam a tensão estabelecida pela Cl - gradiente e definir o potencial de membrana inicial do potencial de equilíbrio de K + 6,7. Sem tele não ionóforo Cl líquido significativo - efluxo ocorre, uma vez que é impedida pela geração de um potencial transmembranar. Os dados são descritos quantitativamente por dois parâmetros mensuráveis (Figura 1C): τ, a constante de tempo de efluxo de Cl -, e f 0, a fracção de lipossomas que não contêm uma proteína activa. De τ 0 e f o Cl unitário - a taxa de transporte, a fracção de proteínas activas e a massa molecular do complexo activo pode ser derivado 8. A técnica é ilustrada aqui, usando proteoliposomes reconstituídos com CLC-EC1, um bem caracterizado CLC-tipo H + / Cl - trocador de estrutura e função conhecida. Este ensaio é prontamente generalizado para canais ou transportadores com diferentes selectividade iónica ou cuja actividade depende da presença de tensão e / ou ligantes. Além disso, este ensaio pode ser usado para determinar se as moléculas pequenas afectar directamente a proteína reconstituída,para quantificar os efeitos destes compostos e composição como membrana ou reagentes modificadores de lípidos afectar a função dos canais reconstituídos e transportadores.
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Protocol
1. Preparação Lipid
- Alíquota os lípidos quantidade desejada para um tubo de vidro transparente. Use E. coli extracto de lípidos polares, mas a maioria das composições de lipidos podem ser usados. Se os lípidos são na forma de pó, ressuspender em clorofórmio a uma concentração de 20 mg / ml. Secar os lípidos à temperatura ambiente sob atmosfera de N 2 gasoso até todo o solvente se ter evaporado.
- Ressuspender os lipídios em pentano e secá-lo novamente um fluxo constante de gás N 2 para remoção de vestígios que sobraram de clorofórmio. Seco até todo o solvente tenha evaporado. Enquanto a secagem, rodar suavemente o tubo de modo a que o lípido é distribuído numa película uniforme que cobre o terço inferior do tubo em vez de uma formação de uma massa densa na parte inferior.
- Adicionar o tampão de reconstituição contendo detergente (KCl 300 mM, ácido cítrico 50 mM, 25 mM de K 2 HPO 4, pH 4,5, CHAPS a 35 mM) para dissolver os lípidos. Usar outros detergentes suaves para este passo, se a proteína é mal tolerante para CHAPS.
- Resuspend os lipídios a clareza usando um banho de água sonicator. Mergulhar o tubo no centro do banho de ultra-sons de água à potência máxima de curta duração (30 sec-1 min) com pulsos de curta duração (30 sec-1 min) faz uma pausa. A solução deve ficar clara.
NOTA: O grau final de clareza obtida depende da composição do lípido específico utilizado. Alguma variação lote-a-lote neste passo, mesmo entre lípidos nominalmente idênticas, também é possível. Turvação residual é devido à dispersão da luz pelas partículas grandes em suspensão, que podem ser removidos por centrifugação. - Incubar os lípidos ressuspensas a TA durante 20-60 min.
2. proteolipossoma Formação
NOTA: Várias estratégias podem ser empregues para inserir o detergente-proteína solubilizada em lipossomas. Para CLC-EC1 diálise funciona bem e é, por conseguinte, o método de escolha 6,9,10.
- Adicionar a proteína purificada para a desejada proteína e lípido (P / L) razão (expressa em ug o f proteína / mg de lípido). A escolha da relação P / L depende do objectivo da experiência.
- Se o objectivo é o de avaliar a actividade da proteína de interesse, em reconstituir alta P / L para maximizar o sinal, uma vez que cada liposoma contém múltiplas cópias da proteína. Para quantificar a actividade e / ou a taxa de transporte unitário da proteína, reconstitua num regime de diluição de Poisson em baixo P / L, de modo que cada vesícula contém, em média, uma proteína. Veja o Passo 7 e Discussão para uma análise mais profunda de quando usar cada regime.
- Para determinar os valores de P / L óptimas para os vários esquemas, realizar uma titulação completa da actividade como uma função da concentração de proteína 8,11-13. No entanto, para qualquer proteína para a qual o peso molecular (PM, expressa em kDa) da unidade activa é conhecido os seguintes valores de P / L podem ser utilizados como guesstimates iniciais:
pg "/>
- Coloque a mistura de proteína e lípido num tubo de diálise pré-humedecido ou uma cassete. Colocar o dispositivo de diálise num copo contendo 500-1,000x o volume do tampão de reconstituição lípido (isto é, um tampão de L para 1 ml de ressuspensão lipídica) sob agitação suave.
- Mudança de tampão de 3-4 vezes em intervalos de> 3 h. Em cada mudança solução, lava-se a cassete / tubo e o copo com água destilada e enche o recipiente com tampão fresco a reconstituição. Incluir 1-2 S / N intervalos para a mudança solução. O número exacto e duração da solução muda depende do lípido exacta e detergentes utilizados.
- Após a última etapa é concluída, remova os lipossomas a partir do navio de diálise, aliquotar-los em tubos e flash congelá-los em N 2 líquido ou congelar a -80 ° C.
3. A gravação Set-up
<p class = "jove_content"> NOTA: A gravação de set-up (Figura 2A) consiste de duas câmaras (cilindros de fundo plano, ~ 3-4 ml de volume), um Cl - (veja abaixo) eletrodo, um medidor de pH com um análogo ou saída digital elétrica, um digitalizador e um computador com um software de aquisição apropriado.- Ligue o Cl - eléctrodo para o medidor de pH, a saída do medidor de pH para o digitalizador que está ligado ao computador. Inserir o eléctrodo de referência em uma câmara e o fio recodificação no outro (Figura 2B).
NOTA: A polaridade dos fios é correto se AV Cal (ver Passo 6.4 e 7.2) é positivo. - Coloque as câmaras numa placa de agitação com uma barra de agitação na câmara de gravação (Figura 1B). Certifique-se a barra de agitação não toca o eletrodo.
- Ligar as câmaras que utilizam uma ponte de agar (Figura 2B) (KCl 100 mM e 2% de agarose). Guarde as pontes Agar em KCl 100 mM.
4. Preparação do Cl - Eléctrodo
- Tome um eletrodo de pH não-funcionamento de idade e -possibly-. Quebrar o revestimento de vidro para revelar completamente os fios de prata.
- Retire cuidadosamente o revestimento dos fios de prata, usando uma lâmina de bisturi. Limpe os fios usando grandes quantidades de H 2 O e EtOH.
- Lugar numa solução saturada de FeCl 3 (ou cloro) até fios são cobertos com um revestimento escuro uniforme de AgCl.
5. Preparação de Unilamelares Vesicles
- A noite antes das experiências, inchar 1 g de Sephadex G-50 em grânulos de 15 ml de tampão externo (1 mM KCl, 150 mM de K 2 SO 4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) com agitação suave (não agite) para pelo menos 3 horas à temperatura ambiente antes da sua utilização. Cada experiência requer ~ 3 ml de pérolas inchadas. Manter os grânulos inchados a 4 ° C durante alguns dias no máximo.
- Embora os lipossomas são descongelar à temperatura ambiente, verter em cada coluna de ~ 3 ml de inchados G-50 grânulos. Deixe-os secar por fluxo de gravidade na RT; isso geralmente leva 1-2 min.
- Preparar vesículas unilamelares por extrusão dos proteolipossomas 11 vezes através de um mini-extrusora utilizando um ponto de corte de 0,4 m de Teflon.
- Inserir a coluna em um tubo de plástico de fundo redondo. Gire as colunas para remover o excesso de solução. Centrifugar durante 20-30 segundos a 1400 x g numa centrífuga clínica.
- Descartar escoamento, lugar coluna num tubo de vidro de 13 x 100 mm e adicionar 100 ul de vesículas extrudidas para a coluna. Rotação coluna durante 1 min a 500 xg numa centrifugadora clínica.
- Recolhe ~ 200 ul de fluxo de passagem que vão ser adicionados à câmara de registo no passo 6.5.
6. Efluxo Medição
- Coloque 2 ml de KCl 100 mM na câmara (terra) de referência, e 1,8 ml de tampão externo (1 mM KCl, 150 mM de K 2 SO 4, 25 mM de ácido cítrico, pH 4,5) para a câmara de registo. O ligeiro desequilíbrio osmótico entre o internoe soluções externas não afeta
- Inicie o programa de aquisição. Deixe a linha de base equilibrar, isso pode levar alguns minutos.
- Uma vez que o sinal atinge uma linha de base estável (os lipossomas são preparados e as colunas de secar), iniciar a gravação (Figura 3A).
- Adicionar 15 ul de uma solução 10 mM de KCl para calibrar o sistema (Figura 2A).
- Adicionar lipossomas. Um pequeno salto pode ser visível devido à remoção incompleta de Cl externo - a partir das proteoliposomes (Figura 3A). Espere até a linha de base se estabilize.
- Adicionar valinomicina (1 ml a 1 mg / ml em EtOH) para iniciar o efluxo (Figura 3A).
- Deixe o efluxo de correr o seu curso de tempo, até que se planaltos (Figura 3A).
- Adicionar 40 ul de 1,5 M β-octilglucósido (β-OG), preparado no tampão externo para dissolver todos os liposomas (Figura 3A). Fim da gravação.
7. Data Análise
- Exportar o arquivo de rastreamento a partir de um formato ASCII ou texto e importá-lo para o programa de análise de escolha.
- Meça a tensão nos seguintes pontos (Figura 3A):
No início da gravação (V 0);
Após a adição do impulso de calibração (V cal);
Após a adição dos lipossomas (V lipo);
No final do efluxo (V fin);
Após a adição de detergente (V tot);
Linha de base, de modo que as tensões V 0 = 0. - Utilizar a equação de Nernst-prancha para determinar o valor experimental de
medindo 
Onde Vol Cal é o volume do impulso de calibração em ul, 1,800 é o volume da câmara no início da experiência, expresso em1; l, [Cl] cal / in são o Cl - concentrações do pulso de calibração e do buffer externo em mM e AV cal é o salto em mV medido após o pulso de calibração.
NOTA: Esta determinação empírica de α serve a três propósitos: ele garante que o sistema está respondendo corretamente, oferece uma medida da consistência da resposta do instrumento entre os experimentos, bem como para verificar se não há erros foram cometidos na tomada de solução. - Calcular a concentração de Cl após cada passo da seguinte forma:
O factor de 3/400 vem da diluição do impulso de calibração 15 ul no volume final de 2.000 mL. - Calculcomeu as mudanças na [Cl] em cada etapa, ΔCl lipo / fin / tot.
- Converter V (t) em Cl (t) com
Diretamente determinar os valores [CL] nos pontos críticos e compará-los com os valores calculados como um controlo interno. - Normalizar o traçado de modo que a lipo Cl rel = 0 e Cl tot rel = 1
- Montar o curso de tempo de efluxo com a seguinte equação:
Onde L é a taxa de Cl - vazamento que é determinada experimentalmente medindo Cl - efluxo de lipossomas livres de proteínas preparadas nas mesmas condições e τ é a constante de tempo do processo. - Calcular v, a velocidade inicial:
Onde ΔCl barbatana é expressa em milimolar e V é o volume da câmara em ul. - Calcular a taxa de transporte / condutância
Em que p é a relação P / L, MW é o peso molecular do complexo activo, expresso em kDa
medindo 
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Representative Results
Nós descrevemos um protocolo detalhado e robusto para medir Cl - transporte mediado por purificada CLC-EC1, um procariota CLC-tipo H + / Cl - trocador, reconstituída em lipossomas. Uma representação esquemática da experiência é mostrado na Figura 3 proteoliposomes reconstituídos com CLC-purificada contendo EC1 e alta - Cl interno. São imersos numa solução de banho que contém baixo Cl -. Sob estas condições Cl líquido - efluxo é impedida pela acumulação de carga positiva no lipossoma (Figura 3A). A adição de valinomicina permite K + para mover através da membrana de manobra, assim, o potencial elétrico e iniciando Cl - efluxo (Figura 3B). O curso do tempo de fluxo é monitorado usando um Cl - eletrodo seletivo e a quantidade total de Cl - contido nas vesículas é medido diretamente por solubilização-los usando detergente. Destesexperimentos em massa é possível determinar as propriedades dos únicos proteínas reconstituídos, como taxa de rotatividade, estequiometria do complexo activo e fração de proteína ativa. Usando Equações 7-9 para ajustar o curso do tempo de efluxo e estimar a taxa de transporte unitário de CLC-EC1 descobrimos que τ (0,2 ug / mg) = 41 sec e f 0 (0,2 ug / mg) = 0,31, indicando que ~ 1 / 3 dos lipossomas contém 0 proteínas activas. A partir desses valores que calculam que a taxa de transporte unitário é γ ~ 2.500 Cl - s-1, em boa concordância com os valores publicados 8,14.
Figura 1: O Cl - ensaio de efluxo (A - B) Representação esquemática do Cl - ensaio -efflux para os lipossomas livres de proteínas (A) ou CLC-EC1.vesículas reconstituídos (B). (C) curso de tempo simulado de Cl iniciou-ionóforo - efluxo de proteoliposomes (preto) ou lipossomas livres de proteínas (linha pontilhada cinza). O efluxo é iniciada por adição de ionóforo (*) e terminada pela adição de detergente para dissolver os lipossomas (^). Red frustradas linha é um ajuste exponencial para determinar o tempo constante, τ, de Cl -. Efluxo de lipossomas contendo pelo menos uma cópia ativa do CLC-EC1 e f 0 é a fração de lipossomas contendo 0 proteínas ativas Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Gravação de configurar (A) A gravação configurar.. (B) Close-up das câmaras. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de rastreamento e análise (A) V típica (t) traços de experiências de efluxo de proteoliposomes reconstituídos com WT CLC-EC1 a 0,2 ug / mg P / L.. As setas indicam os tempos de adição do impulso de calibração de KCl, lipossomas, valinomicina e β-OG. As linhas tracejadas indicam os valores de? V em várias fases. (B) O V (t) de rastreio é convertido em Cl (t) através da Equação 5, normalizada usando a Equação 6 eo tempo de efluxo curso está apto a Equação 7 (linha tracejada vermelha). (C) cursos tempo de efluxo normalizadas de proteoliposomes reconstituídos com WT CLC-EC1 a 0,2 ug / mg P / L (preto) ou em 5 ug / mg P / L (cinza). A linha tracejadas são melhores ajustes dos cursos tempo de efluxo a equação 7.
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Discussion
Nós descrevemos um protocolo detalhado para medir Cl - transporte mediado pelos canais de ânion seletivo purificadas ou transportadores reconstituídos em lipossomas. O exemplo utilizado foi o procariotas H + / Cl - Trocador CLC-EC1. No entanto, a metodologia pode ser facilmente adaptada para estudar canais fechados por ligandos 12,13,15, 11,12 tensão, ou que ostentam diferente selectividade aniónico 15,16 substituindo o Ag: AgCl com um adequado para o ião sob consideração. Os eléctrodos selectivos para outros iões de Cl -, tais como H +, I - e F -, estão disponíveis comercialmente.
Uma discussão sobre alguns dos passos e pressupostos críticos seguir.
Limites da suposição diluição Poisson
A derivação da taxa unitária (Equação 7-9) é válida apenas em um regime de diluição Poisson, quando a maioria dos lipossomas contain apenas uma proteína activa, de modo que a probabilidade de ter múltiplas cópias de um dado de vesículas é baixa e a constante de tempo de efluxo macroscópica da população de vesículas é bem aproximada pela de lipossomas contendo uma única proteína. Com efeito, uma comparação do Cl - curso do tempo de efluxo mediado por lipossomas reconstituídos com CLC-EC1 em baixo (preto, 0,2 ug / mg) e alta P / L (cinzento, 5 ug / mg) (Figura 3C) mostra que na neste último caso a cinética de efluxo tornar mais rápido e f 0 diminui, o que indica que uma fracção menor do total dos lipossomas contém 0 proteínas. A quantidade total de Cl - em ambas as amostras continham vesículas era comparável, ~ e ~ 0,7 umoles 0,55 respectivamente, indicando que os volumes totais internos das vesículas nas duas amostras foi semelhante e que a quantidade de proteína reconstituída não afecta o tamanho de as vesículas. Montagem do / L efluxo curso momento alto P à Equação 7 produz valores de τ ; (5 ug / mg) = 8,8 seg e f 0 (5 mg / g) = 0,06, o que indica que apenas ~ 6% das vesículas não contêm dímeros CLC-EC1 activas em contraste com a ~ 31% quando encontrado P / L = 0,2 ug / mg. Assim, a estimativa da taxa de rotação unitário a alta P / L é γ ~ Cl 450 - s-1, quase 6 vezes mais baixa do que a obtida em baixo P / L e de dados publicados 8,14. Portanto, a análise dos cursos tempo de efluxo de lipossomas reconstituídos em alto P / L's irá subestimar a taxa de transporte unitário da proteína reconstituída. Assim, para determinar com precisão a taxa de transporte unitário de uma nova proteína que é de importância fundamental para determinar com precisão a quantidade de proteína reconstituído e para trabalhar em baixo P / L's, em um regime de diluição Poisson. Isto é conseguido de preferência por meio da determinação de uma análise de titulação da proteína completa para identificar o regime ideal para trabalhar.
Determinação da massa do complexo activo
tenda "> A análise descrita acima, assume que a estequiometria do complexo activo é conhecido e a proteína reconstituída é totalmente activa. No entanto, para as novas preparações em quantidades que não podem ser conhecidas a priori. Neste caso, é possível determinar directamente estes parâmetros medindo a f 0 's em proteína diferente para lipídio
em que p é a densidade de proteína, 
, Ρ é o número de lipossomas por massa de lípido, N é um número de Avogadro, M P é a massa do complexo do canal funcional e φ é a fracção de proteínas activas. Ajustando-se a determinado experimentalmente f 0 's em vários proteína para lípido é possível determinar p 0, e, portanto, M e P φ.
Uma fração finito de lipossomas é refratário a incorporação
O cálculo do preço de transporte unitário assume que a alta P / L's todos os lipossomas irá conter pelo menos uma proteína de transporte ativo. No entanto, em alguns casos, esta foi encontrado não ser o caso: em alto P / L's uma fração significativa dos lipossomas permanece refratário a reconstituição de algumas proteínas 11-13,17. Embora a origem deste fenómeno não são claros, é concebível que as proteínas maiores podem ser excluídas das vesículas com raios menores, reduzindo assim o número de lipossomas disponíveis.
Neste caso a Equação 10 tem de ser modificada para: 
onde θ é a fração de lipossomas refratários ao protein incorporação. Importante, ρ e φ também são afetados pelo método de reconstituição desde procedimentos diferentes terão diferentes recuperações de lipídios e proteínas durante a reconstituição do lipossoma e formação. Assumindo 100% de rendimento para ambos conduzirá a uma estimativa da mis-γ. Portanto, para obter uma quantificação precisa do volume unitário / condutância é importante para determinar experimentalmente a fracção de lípido e proteína perdida durante a reconstituição 8,11.
Orientação das proteínas reconstituídos
Uma das suposições feitas durante a análise é que todas as proteínas reconstituídos são funcionalmente equivalentes. No entanto, muitos canais e transportadores têm preferido as direções dos Transportes, um fenômeno conhecido como retificação. Esta assimetria funcional pode levar a um erro de estimativa da taxa de volume de negócios. Além disso, a orientação das proteínas é reconstituído à priori + gradientes, para os canais ou transportadores que são ligando- ou dependentes de voltagem.
Considerações sobre a formação de lipossomas apertados
Um dos fatores-chave que permitem a utilização of o ensaio de efluxo descrito aqui, é a formação de lipossomas apertados. Três variáveis importantes a serem considerados para este fim são a escolha de detergente utilizado para solubilizar a proteína, a estratégia de remoção de detergente e a escolha da composição lipídica dos lipossomas. No protocolo aqui apresentado, a CLC-EC1 é solubilizado em decil-maltopiranósido (DM), um detergente com um elevado valor de concentração micelar crítica (CMC), que é, portanto, facilmente removido. No entanto, uma variedade de detergentes sintéticos e de ocorrência natural têm sido utilizados para purificar proteínas que foram subsequentemente reconstituídas em lipossomas apertadas sem efeitos sobre a tensão das vesículas. Esses detergentes possuem uma ampla gama de CMC, tão elevada como milimolar (tal como DM, ou digitonina) e tão baixo como micromolar (tais como dodecil- maltopiranósido (DDM) ou dioctylpropane-bis-maltopiranósido (DMNG)). É importante notar, contudo, que os lípidos usados para formar os lipossomas são solubilizadas utilizando CHAPS, ou outro detergente suave, E, portanto, as micelas híbridas resultantes da mistura de proteínas e lípidos pode ter propriedades físico-químicas diferentes das dos detergentes mãe. Por conseguinte, é possível que em alguns casos, a remoção de detergente residual que pode desestabilizar os lipossomas que conduzem a fugas mais pronunciados. Para contornar esse problema, é aconselhável investigar estratégias de remoção de detergente alternativos, como BIOBEADS 12,13, colunas de spin de filtragem 15 ou gel 18. Finalmente, a composição lipídica das vesículas é um parâmetro importante como misturas específicas pode ser permeável a iões diferentes em determinadas condições. Por exemplo, os lipossomas formados a partir de E. extracto de lípidos polares coli são apertados para Cl - a valores de pH acídicos, mas tornam-se progressivamente mais permeável que o pH aumenta 19 ou lipossomas formados a partir de uma mistura 3: 1 de 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil-etanolamina (PAPA) e 1-palmitoyl- 2-oleoil fosfatidilglicerol (POPG) Exibir uma permeabilidade muito mais baixa do que a H + os que são formados a partir de E. lípidos polares coli extrair 20. É importante notar, contudo, que a composição lipídica das vesículas pode também afectar a actividade da proteína reconstituída 13,21,22. Assim, é importante para determinar precisamente as propriedades das vesículas preparadas livres de proteínas em cada condição e, em seguida, para avaliar o modo como isto afecta as propriedades da proteína reconstituída.
Generalização para canais não CLC-tipo e transportadores
O ensaio de efluxo, tal como descrito aqui, pode ser directamente utilizado para determinar as propriedades das moléculas individuais de qualquer canal de Cl - ou transportador selectiva, e, por exemplo, tem sido utilizado para caracterizar as propriedades do Ca 2+ -carvões ativados Cl - canal 12 TMEM16A . Vamos agora discutir como adaptar o ensaio de efluxo para investigar as propriedades de transportadores ou channels que não são Cl - selectivo e / ou têm taxas de transporte unitárias que são significativamente diferente do 10 ~ 3 seg -1 ião de CLC-EC1.
O caso mais simples é que a proteína sob estudo é anião selectivo. Neste caso, o único ajustamento necessário é substituir o Ag: AgCl com um disponível comercialmente de uma selectividade adequada, tal como foi feito para o F - Flucs selectivos e CLCs 16,23,24 ou I - canais permeáveis, tais como CFTR 15 . Se, por outro lado, a proteína reconstituída é selectiva para catiões, um ionóforo diferente valinomicina tem de ser utilizado para iniciar o efluxo. Dada a escassez de validado Cl - ionóforos um substituto útil é um H + ionóforo, tais como cianeto de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP). Neste caso, é importante para garantir que o pH intravesicular é mantido constante, por exemplo, aumentando o tampãoing capacidade da solução interna. Uma estratégia alternativa é a seguir catião efluxo através de um canal ou transportador reconstituído usando protões como um contra-ião e monitorização H + de transporte usando um medidor de pH 25 ou uma sonda sensível ao pH 26 raciométrica. No entanto, a natureza indirecta destas medições torna quantificação das propriedades de transporte da proteína reconstituída difícil. Finalmente, eléctrodos selectivos para um número de catiões existem e estão disponíveis comercialmente. Um terceiro cenário é que a proteína sob estudo é permeável a ambos os aniões e catiões, por exemplo, um canal pouco selectiva 13 ou um catião / Cl - co-transportador. Neste caso, os lipossomas reconstituídos não mantêm um gradiente de KCl durante o processo de troca da solução (5,4-5,5 passos) de modo que eles perdem o seu teor de sal. Portanto, neste caso, toda a informação cinética é perdida. No entanto, a fracção de lipossomas contendo pelo menos um prot activoein, f 0, ainda pode ser determinada pela adição de detergente e medir o residual preso Cl - o conteúdo (passo 6.8). Isto permite a determinação da massa molecular da proteína através da realização de uma titulação de proteína e usando a Equação 10.
Outro aspecto a considerar é a possibilidade de que a taxa de transporte unitário da proteína reconstituída é ordens de grandeza diferentes do da CLC-EC1. Por exemplo, a maioria dos transportadores têm taxas de rotatividade de 1-10 s -1, 2-3 ordens de grandeza menor do que CLC-EC1, enquanto a maioria dos canais de íons de conduta em 10 -10 6 7 seg -1, 3-4,000 vezes mais rápido do que CLC -ec1. Para transportadores de diminuir a taxa de Cl - vazamento de lipossomas livres de proteínas pode se tornar limitante, como o seu peso relativo no processo de efluxo aumenta à medida que diminui a taxa de transporte da proteína. Na nossa experiência, a taxa de fugas varia um pouco entre as preparações e é geralmente na ordem de umalguns seg -1 ião. Portanto, quando se trabalha com transportadores lentas, é aconselhável preparar lipossomas lado livre de proteína por cada lado para reconstituição para medir com precisão o vazamento correspondente a cada lote de vesículas. O ensaio de efluxo tem sido utilizado com sucesso para determinar a taxa unitária de transportadores lentas, com taxas de rotação em torno de 1-10 ião seg -1, tais como um CLC cianobactérias 27. A situação oposta ocorre quando a proteína reconstituída tem uma elevada condutância, por exemplo um canal de iões. Neste caso, a cinética de efluxo são demasiado rápida para ser resolvido como o tempo de mistura (~ 1-2 seg) e o tempo de resposta intrínseca do eléctrodo de registo de se tornar limitante da taxa. Neste caso, a informação cinética é perdida, mas a massa de complexo activo pode ainda ser determinado 24. Vale a pena notar que outras abordagens, tais como gravações de bicamada lipídica planar ou lipossomas remendo de aperto são mais adequados para estudar canais iônicos purificadas como estes techniques fornecer diretamente única informação molécula com alta resolução temporal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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