Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

Røntgenfluorescens imaging giver mulighed for både identiteten og mængden af ​​elementer til stede i en prøve, der skal rumligt løst. Incident røntgenstråler, med et energi valgt til at være større end elektron bindingsenergi af det tungeste element af interesse, overvinde bindingsenergi af indre skalelektroner til kernen 1. Dette skaber en "hul" i elektron skallen. Som højere energi elektroner falder ned i disse huller, er fluorescerende røntgenstråler der udsendes, hvis bølgelængde afhænger af den energi, adskillelse af disse orbitaler. Da energi afstanden mellem orbitaler er karakteristisk for et givet grundstof, X-ray fluorescensemission har også karakteristiske bølgelængder, afhængigt af elementet. Det er denne emission ved en karakteristisk bølgelængde, der tillader identifikation af de tilstedeværende grundstoffer. Kalibrering af fluorescensintensiteten tillader kvantificering af elementer til stede.

Røntgenfluorescens mikroskopety (XFM) er blevet stadig mere anvendt, dels som følge af udviklingen af ​​meget strålende røntgen synkrotron kilder, som dem på Spring-8 i Japan, Europa Radiation Synchrotronbestrålingscenter Facility (ESRF) i Frankrig, og Advanced Photon Source ( APS) i USA 2. Disse kilder giver meget høj intensitet røntgenstråler. Samtidig forbedringer i X-ray optik, såsom zone plade teknologi tillod fokusering af disse bjælker til sub-micron pletter, omend temmelig ineffektivt 3. Med meget høj intensitet bjælker, selv en relativt lille mængde lys, der kan være fokuseret er tilstrækkelig til at excitere de endogene metaller i celler, der producerer signal, der kan måles med i øjeblikket tilgængelig detektor teknologi. Således studere den kemiske biologi af metaller i cellen er et program specielt, der gør brug af mange af den seneste udvikling i denne teknik 4-10.

Der er mange kritiske faktorer, der skal overvejes, mens appliggende XFM at undersøge elementært distribution og kvantificering af dyrkede pattedyrceller eller andre biologiske prøver. For det første skal den prøve, der skal holdes intakt, både strukturelt og med hensyn til dets elementære sammensætning, for målingen skal være meningsfuld. For det andet skal prøven også bevares på en måde, så det er hårdfør til skaden stråling, der kan være forårsaget af en fokuseret røntgenstråle. En måde, at en prøve kan opfylde begge disse kriterier på en gang skal fryses hurtigt ind i en glasagtig, amorf is 11,12. Hurtig indfrysning opnås ofte gennem forskellige kryopræservering teknikker såsom springet frysning eller højt tryk frysning 13-16. Det er almindeligt accepteret, at kryopræservering bevarer samlede cellulære arkitektur og kemiske sammensætninger i biologiske prøver så tæt på naturligt forekommende tilstand som muligt. Kemisk fiksering på den anden side, på grund af den langsomme og selektiv gennemtrængning af fikseringsmidler i celler og væv well som efterfølgende ændringer i membranpermeabilitet, kan tillade forskellige cellulære ioner især diffunderbare ioner, såsom Cl, Ca og K skal udvaskede, tabte eller flyttet, hvilket gør undersøgelse af disse elementer suboptimale 17-19. Trods den klare fordel, cryo-fiksering i forhold til kemisk fiksering i almindelighed, for adhærente mammale celler især kryopræservering har forskellige begrænsninger 20-23. Den mest oplagte er, at ikke alle forskningslaboratorium har nem adgang til kryokonservering instrumenter. De fleste nuværende højtryk frysere eller endda kaste frysere er dyre og ejes kun af en delmængde af kryo faciliteter, som kan være langt fra hvor cellerne inkuberes. Fordelen ved kryopræservering kan handles til ulempen ved at rejse stress placeret på cellerne. Medens kryopræservering er helt sikkert den mest stringente måde at bevare prøver til røntgen fluorescens analyse, det er bestemt ikke den mest tilgængelige for alle forskere under alle omstændigheder;det er heller ikke altid afgørende, - hvis metallerne af interesse tæt bundet til kan rettes makromolekyler, og den opløsning, som prøven skal afbildes, er større end den skade på ultra-mikrostruktur, der måtte opstå under tørring. Opmærksom på de forbehold 24, kan kemisk fiksering og tørring være et passende valg.

Andre faktorer i en succesfuld røntgenfluorescens imaging eksperiment omfatter grundig analyse. Røntgenfluorescens billeddannelse er fundamentalt røntgenfluorescens emissionsspektroskopi kombineret med raster-scanning til at give rumlig opløsning. X-ray fluorescensemissionsspektrer indsamlede indeholde en kombination af overlappende emissionstoppe, baggrund og de elastiske og uelastisk spredning toppe af den indfaldende stråle. Software, der gør det muligt for de-foldning af disse bidrag, og montering af emissionen toppe, har været en afgørende udvikling på dette område 25. Også udvikling og kommerciel distribution af tynd-film-standarder med kendt sammensætning, der anvendes til at kalibrere fluorescensintensitet i forhold til materiale mængde, har også været meget vigtigt.

Denne protokol giver en beskrivelse af fremstillingen af ​​klæbende celler ved kemisk fiksering og lufttørring. Et afgørende trin i denne proces er væksten af ​​celler på siliciumnitrid vinduer, som ofte ikke klæber godt, gør blid skylning i en bestemt måde nøglen til succes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Instrumenter, substrater, Kultur Medier og fade

  1. Håndtering af siliciumnitrid (Si 3 N 4) vinduer.
    1. Åbne kapslen lidt ved at klemme den ene ende indeholder vinduet på en sådan måde, at ikke klemme vinduet selv, mens det roterer den anden ende af kapslen med den anden hånd.
    2. Tjek et par omvendt, at spids pincet under stereomikroskop sørge for der er ingen klæbende, huller eller bøjninger på spidsen. Ellers kan vinduerne være brudt af en pincet eller flyve ud af dem i de efterfølgende trin.
    3. Fjern vindue fra kapslen ved forsigtigt at gribe rammen af ​​vinduet med en pincet, mens forsigtigt at klemme kapslen nær den åbne ende påføre tryk i en retning, således at kapslen bredere hvor kanterne i vinduet nødt til at komme ud.
  2. Vindue pre-vask (valgfrit).
    1. Hvis det ønskes, forvaskesammensætninger vinduer ved forsigtigt at dyppe demi destilleret vand i 5 sekunder, efterfulgt af 2 min vask i 70% ethanol og 2 min vask i 100% ethanol.
  3. Anbringelse og sterilisering vinduer på dyrkningsskålen.
    1. At anbringe ruder, vinduet med flade side op på bunden af ​​dyrkningsskålen, placere et stykke tape på en ren glasplade. Skær omkring en fjerdedel inch strimmel ned ad den lange side af båndet. Tag et udsnit af båndet fra den korte side (ved ⅛ "af ¾") med en ren barberblad.
    2. Brug en pincet til at anvende den pågældende del af båndet til kanten af ​​nettet eller vindue. Brug nok til sikkert at holde sig det uden at dække vinduet åbning selv. Manipulering klæbet tape med en pincet, indstille vinduet ned på bunden af ​​dyrkningsskålen. Brug spidsen af ​​pincetten at klæbe tape til bunden af ​​dyrkningsskålen fast.
    3. Anvende en anden tape strimmel til den anden kant og klæbe dette til bunden fast med spidsen af ​​pincetten.
    4. Når alle vinduer ertapede, sterilisere vinduer i petriskåle med ultraviolet (UV) stråling. Opnå dette ved at placere skålen under UV-lampe i en laminær strømning i ca. 1 time.
    5. (Valgfrit) Hvis vinduerne skal i forvejen belagt med poly-lysin, gør det følgende vindue sterilisation. Coat vinduet med 10 pi sterilt 0,01% poly-L-lysin opløsningen i 1 time i en 37 ° C inkubator, og derefter skylle den resterende opløsning ud med dyrkningsmediet.
  4. Forbered buffere til endelig vask før XFM.
    1. Forbered enten en Tris-glucose eller piperazin N, N 'bis (ethansulfonsyre) (PIPES) -saccharose buffer fri for spormetaller med osmolalitet og pH svarer til Dulbeccos phosphatbuffer saltvand (D-PBS) uden calcium og magnesium. Brug en af ​​disse buffere at skylle celler efter cellerne kemisk fast.
      1. For at gøre Tris-glucose-opløsning (10 mM Tris, 260 mM glucose, 9 mM eddikesyre,) tilsæt 1,4 g glucose, 36 mg af Tris-base og16 pi eddikesyre til 20 ml ultrarent vand. Derefter justeres slutvolumen til 30 ml med ultrarent vand. Der kræves ingen justering af pH. Opbevar ved stuetemperatur op til en uge.
      2. For at gøre rørene-saccharose (20 mM Pipes, 200 mM saccharose) tilsættes 0,18 g af rør og 2,0 g saccharose til 20 ml ultrarent vand, og pH justeres til 7,4 med små mængder koncentreret eddikesyre. Derefter justeres slutvolumen til 30 ml med ultrarent vand. Opbevar ved stuetemperatur op til en uge.
        BEMÆRK: grund til at undgå anvendelse af PBS i den sidste skylning, er, at koncentrationen af ​​phosphat, chlorid og kalium i PBS er så højt, at det kan forstyrre XFM, hvis det ikke er helt fjernet før lufttørring.
  5. Forbered buffere til celle plating.
    1. Forbered eller tage alle medier, såsom RPMI medium 1640, 1x trypsin-EDTA-opløsning, D-PBS, og alle andre reagenser som er nødvendige for den særlige klæbende cellelinie som normalt ville blive gjort for passage af vedhæftende celler of interesse og opvarme dem til 37 ° C.

2. Belægning Celler

  1. Til den steriliserede dyrkningsskål indeholdende vinduer, i laminær strømning, forsigtigt tilføje medier (10 ml til en 100 mm dyrkningsskål), langs siden af ​​dyrkningsskålen med det vippes i en vinkel. Undgå at skabe unødvendig overfladespænding eller droppe medier direkte på overfladen af ​​silicium nitrid vinduer. Som tilsættes medier, langsomt lindre hældningsvinklen til pels nettet og vindue med medier.
  2. Forbered adhærerende cellelinje af interesse korrekt, trypsinbehandling eller skrabe cellerne ud af pladerne som sædvanlig for passage cellelinien. Udfør en celletælling eller anden forberedelse nødvendig, før anvendelsen af ​​cellerne i frisk plade.
  3. Tilføj celler til dyrkningsskålen med vinduer ved en celletæthed, der er nødvendig for at typisk nå op på 50% -70% konfluens inden 24-72 timer og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% carbondioxid. Observer cellernes vækst lejlighedsvis ved anvendelse af en inverteret lysmikroskop, indtil den ønskede celledensitet (sædvanligvis 50% -70% konfluens) er nået.

3. Fiksering af celler

  1. Forbered frisk 4% paraformaldehyd i D-PBS ved at fortynde en købt lager (såsom 25% paraformaldehyd) og justering af pH til 7,4 med eddikesyre (for at undgå tilsætning af overskud af natrium til prøven).
  2. Når cellerne er blevet dyrket som ønsket, og eventuelle vigtige pletter (såsom Hoescht) er blevet anvendt, og afbildet, fjerne mediet ved forsigtig aspiration, vippe skålen i en 45 ° vinkel med den ene hånd, og opsugning i hånden pipette med de andre .
    BEMÆRK: I stedet for pipettering brugt medier, et alternativ er at vælge vinduet op, dyppe vindue i mikrocentrifugerør med D-PBS to gange og derefter placere den i en ny kultur fartøj med fastgørelse løsninger i 20 minutter, efterfulgt af 2 gange PBS vask for at fjerne de resterende fikseringsmidler. Hvis dette er valgt, gå dirrekte til trin 3.5.
  3. Skyl skålen forsigtigt med D-PBS og erstatte den fjernede væsken straks ved forsigtigt at tilsætte frisk 4% PFA / PBS, mens du holder skålen i en 45 ° vinkel, pipettering mod siden af ​​skålen, og langsomt slapper hældningsvinklen for at tillade fikseringsopløsningen at dække vinduer. Hold cellerne dækket med fiksativ i 20 minutter ved stuetemperatur.
  4. Væsken fjernes ved forsigtig aspiration, igen som ovenfor, vippe skålen lidt og opsugning i hånden.
  5. Udskift den fjernede væske ved forsigtigt at tilsætte nogle af rørene / Saccharose løsning, ved hjælp af den beskrevet i trin 3.3 vipning og pipettering metode.
  6. Gentag trin 3.4 og 3.5.
  7. Forbered materialer til tørring.
    1. Saml fnugfri håndklæder såsom Kimwipes, og træk en ud af kassen, så det er praktisk meget hurtigt og nemt.
    2. Forbered en ren, ikke-plan sted at sætte vinduet tørre. Set ud en gummi gitter måtte af den art der anvendes i elektronmikroskopi, som har højderygge, såvinduet kan skjules i den ene ende, mens den tørrer. Dette vil holde vinduet fra at sidde fast til tørring overflade, da det tørrer, og dræne resterende buffer til kanten af ​​prøven.
  8. Tweeze forsigtigt båndet fastgjort til vinduet for at holde vinduet op af væsken. Hent vinduer, der kommer ud af båndet ved anvendelse af en lille mængde af rør / saccharose for at få dem til at flyde, og derefter samle dem op med det omvendte pincet.
  9. Omhyggeligt (uden at røre selve vinduet) og grundigt bemale eventuelt overskydende rør / sucrose fra kanten af ​​vinduet med en Kimwipe. Også bemale bagsiden indrykket område ved hjælp af en afrundet fold af en Kimwipe.
    BEMÆRK: Målet er at have så lidt krystallisation af salte eller puffere på overfladen af ​​vinduet som muligt.
  10. Placer vindue på nettet måtten. Sørg for, at vinduet ikke ligger fladt på nettet måtten, men skjules på en kant (ved hjælp af kamme i nettet mat) og røre så lidt af nettetmat som muligt. Lad vinduet tørre.

4. Prøve Montering og Imaging

  1. Når prøven er tørret, kontrollere tilstedeværelsen af ​​celler på vinduerne ved hjælp af et lysmikroskop. Udfør denne kontrol, før forberede prøverne til transport til en synkrotron.
  2. Pakke vinduerne for transport til synkrotron beamline hosting dit eksperiment. Forsigtigt anbringe vinduer med tape på to sider til et objektglas, derefter anbringe objektglas med tape til bunden af ​​en plast Petri-skål. Tape petriskålen lukket.
    BEMÆRK: Forud for dette punkt, disse trin kan udføres i en typisk lab. Følgende trin vil bedst gøres på en synkrotron beamline.
  3. Fjern tapen fra vinduet forsigtigt med en pincet. Brug neglelak, i en tynd jævn belægning langs kanten af ​​vinduet, for at sikre vinduerne til en aluminium holder, som de beamline samarbejdspartnere på synkrotron.
  4. Sæt holderen aluminium ien kinematisk montere, og derefter placere den på plads i X-ray mikroskop. Monter prøven på en konsol at slutte den til motoriserede etaper, inden i prøvekammeret ved beamline.
  5. Efter at have forladt prøve røntgen mikroskop instrument område (et bur lavet af bly-fyldte vægge), opsætning scanningen. Brug beamline-specifikke software, vælge den relevante område af prøven at scanne, mens du ser placeringen af ​​X-ray stråle på prøven ved hjælp af et kamera udstyret med en video på tværs af hår og præ-linje med en downstream scintillator kamera.
  6. Vælg den passende opløsning for prøven, der er baseret på et skøn over størrelsen af ​​den mindste funktion af interesse. Til billeddannelse enkelt pattedyrceller (~ 20-40 um i størrelse), skal du bruge en opløsning på 0,25-0,5 um. Til billeddannelse områder af væv, og skelne cellelag fra hinanden, skal du bruge en opløsning på 2-20 um.
  7. Vælg den relevante opholdstid for prøven, der er baseret på et skøn over mængden af ​​opfyldtal af interesse til stede. For et hurtigt overblik scanning, eller hvis store mængder metaller er til stede, brug flyve scanninger med opholdstider på 30-300 ms per pixel. Hvis lidt materiale er til stede, eller at måle metaller med lav relative rigdom, bruge step scanninger med opholdstider på 1-2 sek per pixel.
  8. Programmere de scanninger til beamline-specifikke software. Anskaf et raster-scan billede. Arbejd sammen med beamline samarbejdspartnere til at analysere data med software, der vil identificere de karakteristiske energi toppe for hvert element.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evnen til røntgen fluorescens billeddannelse til at give oplysninger om biologiske prøver er betinget af disse prøver forberedes på en sådan måde, at de er robuste over for skader stråling på tidsplan for forsøget, og alligevel deres kemiske og strukturelle træk er godt bevares. I ser resultatet af en prøve, der er blevet fremstillet som beskrevet ovenfor og afbildet, er det muligt at se, at der er variation i de tilstedeværende grundstoffer - indikerer, at fiksering bevaret disse aspekter af cellen (figur 1).

Omvendt ser i stedet på en prøve, hvor denne proces gik ikke godt, og bufferen er fortsat til stede under tørring, omfattende krystaldannelse fra molekylerne tilstedeværende skaber strukturelle skader på cellerne, og også interfererer med indsamling af X-ray fluorescens spektre ( figur 2).

Disse billeder er genereret af per-pixel montering af X-ray fluorescensspektret ved hvert punkt i billedet. Dette betyder, at hvert spektrum, opsamlet ved hver pixel, er individuelt analyseret. Ved visning af paneler i disse billeder genereret fra de monterede data, værdien tildelt til hvert punkt i billedet er den integrerede sum af en Gauss for den karakteristiske emission af et givet element (fx jern) som passer bedst til røntgenfluorescens spektrum indsamlet på det tidspunkt. For eksempel kan en enkelt pixel i billedet har en værdi (antal) for jern, som er summen af ​​arealet under en Gauss kurve ved den karakteristiske emission energi til jern, der passer og modeller data for emissionsspektret af dette punkt på prøven. Dataene vises med tærskelværdier hvert billede (max og min), der tildeler den høj- og lav-enderne af farve-tabel (i bunden af ​​hvert billede) til specifikke værdier i billedet.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. røntgenfluorescens Billede af en human SH-SY5Y Cell. Hvert panel i billedet viser forskellige oplysninger om de samme celler. Det første panel, mærket DIC, er den optiske forskellen interferens kontrast mikrografi af cellerne. De følgende paneler, venstre til højre, er fosfor (P), svovl (S), jern (Fe) og zink (Zn) billeder af de samme celler, der viser deres fordeling over området af cellen. Skalaen bar vist er 20 um. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Figur 2
Figur 2. røntgenfluorescens Billede af en rotte B103 Cell, fremstillet med dårlig eller utilstrækkelig fjernelse af buffere. To celler er synlige i fosfor (P) panel,og er let synlige i jern (Fe) og zink (Zn) paneler. Tilstedeværelsen af ​​krystalliseret buffer, synlig som en udstrygning af partikler gennem midten af ​​billedet, tilslører meste af den information. Skalaen bar vist er 20 um. Klik her for at se en større udgave af figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

X-ray fluorescens billeddannelse er nyttig i mange områder, herunder Geosciences, materialevidenskab og kemisk biologi 26-34. Fremskridt i synkrotron røntgenstråler, og deres fokus, har givet meget høj intensitet bjælker. Fokuseret røntgenstråler tilstrækkelig til at excitere de endogene metaller i celler nu eksisterer, producerer signal, der kan måles med i øjeblikket tilgængelig silicium afdrift detektor teknologi. Og studere den kemiske biologi af metaller i cellen er et program specielt, der gør brug af mange af den seneste udvikling på dette område.

Men studiet af biologiske materialer ved hjælp af X-ray fluorescens mikroskopi viser også særlige udfordringer i forhold til andre materialer, fordi de er hydreret. For at undgå strålingsskader, ideelt prøverne ville blive fastfrosset i glasagtige is under målingen. Imidlertid kemisk fiksering og lufttørring er langt mere tilgængelige for nybegyndere og kan være hensigtsmæssig, hvis metallerneaf interesse inertly bundet til kan rettes makromolekyler, og den opløsning, som prøven skal afbildes, er større end den skade på ultra-mikrostruktur, der måtte opstå under tørring.

I forbindelse med overvejelserne substrater for vedhængende celle XFM undersøgelser, en ideel substrat har brug for at opfylde følgende grundlæggende krav: 1) at støtte robust cellevækst uden skiftevis normal proliferativ og fænotypisk cellevækst, må 2) ikke har X-ray fluorescens, der overlapper med de elementer af interesse, 3) være optisk transparent til bedømmelse cellevækst under lysmikroskop før XFM, og 4) være i stand til at modstå enhver fysisk og kemisk manipulation under dyrkning og efterfølgende fiksering. Historisk forskellige substrater, fra tynde polycarbonat folier / film 35-37, Formvar overtrukket guld transmissionselektronmikroskopi (TEM) grids 38-42 og siliciumnitrid vinduer 5,17,43-46, er blevet anvendt til at vokse pattedyrcelles og anvendes til røntgenfluorescens billeddannelse. I sammenligning mellem de eksisterende og potentielle substrater til billeddannelse klæbende pattedyrceller ved XFM, siliciumnitrid membran (Si 3 N 4) vinduer er mest velegnede på grund af deres lave fluorescens baggrund og relativt simple elementært sammensætning 4-6,47,48. Desuden Si 3N 4 vinduer understøtter robust cellebinding og proliferation. Sammenlignet med andre almindeligt anvendte substrater såsom TEM gitre, Si 3 N 4 vinduer har også en meget større uafbrudt billedbehandling område, der er en særlig fordel, når disse vinduer tjener til røntgen tomografi.

Si 3 N 4 vinduer er kommercielt tilgængelige fra et begrænset antal leverandører. Arbejde med siliciumnitrid vinduer er en erhvervet færdighed. Windows er meget skrøbelige, og kræver stor omhu for ikke skabe nogen vridningskræfter mens håndtering af dem, der kan splintre dem, eller at slippe dem. Handling dem ved kanterne ved hjælp Reverse pincet er en populær tilgang. De fleste vinduer har tykkelser fra 30 nm til 500 nm og en bredde fra 1 x 1 mm til 5 x 5 mm. I almindelighed, jo tykkere membranen er, desto mere robust de er til alle former for håndtering stress. Men med øget tykkelse og mindre optisk gennemsigtighed, vil de øge baggrunden emissionen fra prøven. De 200 nm tykke membraner er helt ideel. De har minimal indvirkning på målingen, men er robuste nok til at blive håndteret uden megen brud.

Selv om mange testede celletyper kan indledningsvist vedhæfte og robust vokse på sterile Si 3N 4 vinduer, celler dyrket på siliciumnitrid vinduer er generelt meget lettere omrøres end celler på traditionelle cellekulturplader. De bliver let fritstående, aggregerede eller rundet op selv under rutinemæssige medieændringer. Vi fandt forvaskede vinduer ofte blev mere hydrofil; celler vedhæfte bedre og havde mindre chance til at aggregere sammen. De i protokollen trinene ovenfor afgrænse en blid vask tilgang til at holde cellerne på vinduet. Nogle andre skridt, der kan træffes omfatte belægning vinduerne med poly-lysin, eller laminin, lige som man kunne frakke et dækglas.

Et andet aspekt af denne metode, der kan være succes eller fiasko af et givet eksperiment er agitation af prøverne. Ved at observere cellernes vækst på plastik dyrkningsflasker, er det normale spektrum af agitation som følge af pipettering og plade transport ikke ud til at forårsage meget skade. For celler dyrket på silicium nitrid vinduer, er der behov for ekstra pleje under mediernes forandring og plade transport. For nogle let kan omrøres celler, såsom muse fibroblastceller NIH / 3T3, skal håndteres omhyggeligt dyrkningsplader indeholdende vinduer. De har omhyggeligt taget ud fra inkubatoren og forsigtigt sat på mikroskopbordet eller skab overflade. Ikke nødvendigvis hver lille physical chok vil forstyrre cellerne, men risikoen for celle løsrivelse stiger uden ekstra pleje. Desuden kan forskellige batches af føtalt bovint serum og siliciumnitrid vinduer har visse virkninger på fastgørelse af celler på vinduet. Nogle kilder af serum eller partier af vinduer synes lettere at arbejde med, dvs. uden at se for meget forstyrrelse af tilsvarende pleje. Så kan nogle trial and error for cellelinjen af ​​interesse tilrådes.

Med udviklingen i kryogene trin for X-ray fluorescens pæle, samt ny forskning til fremstilling af frosne hydrerede biologiske prøver, er det sandsynligt, at prøveforberedelse i fremtiden vil langt mere i stigende grad omfatter frosne hydrerede prøver. Mange af de samme udfordringer i arbejdet med siliciumnitrid vinduerne, og fastholde celleadhæsion findes der også. Men mestrer denne teknik er stadig et meget godt sted at starte med at udvikle færdigheder, før du forsøger kryopræservering, ennd mange gange, er en perfekt egnet måde at billedet prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Kemi X-ray fluorescens billedbehandling metaller kemiske biologi mikroskopi synkrotron
Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter