Una procedura chirurgica per la resezione Rib Mouse: Un modello per le grandi ossa lunghe Repair

Abstract

Questo protocollo introduce ricercatori di un nuovo modello di grande riparazione ossea utilizzando la costola del mouse. Dettagli La procedura seguente: preparazione del animale per la chirurgia, aprendo la parete del corpo toracica, esponendo la nervatura desiderato dai muscoli intercostali circostanti, asportare la sezione desiderata della costola senza indurre un pneumotorace, e chiudendo le incisioni. Rispetto alle ossa dello scheletro appendicolare, le nervature sono altamente accessibile. Inoltre, nessun fissatore interno o esterno è necessario in quanto le nervature adiacenti forniscono una fissazione naturale. L'intervento utilizza commercialmente scorte disponibili, è semplice da imparare, e ben tollerato dall'animale. La procedura può essere eseguita con o senza rimuovere il periostio circostante, e quindi il contributo del periostio di riparazione può essere valutata. I risultati indicano che se il periostio viene mantenuta, riparazione robusto si verifica in 1 - 2 mesi. Ci aspettiamo che l'uso di questo protocollo saràstimolare la ricerca in riparazione costola e che i risultati faciliteranno lo sviluppo di nuovi modi per stimolare la riparazione ossea in altre località in tutto il corpo.

Introduction

Debilitante lesioni scheletriche, osteoartrite cronica, ei gravi problemi connessi con la chirurgia ricostruttiva impatto produttività economica, benessere familiare, e la qualità della vita. Mentre piccole pause e le lesioni possono guarire abbastanza bene, gli esseri umani non sono in grado di riparare grandi difetti e quindi deve fare affidamento su procedure ricostruttive per ripristinare la struttura e la funzione. La ricostruzione può comportare innesti allogenici o heterogeneic, osso morcellized, ponteggi impiantati, o distrazione osteogenesi. Sfortunatamente, non solo vi sono fattori di morbilità persistenti associati a questi trattamenti, ma la forza originaria dell'osso riparato è raramente raggiunto. Pertanto, sono necessari nuovi approcci clinici.

Senso unico per sviluppare metodi innovativi per il trattamento di difetti segmentali è quello di studiare le situazioni in cui la riparazione su larga scala avviene naturalmente. Anfibi notoriamente in grado di rigenerare gli elementi scheletrici, mentre i mammiferi sono considerate limitate in thè la capacità. Tuttavia, dal momento che la prima parte del 20 ^° secolo, alcuni rapporti di rigenerazione della costola umana sono stati pubblicati suggerisce che gli esseri umani non possono essere limitati così ^1-4. Attualmente questo fenomeno è meglio conosciuto da chirurghi plastici che usano materiale costola per mascella, viso e orecchio ricostruzione, ma non è più ampiamente apprezzato ^5. Per studiare questa riparazione più in dettaglio, abbiamo sviluppato un modello chirurgica utilizzando il mouse. Usando questo protocollo, i ricercatori possono individuare i fattori innati coinvolti e utilizzare queste informazioni per facilitare la guarigione scheletrico in altri luoghi.

Ci sono molti vantaggi di utilizzare le costole come modello per lo studio di riparazione scheletrica. Innanzitutto, le nervature circostanti offrono un fissatore naturale (rispetto alla resezione del femore ^6,7). Questo riduce il rischio di morbilità fissatori interni ed esterni e semplifica la procedura chirurgica. In secondo luogo, gli strati muscolari sottili degli wa pettoll fornire un facile accesso e una visibilità eccellente che fanno il test paragonabile alla comodità di resezioni cranica ^8. In terzo luogo, in contrasto con la Calvariae che costituiscono da ossificazione intramembranosa, forma nervature da encondrale e crescere in lunghezza tramite allungamento a placche di crescita situati alle due estremità di un diafisi centrale. Pertanto, la riparazione delle costole può essere più paragonabile a riparazione delle ossa lunghe dello scheletro appendicolare. Inoltre, abbiamo trovato che rispetto al femore, il periostio della nervatura è più spessa e può essere più facilmente manipolato. Così, gli investigatori che vogliono saggiare riparazione ossea al fine di studiare il periostio o testare terapie cellulari, gli agenti farmacologici e / o impalcature tissutali potrebbero trovare questo modello chirurgica utile. In sintesi, questo modello di resezione costola fornisce un contesto all'interno del quale studiare la riparazione ossea larga scala naturale nei mammiferi in quanto tale modello in uso generale attualmente esistente.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sono in accordo con un protocollo animali approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso la University of Southern California.

1. Preparazione per la chirurgia

1. Lay out gli strumenti e le forniture chirurgici necessari (sterilizzato, articoli 1-18 nella lista dei materiali) e di organizzare un microscopio da dissezione e una fibra ottica trans-illuminatore in un cappuccio o su un tavolo downdraft.
2. Posizionare un mouse sessualmente matura (20 - 30 g, 1 - 3 mesi) di una camera di induzione con 4% isoflurano per indurre l'anestesia.
3. Confermare anestesia con una zampa e / o test di coda pizzico.
4. Applicare una pomata per gli occhi del topo per evitare secchezza oculare durante l'intervento chirurgico.
5. Spostare il mouse alla fase microscopio. Posizionare il mouse nel naso cono del tubo manutenzione e posizionare lateralmente. Fornire un sacchetto riscaldamento adiacente all'animale per aiutare a mantenere la temperatura corporea.
   NONE:. Posizione del mouse è dipendente da preferenze personali e / o manualità del chirurgo, lato a destra oa sinistra va bene.
6. Regolare isoflurano al 2 - 3% per la manutenzione, e guardare la frequenza respiratoria.
7. Iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea (fianco laterale della gamba) per dolore post-operatorio con un ago 25 G. La gamba può contrarsi, che è una risposta normale.

Incisione 2. Apertura

1. Rileva la costola voluta da palpazione, e ripulire l'area di capelli con un rasoio.
   NOTA: Ribs 8-10 sono raccomandati dal costole 1-7 sono più vicini ai polmoni e 11-13 sono notevolmente più brevi. Contando le costole dovrebbe iniziare con la costola più rostrale come numero 1.
2. Preparare la zona con alternanza iodopovidone e isopropanolo (70%) tampone (3x è spesso raccomandato dai protocolli di utilizzo degli animali).
3. Tagliare un'incisione di 2 cm attraverso la pelle, direttamente sopra e parallela alla costola desiderata con le forbici microchirurgia medie dimensioni. Incise attraverso gli strati muscolari e adipose sottostanti.
4. Mettere tutti 3 strati (pelle, muscoli, grasso) in un riavvolgitore per esporre l'area chirurgica, riducendo al minimo la dimensione della incisione.

3. ablazione del Rib

1. Tagliare i muscoli intercostali sovrastanti la sezione desiderata della costola con un bisturi 5,0 millimetri. Posizione questa incisione attorno a 5 mm prossimale al giunto chondrocostal come questo è dove la costola non è così altamente curvo. Separare con cura il muscolo dall'osso con una pinza a punta fine.
2. Per creare una resezione mantenendo periostio nell'animale, tagliare il periostio, lungo la lunghezza della nervatura con un bisturi 5,0 millimetri. Separare con cura il periostio dall'osso sottostante lateralmente con una pinza a punta fine. Procedere con cautela, come periostio è molto delicata e ha una consistenza gelatinosa.
3. Successivo fare una sezione trasversale attraverso l'osso ad una estremità con sottili micro-forbici. Se necessario, misurare la resezione conun reticolo nel microscopio o un manometro tipo righello. Quindi sollevare con attenzione l'osso dal periostio e tagliare l'altra estremità.
   NOTA: Procedere con cautela. Questo è il passo più delicato, come tirare senza asportare la costola di seguito si strappare la membrana pleurica e il risultato in un pneumotorace. Se la membrana pleurica è strappata questo sarà immediatamente evidente come l'interno della cavità toracica diventa visibile.
4. Se l'emorragia si verifica come risultato di taglio dell'osso, applicare pressione alla fine del taglio con un panno di cotone per 4 - 5 sec per fermare l'emorragia.
   NOTA: Nelle rare occasioni che il sanguinamento continua, può essere necessario per fermare e eutanasia dell'animale come significativa perdita di sangue comprometterà recupero (senza sostituzione di liquidi, il volume massimo di sangue che può essere tranquillamente essere perso è del 10% del volume totale del sangue 7,7 -. 8 microlitri / g Per 25 g del mouse, questo è equivalente a circa 180-200 microlitri ^9).
5. Porre immediatamente la nervatura rimosso in4% PFA per le analisi future.
   NOTA: Se la resezione sia l'osso e periostio deve essere effettuata, omettere l'incisione periostio e la separazione (passo 3.2). Dal momento che il periostio è molto strettamente attaccato alla membrana pleurica procedere con cautela, prendere in giro la costola di distanza dalla membrana pleurica con una pinza per evitare strappi.

4. Chiusura della incisione

1. Suturare la muscoli intercostali sopra la parte superiore del manicotto periostio restante con 9-0 suture (2 suture sono generalmente sufficienti). Posizionare i punti di sutura direttamente sopra le estremità tagliate della costola, di agire come indicatori per posizione chirurgia.
2. Rimuovere il divaricatore. Suturare il muscolo sovrastante e grasso con 9-0 punti di sutura (3 - 4 punti di sutura sono generalmente sufficienti). In topi con particolarmente spessi strati muscolari e / o grasso, suturare ogni strato separatamente (ad esempio, 1 strato di suture per lo strato muscolare e 1 strato di suture per lo strato grasso).
3. Chiudere ilpelle con 7-0 punti di sutura (4 - 5 punti di sutura sono generalmente sufficienti).
4. Fissare l'incisione con la colla sutura, pizzicando i bordi con le grandi pinze.
5. Lentamente svezzare il mouse fuori isoflurano per primo adeguamento al 1% per alcuni minuti e poi si spegne.
6. Posizionare il mouse sotto una lampada di calore e lasciare fino coscienza è recuperato, 5 - 10 min. Dopo la coscienza è riconquistato e per tutto il periodo di guarigione, il mouse dovrebbe muoversi e deambulare normalmente e non mostrano segni di sofferenza.

5. Recupero e analisi

1. Fornire la gestione del dolore post-operatorio compresa la somministrazione di buprenorfina in forma di gelatina orale a 0,5 mg / kg ogni 12 ore per 48 ore. La somministrazione orale non richiede immobilizzare l'animale che potrebbe causare dolore alla regione toracica.
2. Mantenere il mouse in una gabbia con libero accesso a cibo e acqua durante il periodo di guarigione. Dopo l'incisione è asciutto, le femmine possono essere co-ospitati durante maschios deve restare isolato per evitare lotte.
3. Dopo il periodo di guarigione, seguire la procedura approvata per l'eutanasia. Rimuovere la gabbia toracica per la fissazione e l'analisi.

Representative Results

Animali tipicamente recuperare rapidamente da questa procedura, l'incisione guarisce bene, e gli animali mostrano un comportamento normale. La procedura utilizza materiali di consumo disponibili sul mercato e dopo la pratica, può essere completato in meno di 1 ora. Prima di utilizzare questa procedura per generare dati sperimentali, è importante analizzare resezione al punto di tempo di giorno 0 per determinare se eventuali grandi frammenti ossei potrebbero rimanere all'interno della zona di resezione. Un modo per valutare procedura corretta è quello di valutare gli animali da X-ray o immagini microCT dopo l'intervento, anche se questo genere richiedono particolari certificazioni di sicurezza di radiazioni. Invece, un altro semplice valutazione può essere completata effettuando un preparato colorazione scheletrico come illustrato nella Figura 1A. Questo comporta la raccolta della gabbia toracica, fissandolo in EtOH, e colorazione con rosso di alizarina utilizzando un protocollo standard ^11. Può essere utile omettere l'idrossido di potassio (utilizzato per digerire distanza tessuti molli) così that il campione può ancora essere utilizzata in seguito per l'analisi istologica, se lo si desidera. Il campione può ancora essere visualizzato senza le misure di idrossido di potassio eliminando nel 80% glicerolo perché lo strato muscolare della parete sovrastante corpo è sottile. Oppure, in alternativa, questi muscoli possono essere rimossi manualmente prima del fissaggio / colorazione come è mostrato qui (Figura 1A).

La porzione di osso rimosso può anche essere analizzata. Se l'obiettivo è di mantenere il periostio nell'animale, la porzione di osso deve avere una superficie liscia come visualizzato mediante microscopia ottica ed analisi istologica (figura 1B, B '). Una porzione di osso rimosso con il periostio dovrebbe avere una superficie distintamente laceri e dopo esame istologico ha uno strato sovrastante periostio intatti, che ha le caratteristiche di un tessuto connettivo denso irregolare (Figura 1C, C ').

A seconda del scopo dell'esperimento, guarigione può esserevalutata in diversi momenti. Le osservazioni indicano che 3 resezioni mm in cui il periostio viene trattenuto nel animale tipicamente guarire completamente entro 1 - 2 mesi. Repair avviene tramite la formazione di un callo morbido e duro, e il rimodellamento. Un esempio di riparazione completa a 2 mesi è mostrato in Figura 2A, A '; riparazione può essere valutata mediante preparazione scheletrica (Figura 2A) e l'analisi istologica (figura 2A '). Se il periostio viene anche rimosso, il divario resezione non viene riempito. La Figura 2B mostra un esempio in cui si è verificato qualche riparazione ad una estremità, tuttavia, è più tipico osservare estremità smussata. Dopo analisi istologica, la zona resezione è riempito con adiposo, tessuto di granulazione, e muscolare (Figura 2B ').

(A) Illustrazione di una resezione costola (4.5 mm) raccolti subito dopo l'intervento chirurgico. Non frammenti di ossa sono lasciati alle spalle. Campione era macchiata di rosso alizarina (utilizzando un protocollo standard, ma omettendo qualsiasi passi con idrossido di potassio per conservare il campione per future analisi istologica) e liquidati in 80% glicerolo. Frecce indicano la posizione delle estremità tagliate. (B) Rimosso porzione costola gabbia toracica illustrato in (A) senza periostio allegata. (B ') sezione istologica mostra periostio minimo attaccato all'osso (frecce gialle, a sinistra) e non periostio a destra (sezione, macchiato con ematossilina eosina). L'asterisco giallo indica la cavità del midollo osseo. Mouse costole non hanno esteso trabecole. (C) parte costola Rimosso mostra il periostio ancora attaccato. (C ') istologica sezione shoala periostio intatto sovrastante l'osso indicato da una staffa giallo (sezione longitudinale, macchiato con ematossilina eosina). Un asterisco giallo indica la cavità del midollo osseo. Bar Scala: A, B, C = 1 mm; B ', C' = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. riparazione Rib post-guarigione in resezioni con e senza il periostio. (A) preparazione Skeletal seguente ~ 2 mesi di guarigione dopo la resezione, mantenendo il periostio intatta all'interno del mouse (preparato come in Figura 1A). Riparazione completa della regione può essere osservato. (A ') Sezione istologica di B mostra un restauro delle mura osso lamellare e lacavità del midollo osseo (ematossilina eosina). (B) preparazione scheletrica (alizarin rosso) dopo ~ 3 mesi di guarigione dopo la rimozione sia una parte costola e il periostio circostante. C'era solo riparazione minima alla fine del taglio mostrato a sinistra del pannello. Un giallo punti di freccia alla joint chondrocostal. (B ') Sezione istologica di B mostrando tessuto di granulazione, adiposo e cellule muscolari di riempimento nel sito della resezione (ematossilina e eosina). Bar Scala: A, B = 1 mm; B '= 500 micron; C '= 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

La prima volta che l'apprendimento di questo protocollo, determinando dove localizzare l'incisione iniziale può essere impegnativo. Tuttavia, la pratica sui topi eutanasia aiuta il chirurgo imparare dove posizionare l'incisione iniziale ed esporre la costola desiderato da asportato. Lavorare su cadaveri migliora anche le capacità fine-motorie necessarie per rimuovere la parte toracica, con o senza il periostio. Inoltre, qualcuno di nuovo a questa procedura potrebbe trovare manipolare le belle strumenti e suture sottili per essere difficile. Mentre legatura, eccesso tirando la sutura può lacerare i tessuti. Così, una certa pratica sutura anche su cadaveri potrebbe essere utile. Infine, se il chirurgo è nuovo a procedure chirurgiche con roditori, può essere utile avere un'altra persona assistere con monitoraggio e regolazione del anestesia durante i primi interventi chirurgici.

La fase più critica di questo protocollo è asportare l'osso senza indurre un pneumotorace (una raccolta anomala di aria nella spa pleuricoce), che è difficile da trattare nel topo poiché la membrana pleurica è troppo sottile per chiudere chirurgicamente. Lo strato di muscolo e parietali pleura inferiore alla costola è molto sottile e delicata; quindi, movimenti precisi sono necessari per impedire una foratura della membrana pleurica che si trova sotto l'area di resezione. Questo si verifica più comunemente nei passi 3.1 e 3.3. In fase 3.1 (separa l'osso dai muscoli intercostali circostanti), il bisturi tagliente e pinze saranno facilmente perforare lo strato pleurico se il punto non è tenuto superficiale. Nel passo 3.3 (ablazione del tessuto osseo con sottili micro-forbici), il posizionamento delle forbici sotto l'osso può superare la resistenza a trazione della membrana pleurica, o l'azione di rottura dell'osso può causare la fine del frammento osseo per perforare la membrana pleurica. Abbiamo scoperto che l'uso di sottili micro-forbici che hanno una punta ricurva è benefico. Inoltre, come sopra, può anche essere utile prima pratica protocollo sui topi eutanasia. Ultinell'intervallo, ma abbiamo scoperto che questo problema può essere facilmente superato con pazienza e pratica.

Anche se la costola è un osso endochondral, ci possono essere alcuni potenzialmente importanti differenze tra lo scheletro costola e le lunghe ossa dello scheletro appendicolare. Dal punto di vista embrionale, lo scheletro costola è derivato da un altro vano mesoderma (somite) che lo scheletro appendicolare (piastra laterale mesoderma) ^12. Così è possibile che non ci sono proprietà che sono unici per la nervatura scheletrico progenitori che riflettono questa differenza nella storia dello sviluppo. Pertanto, nel lungo periodo, può essere necessario determinare queste proprietà uniche sono quindi utilizzare queste informazioni per incoraggiare progenitori nello scheletro dell'arto di mediare riparazione con la stessa facilità come visto nella nervatura.

Un altro aspetto che entra in gioco riguarda la posizione delle nervature rispetto al sistema respiratorio. Alse le costole accompagnamento garantiscono sufficiente stabilità in tutto il resezione tale che non è necessario fissatore esterno, la zona di riparazione è sotto il costante movimento e lo sforzo di polmone inflazione / deflazione. È stato riconosciuto che durante la riparazione ossea, troppo movimento può risultare inibitoria alla guarigione mentre qualche movimento sembra essere importante per la generazione di una cartilagine ^13,14 intermedio. A questo punto, non è chiaro, tuttavia è possibile che la formazione di una cartilagine intermedio può essere un passo fondamentale per la riparazione efficace su larga scala. Così, il movimento delle costole durante la respirazione potrebbe facilitare la riparazione (quando il periostio viene lasciato nell'animale). Poiché il movimento può essere particolarmente importante in questo contesto, lo sviluppo di un metodo per posizionare un fissatore potrebbe essere utile per studiare le influenze biomeccaniche sulla riparazione in futuro.

Eseguendo un test di riparazione costola nel topo, si può usufruire di potenti strumenti genetici che sono stati svipato. Ad esempio, utilizzando i marchi transgenici, l'origine delle cellule di riparazione può essere valutata. Giornalisti transgeniche per la formazione di osso (interessanti nuovi strumenti in fase di sviluppo da Gazit et al. ^15,16), il processo di endochondral, e la lettura di importanti vie di trasduzione del segnale possono essere utilizzati ^12,17. Inoltre, i topi che trasportano perdita-di-funzione alleli potrebbero essere utilizzati per determinare le vie di segnalazione necessari. Attualmente, nessun altro vertebrato organismo modello permette un'ampia varietà di tecniche genetiche come per sondare biologia sottostante base di questo processo.

Inoltre, mentre sono stati sviluppati altri modelli eccellenti per la riparazione scheletrico e sono stati in uso per qualche tempo, un altro contesto per testare ponteggi, composti, e terapie cellulari considerando le caratteristiche di riparazione costola può essere utile. La creazione di un modello di riparazione costola di serie completa i modelli esistenti, come le nervature non sono tenuti a sostenere il corpo e la riparazioneavviene senza stabilizzazione. Inoltre, il contributo del periostio di riparazione può essere facilmente valutabile. Futhermore, perché la nervatura ha sia la cartilagine e segmenti ossei, il confronto tra la guarigione di questi diversi ma correlati tipi di tessuto può identificare una caratteristica comune di effettiva riparazione ^18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'