Summary
Bulaşıcı Ebola virüsleri ile çalışmak biyogüvenlik düzeyi 4 laboratuarlar ile sınırlıdır. Tetracistronic Minigenom içeren parçacıklar gibi çoğaltma ve kopyalama-yetkin virüsü (trVLPs) bize güvenle Ebola virüsü bileşenleri üzerinde sadece güvenerek, biyogüvenlik düzeyi altında 2 koşullarını birden fazla bulaşıcı döngüleri modellemek için olanak sağlayan bir yaşam döngüsü modelleme sistemi temsil eder.
Abstract
Ebola virüsleri% 90 gibi yüksek bir vaka ölüm oranı ile, insan ve insan olmayan primatlar üzerinde yürütülen ciddi hemorajik ateş oluşturabilirler. İşte bu virüslerin neden olduğu hastalık için onaylı aşılar ya da belirli tedaviler etmiş ve bu virüsler üzerinde araştırma sınırlama, biyo-güvenlik seviyesine 4 laboratuarlar sınırlıdır bulaşıcı Ebola virüsleri ile çalışır. Ömrü modelleme sistemleri modeli biyogüvenlik düzeyi 2 şartlar altında virüsü yaşam döngüsü; Ancak, yakın zamana kadar bu tür sistemleri virüs yaşam döngüsünün bireysel yönleri, ya da tek bir bulaşıcı dongusune sınırlı olmuştur. Morfogenezindeki yer Tetracistronic Ebola virüsü, kodlayıcı olmayan bölgeleri de, bir raportör genin oluşan minigenomlar, ve üç Ebola virüsü geni, tomurcuklanma, ve giriş (VP40, GP 1,2 ve VP24), replikasyon ve transkripsiyon üretmek için kullanılabilir Bu mini genomlar içeren -competent virüs benzeri partiküller (trVLPs). Bu hücreler, sürekli trVLPs Ebola ifade bulaşabilirbize güvenle biyogüvenlik düzeyi 2 şartlar altında birden fazla bulaşıcı döngüleri modellemek için izin genom replikasyonu ve transkripsiyonu, sorumlu virüs proteinleri. Önemli olarak, bu sistemlerin, viral bileşenler sadece (olduğu halde, örneğin, psödotipli virüslerin kullanıldığı sistemlerde durumda) ve VP40, GP 1,2 ve VP24 bu sistemde aşın olmayan diğer virüsler Ebola virüsünden elde edilen ve değildir , morfogenetiğine okuyan bu genom replikasyonu ve transkripsiyonu gibi virüs yaşam döngüsünün diğer yönleri de bu sistem ile modellenmiştir olmasına rağmen, tomurcuklanan ve giriş için ideal çözüm adrestir. Bu nedenle, tetracistronic trVLP tahlil Ebola virüsünün için mevcut en kapsamlı yaşam döngüsü modelleme sistemi temsil eder ve gelecekte Ebola virüsünün biyolojisini araştıran kullanılmak için muazzam potansiyele sahiptir. Burada, bu sistemin kullanımı hakkında ayrıntılı bilgilerin yanı sıra beklenen sonuçları sağlar.
Introduction
Ebola virüsü, insan mihrakları 1 varan% 90 vaka ölüm oranları ile insan ve insan olmayan primatlarda ciddi hemorajik ateş etkeni vardır. (2,3 gözden) aşıları yanı sıra özel tedaviler geliştirmede son yıllarda önemli ilerlemeler olmuştur da, bu insan kullanımı için onaylanmış değildir. Ebola virüsü parçacıkları yaklaşık 1 um arasında bir uzunluğa sahip olan bir karakteristik iplik benzeri bir görünüm ve 96-98 mil 4 arasında bir çapa sahiptir. Bir nükleokapsid formları viral partiküllerin çekirdek ile 7 genleri kodlayan ebolavirus 1), bölünmemiş tek bükümlü negatif sens RNA genomu, (Şekil 1) genomu encapsidates, 2) nükleoprotein NP, 3 oluşmaktadır ) polimeraz L ve kofaktörü oluşan VP35 viral polimeraz kompleksi ve 4) bir transkripsiyonel aktivatör VP30. Buna ek olarak, son zamanlarda VP24 protein de nükleokapsid ile ilişkili olduğu gösterilmiştirs 4. Nükleokapsid morfolojilerinden ve virionlar tomurcuklanması sorumlu olan matris proteini VP40, bulunduğu matris boşluk ile çevrelenmiştir. Virüs partikülleri ayrıca saran, ve virion bağlanması ve girişinden sorumlu olan tek yüzey proteini GP 1,2, bu zarfın içinde gömülüdür.
Bulaşıcı Ebola virüs ile çalışmak dünyada birkaç tesislerine bu işi kısıtlar biyogüvenlik düzeyi (BGS) 4 koşullar altında maksimum kapsama laboratuvarda yapılmalıdır. Bu virüslerin biyolojisi veya BSL2 koşullar altında, yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi için, araştırmacılar, Ebola virüsü proteinlerinin rekombinant aşırı ekspresyonu üzerinde, ya bel, veya enfeksiyöz Ebola virüsü yokluğunda çalışılabilir, her ikisi de modelleme sistemlerinin ömrü hakkında. Ebola virüsü proteinlerinin rekombinant ekspresyonu ya da sentezleme plasmidleri ya da viral vektörler den elde edilir. Bu stratejinin bir özel durumdurEbola virüsünün başka virüslere dayanan virionlann veya virüs benzeri parçacıkların üretimi (genellikle retrovirüs veya vesiküler stomatit virüsü) rekombinant mevcudiyetinde incelemek için kullanılabilir psödotipli partiküllerin üretilmesinde yol açan, GP 1,2 belirtilmiştir giriş inhibitörleri için 5 filovilSüsler ve ekran girişi proses. Seçenek olarak, kendi glikoproteinin yerine Ebola virüsü GP 1,2 kodlayan rekombinant virüsler (örneğin, veziküler stomatit virüsü) üretilir ve biyo-güvenlik seviyesi 2 koşullar altında 6 virüs girişi incelemek için kullanılabilir.
Ömrü modelleme sistemlerinin ilk cDNA üretilir ve daha sonra çoğaltılmış ve trans sağlanan Ebola virüsü proteinleri tarafından transkribe edilmektedir kesildi Ebola virüsü genomu analogları (minigenomlar) kullanılmasını içeren ters genetik sistemler biçimleridir. Ebola virüsü için ilk Minigenom sistemi fazla 15 yıl önce 7 geliştirildiVe o zamandan beri Ebola virüsü genom kopyelenmesi ve transkripsiyonu (8,9 gözden) etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bu sistemde, Ebola virüsü genomunun uç kodlayıcı olmayan bölgeleri ile komşu olan bir tek bir raportör geninin oluşan bir monosistronik minigenom (T7 RNA polimerazı kullanılarak genellikle transkripsiyonu ile), memeli hücrelerinde ifade edilir (Şekil 1) (lider fragman olarak da adlandırılır) birlikte viral proteinlere L VP35, VP30 ve NP ile. Minigenom NP ile enkapside ve sonra çoğaltılır ve virüs ömrü (Şekil 2) bu iki yönlerini yansıtan muhabiri aktivitesine yol açan, lider ve römork lokalize sis etkili sinyallerini kullanarak diğer nucleocapsid proteinler tarafından transkripsiyonu.
Klasik Minigenom sistemlerine dayanan virüs benzeri partikül (trVLP) sistemleri geliştirilmiştir viral yaşam döngüsü, transkripsiyon ve replikasyon-yetkin, ek adımlar modellemek, ancak bir özellik içinekspresyon plazmidleri 10,11 diğerine VP24 viral proteinlere, VP40 ve GP'nin 1,2 dditional ifadesi. VP40 varlığı yüzeyleri GP 1,2 ayı trVLPs oluşumuna yol açar, ve içinde bir minigenom içeren nükleokapsid taşırlar. Bu trVLPs saf hedef hücreleri trVLPs 11 içinde hedef hücrelere getirilen minigenomlarının replikasyon ve transkripsiyon kolaylaştırmak için ya da L, VP35, VP30 ve NP ifade plazmidleri ile pretransfected olan hedef hücrelerini, hastalık bulaştırmak için kullanılmıştır, ya da (mesela Ebola virüsü proteinlerinin plazmid tahrikli ekspresyonunun) 10 yoktur. Bu üretici hücreler, ve morfojenezinin trVLPs tomurcuklanması, hedef hücrelere kendi girişinde minigenomlarının replikasyonunu yansıtan hedef hücrelerinde raportör etkinliğindeki yol açar ve genelde 1) pretransfected hedef hücrelerin durumunda da çoğaltma transkripsiyonu ve ikincil (genom Viral proteinlerin ürünü ile, yani transkripsiyonuced) hedef hücrelerde hedef hücrelerde, ya da 2) saf da hedef hücrelerin trVLPs olan hedef hücrelere getiren viral proteinlere) (Şekil 3) ile primer transkripsiyon (örneğin, transkripsiyon durumunda. Bu proteinler genom replikasyonu güçlü negatif regülatörleri olduğu gösterilmiştir beri Önemli bir şekilde, bu sistemler sadece tek bir enfeksiyon modeli döngüsü ve VP24 ve VP40 durumunda özellikle sorunlu olarak bütün viral proteinleri aşırı ifadesi dayanmak için kullanılmıştır ve transkripsiyon plazmidlerden 12,13 den aşırı zaman. Ayrıca, bu sistemler içerisinde üretilmiş olan trVLP preparasyonlar bulaşıcı trVLPs 14 biyokimyasal analizi için zorluklar, bulaşıcı olmayan parçacıkların yüksek bir oranda içerir.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, son zamanlarda bir raportör genine ek olarak, aynı zamanda VP40, GP ve 1,2 kodlayan genleri içeren bir tetracistronic minigenom sistemi geliştirilmiştirVP24 (Şekil 1). Klasik monosistronik minigenom sistemine benzer şekilde, bu sistem (Şekil 4) 15 hedef hücreleri enfekte edebilir trVLPs üretimine yol açar. Fakat klasik minigenom sisteminin tersine, VP40, GP 1,2 ve VP24 oldukça plazmidlerden aşırı eksprese edilmiş viral genomun daha sonra transkripsiyon üretilmektedir. Bunun bir sonucu olarak, bu proteinlerin kinetik ve ekspresyon düzeylerinin çok daha yakından viral yaşam döngüsü sırasında bulunan taklit eden ve sonuç olarak bulaşıcı olmayan trVLPs bulaşıcı oranı bu sistem 15 ile ilgili olarak 500-kat artmıştır. Bundan başka, bu sistem kullanılarak sürekli olarak pasaj tetracistronic minigenom içeren trVLPs, birden fazla bulaşıcı döngüleri modelleme mümkün olmuştur. Gibi, tetracistronic trVLPs anda BSL2 koşullar altında Ebola virüsü biyolojisi okumak için kullanılabilir en kapsamlı yaşam döngüsü modelleme sistemidir. Burada, biz kullanımı o hakkında ayrıntılı bilgi vermekBu sistem f yanı sıra beklenen sonuçları.
Protocol
TrVLPs Başlangıç Üretiminde Üretici Hücreleri 1. Yarma
- % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin ve 1x pen / strep ile yüksek glikoz Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 şişe (75 cm olarak 293 hücre kültüre% 80-90 ortak akışlı ikinci DMEM10 orta çıkarın ). Hücreleri çıkarmak için dikkatli olmak, 10 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kere yıkayın hücrelerin ve hücreler 2 mi tripsin-EDTA ekleyin.
- Mikroskop (yaklaşık 30 saniye) altında gözlendiğinde hücreleri belirgin bir yuvarlama gösterene kadar oda sıcaklığında hücreleri inkübe edin. Balon dokunarak hücreleri çıkarmak, ve 8 ml DMEM10 ekleyin. İyice hafifçe pipetleme hücreleri tekrar süspansiyon ve aşağı mikroskop altında bakıldığında, tek bir hücre süspansiyonu gözlenene kadar.
- Bir otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. DMEM10 ml başına 2 x 10 5 hücre hücreleri seyreltin. Pipet, göz başına 6 oyuklu plakalar (4 x 10 içine hücre süspansiyonu 2 miOyuk başına 5 hücreleri) içerir.
- % 5 CO2 ile 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edin.
TrVLPs Başlangıç Üretiminde Üretici Hücreleri 2. Transfeksiyonu
- 24 saat hücreleri (deney zamanlama genel bir bakış için bkz Şekil 5) ayrıldıktan sonra, pipet plazmid DNA 15 süzüldü ipuçlarını kullanarak kriyotüpe steril 2 ml (tutarlar için bakınız Tablo 1). DNA, oyuk başına 100 ul OptiMEM ekleyin. Kısaca vorteks karışımı ve yavaşça bir mikrofuge'de kullanarak tüpleri aşağı doğru döndürün. Birkaç kuyu aynı plazmid ile transfekte edilmesi, bir kaç kuyu Master karışım yapılabilir.
- Kısaca, kullanımdan önce transit LT1 ile şişeyi vorteks. İnceltilmiş DNA'dan için yuva başına 7.5 ul transit LT1 ekleyin. Yavaşça dondurarak saklama viali kapağındaki sıvıyı toplamak için özen vorteks karışımı, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- Yavaşça transfeksiyondan karıştırınbir şekilde pipetli yukan aşağı çekilerek kompleksi. Damla damla her bir oyuğa transfeksiyon komplekslerinden 100 ul ilave edin. Ileri / geri plaka kaya ve yan transfeksiyon kompleksleri dağılması için yana. Bu gibi plakayı girdap etmeyin transfeksiyon kompleksleri yayılmasını düzensiz neden olacaktır.
- Inkübatör hücreleri dönün.
- 24 saat sonra hücreler supernatant çıkarın. % 5 FBS, 2 mM L-glutamin, hücrelere 1x pen / strep (DMEM5) ile 4 mL DMEM ilave edin. Bu adım, çapraz kirlenme bir sorun haline gelebilir oyuklar nedeniyle bu sistemde trVLPs öz amplifiye yapısı nedeniyle, aksi halde (aynı örnekler içerir varsayarak, kuyuların kurutulmadan bir anda en fazla 3 kuyuları için yapılabilir ve Bu adımı) bir seferde bir kuyu yapılmalıdır.
- Inkübatör hücreleri dönün.
Hedef Hücreler 3. hazırlanması
- Bir oyuk başına 2 ml'lik DMEM10 4 x 10 5 hücre tohumlama, bölüm 1 de tarif edildiği gibi 293 hücreleri bölme6-yuvalı plaka.
- Hedef hücrelerin ayrıldıktan sonra, 24 saat ve 24 saat enfeksiyondan önce, DNA kullanılarak bölüm 2'de tarif edildiği gibi, hedef hücrelerin transfeksiyonu Tablo 1'de miktarları ve oyuk başına 4.5 ul transit LT1.
Üretici hücrelerin hedef hücrelerin ve Hasat 4. Enfeksiyon
- 15 ml'lik tüplere üretici hücrelerden süpernatantlar aktarın. Çıkarın ve bir vakum hortumu kullanarak kalan süpernatant atın. Hücrelere 250 ul lizis tamponu Glo ekleyin.
- 800 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yüzey maddesi hücre artıklarının örnekleri temizleyin.
- Hedef hücrelerin bir kuyusundan süpernatantı. Dikkatle yavaş pipet hızını kullanarak hücreleri hedef temizlenir üretici hücre yüzer 3 ml ekleyin. Hücre tek katmanının kesintiye uğratmamak amacıyla, hücrelerin doğrudan pipetleme kaçının. Bu adım, bir seferde bir iyi yapılması gerekmektedir.
- Tüm örnekler trans olmuştur zamantercih sebebidir, hedef hücrelerin trVLPs çökelmesine izin vermek için ve enfeksiyonu inkübatör hedef hücreleri döndürür.
- Glo liziz tamponu içinde, oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkadan sonra, 150 ul için ayarlanmış bir mikropipet ile liziz tamponunda yeniden süspanse üretici hücreler, dondurarak saklamaya uygun vialler ile, 2 ml numuneyi aktarın. Bölüm 6'da tarif edildiği gibi, bu noktada, lizatları, -80 ° C'de donduruldu ya da doğrudan ölçülebilir.
- Enfeksiyondan sonra 24 saat, hedef hücrelerden süpernatant çıkarın. Hücrelere 4 mi DMEM5 oyuk başına ekleyin. Bu adım, oyuklar nedeniyle bu sistemde trVLPs öz amplifiye doğasına diğer açılardan aynı olan örnekleri (bulundurup, çapraz kirlenme bir sorun haline gelebilir, bir seferde en fazla üç kuyu için de yapılabilir, ve bu basamak olmalıdır Bir seferde bir aferin).
Tek Döngüsü Enfeksiyonu Hedef Hücreler 5. Hasat
- Eğer sadece tek bir bulaşıcı enfeksiyon döngüsü kaldır t sonra 72 saatte, değerlendirilmelidirO bir vakum hortumu kullanılarak hedef hücrelerden elde edilen üst sıvı.
- Üretici hücrelerin için bölüm 4'te tarif edildiği gibi 250 ul liziz tamponu Glo hücreleri hasat edilir.
6. Hasat Hedef Hücreler ve trVLPs Sürekli Pasajlanması
- TrVLPs sürekli olarak pasajlanmışlardır edilecek ise bunlar hedef hücrelerde (bakınız Şekil 5) ilk seti enfeksiyonu sonrası enfeksiyon 72 saat için hazır olacak şekilde bölüm 3'de tarif edildiği gibi, hedef hücrelerin yeni bir dizi hazırlayın.
- (Üretici hücrelerin yerine hedef hücrelerin ilk kümesi kullanılarak) bölümü 4'te tarif edildiği gibi, hedef hücrelerin yeni bir dizi Infect.
- Bu adımları her 72 saat tekrarlayın.
Muhabir Faaliyet 7. Analiz
- Hücre lizatları, donduruldu ise, oda sıcaklığında onları eritin. Numuneler ölçüm öncesinde oda sıcaklığına ulaşana emin olun.
- Renilla Glo deney tamponu (ideal olarak dondurulmuş i gerekli miktarda (numune başına 40 ul) çözülmeoda sıcaklığında, n alikotları). Tampon ölçümden önce oda sıcaklığına ulaştığını emin olun.
- Renilla Glo reaktifi elde etmek Renilla Glo deney tamponu ile Renilla Glo, substrat 1/100 inci hacim kazandırmak ve vorteks ile karıştırın. Pipet, beyaz bir 96 oyuklu bir plakaya Renilla Glo reaktifi 40 ul.
- Renilla-Glo ™ tepkin maddesi, numune 40 ul ekle. Daha sonra, 10 dakika bekle 1 saniyelik bir entegrasyon süresi ile bir luminometrede örnekleri ölçün.
Representative Results
Sentezleme plasmidleri Ebola virüsü nükleokapsid proteinleri NP VP35, VP30 ve L, 72 saat (Şekil 6 ile kolaylıkla algılanabilir bir tetracistronic minigenom ve minigenom replikasyon ve transkripsiyon ve raportör aktivitesinde aksesuar T7 polimerazı kodlayan sonuçlar ile 293 üretici hücrelerin transfeksiyonu ). Önemli bir şekilde, gözlemlenen raportör etkinliği (10 5.6, göreli ışık birimi (RLU)) aşan ekspresyon plazmid kodlayan M fazla 2 log transfeksiyon (10 3 RLU), ihmal edildiği bir negatif kontrolün. Hatta L yokluğunda gözlenen aktivitesinin düşük düzeyde bağlı minigenom plasmidi içindeki bir şifreli promotöre olasılığı daha yüksektir. Üretici hücreleri ile karşılaştırıldığında üretici hücrelerin süpernatanından trVLPs ile enfekte olmuş hedef hücreleri aslında biraz raportör etkinliği seviyelerini artış göstermektedir ve geçiş değerleri bağlı olarak, 10 ve 10 6 7 RLU arasında olması. Buna karşılık, BL kontrol üretici hücrelerin yüzer hedef hücreler üzerinde pasajlama konumdayken (L dahil olmak üzere, tüm nükleokapsid proteini ifade eden), raportör etkinliği luminometrede (yaklaşık 10 2 RLU), bir arka plan gürültü aşmaz.
Tetracistronic trVLP deney Ebola virüsünün yaşam döngüsünü incelemek için kullanılabilir. Örneğin, trVLPs 293 hücre enfeksiyonu, bu hücrelerde, trans sağlanacak sahip olacak Tim-1 16 gibi ek faktörler varlığında bağlıdır. Sonuç olarak, bir tetracistronic trVLP tahlilinde yaklaşık 100 misli arasında, hedef hücrelerinde raportör etkinliğindeki bir damla Tim-1 (Şekil 7A) yokluğunda görülmektedir. Virüs yaşam döngüsünün belirli (viral veya hücresel) proteinlerin rolü de, bu yaklaşım ile birlikte RNAi teknolojisi kullanılarak değerlendirilebilir. Bir örnek olarak, L rol yansıtan, yaklaşık 100-kat raportör aktivitesinde bir düşüş aşağı regülasyonu L sonuç RNAi aracılıreplikasyon ve transkripsiyon (Şekil 7B) 7. Ayrıca, doğrudan virüs yaşam döngüsünün mutasyonların etkisini değerlendirmek için minigenomunun işlemek mümkündür. Minigenom gelen VP24-sentezleme başlangıç kodonunun hemen aşağı 3 kodonlan sokulmasıyla kapatıldığında Örnek olarak, üretici hücrelerin raportör etkinliği önemli ölçüde değişmez; Bununla birlikte, hedef hücrelerde reporter aktivitesini bulaşıcı trVLPs (Şekil 7C) 15 üretiminde VP24 bir rol oynadığını gösteren, tek bir geçiş ve iki-geçiş sonrası 400 kat sonra yaklaşık 20-kat azaltılır.
Ebola virüsü genomunun gibi monosistronik ve tetracistronic minigenomlarının Şekil 1. yapısı. Ebola virüsü protein için kodlama bölgeleri olan NP (kırmızı olarak gösterilirVP35, VP30 ve L), sarı (VP40 ve VP24) veya mavi (GP 1,2) kutuları. Kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCRs) gösterildiği lider fragman bölümleri ile, yeşil gösterilmiştir. Viral NCR simge kodlama bölümlerinin birleştirilmesi için kullanıldı gösterir. Muhabir (REP) için kodlama bölgesi mor gösterilmiştir.
Şekil 2. Minigenom Monosistronik deneyi. Hücreler Ebola virüsü nükleokapsid protein için ifade vektörleri (NP, VP35, VP30, L), monosistronik minigenom (mg) ve T7 polimeraz ile transfekte edilir. Minigenom sonra bunun NP, (b) ile kapsül içine viral genom (vRNA) ile aynı yönde bir unencapsidated minigenom RNA ve T7 polimeraz, (a) ile transkribe olmaktadır. Bu vRNA tamamlayıcı bir minigenom RNA ile çoğaltılır kapsül içine (cRNA) ara maddeGözenekli (c) ve daha sonra raportör protein (e) 'çevrilir raportör mRNA (D) içine ters transkribe edilmiştir.
Bir monosistronik minigenom Şekil 3. trVLP deneyi. Hücreler minigenom deney bileşenleri için ifade vektörleri (Ebola virüsü nükleokapsid proteinleri NP VP35, VP30, L, bir monosistronik minigenom ve T7 polimeraz) ve VP40 GP 1 ile transfekte edilir , 2 ve VP24. Bu minigenom içeren nucleocapsids (f) içermektedir trVLPs oluşumuna yol açar. Her iki raportör ifadesi (e) veya naif neden replikasyon ve ikincil transkripsiyon (d) 'de elde edilen, NP, VP35, VP30 ve L (en üst) için ifade vektörleri ile pretransfected daha sonra, hedef hücreleri enfekte edebilir Bu trVLPs (g) min birincil transkripsiyonu ile sonuçlanan, hedef hücreler (alt),igenomes (h) da raportör ifadesi (e) yol açar.
Şekil tetracistronic bir minigenom 4. trVLP deneyi. Hücreler Ebola virüsü nükleokapsid protein için ifade vektörleri (NP, VP35, VP30, L), tetracistronic minigenom (mg) ve T7 polimeraz ile transfekte edilir. Başlangıç transkripsiyon (a) enkapsidasyon, (b), genom replikasyonu (c) ve transkripsiyon (d) yanı sıra için (e) monosistronik minigenom deneyinde olarak ortaya çıkar. Bununla beraber, mRNA raportör ek olarak, mRNA'lar VP40 için, GP 1,2 ve VP24 de trVLPs oluşumu ile sonuçlanır tetracistronic minigenom transkribe (f). Bu trVLPs nükleokapsid proteinleri NP VP35, VP30 ve L, hem de hücresel Ebola virüsü için ifade vektörleri ile pretransfected olan hedef hücrelerini enfektebağlanma faktörü Tim-1, yeni hedef hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir trVLPs genom replikasyon ve transkripsiyon ve miktarda ortaya çıkar.
3 ardışık pasaj için tetracistronic trVLP deneyinin Şekil 5. zamanlaması. Hücreler ve trVLPs (h), (i), orta değişimi (c) ve hasadı (ler) tohum hücreleri transfekte hücreler (t) enfekte edilmesi için gündür Üç ardışık pasaj için endikedir (oklar ile belirtilen).
Bir tetracistronic trVLP deneyinde gözlemlenen raportör etkinliğinin Şekil 6. tipik seviyeleri. Bir tetracistronic trVLP deney protoc aşağıdaki 5 geçirme zarfında gerçekleştirilmiştirol bu yazının sıraladı. Negatif bir kontrol olarak sentezleme plasmidi şifreleyen L P0 üretici hücrelerin transfeksiyon (L) çıkartılmıştır. P5 luminometre arka plan gürültüsü de kesikli bir hat olarak gösterilmiştir L. dahil olmak üzere tüm nükleokapsid proteini için ekspresyon plazmidi ile transfekte edilmiştir kanallardan Hedef hücreler p1. Araçlar ve 3 bağımsız deneyler 4 biyolojik çoğaltır standart sapmaları gösterilmiştir.
Tetracistronic trVLPs kullanarak viral yaşam döngüsü üzerinde çeşitli viral ve hücresel faktörlerin etkisinin değerlendirilmesi Şekil 7.. Tim-1 bir bağlantı unsuru olarak (A) '. Tet ile enfekte olmuş nükleokapsid proteinleri ile ya da (15 tarif edilmiştir) Tim-1 için kodlama olmadan plazmid kodlayan ifade plazmidleri pretransfected edilmiştir Hedef hücrelerracistronic trVLPs. P1 hedef hücrelerde 72 saat sonrası enfeksiyon raportör etkinliği belirlendi. Araçlar ve 4 bağımsız deneyin 4 biyolojik çoğaltır standart sapmaları. (B) Etki genom replikasyonu ve transkripsiyona L RNAi Nakavt gösterilmiştir. Karşı nükleokapsid bileşenler için ekspresyon plazmidleri ile pretransfected edilmiş hedef hücreler Tim-1 ve miRNA'ların L (anti-L) ya da (15 tarif edilmiştir) ilgisiz bir protein (anti-GFP) tetracistronic trVLPs ile enfekte edilmiştir. P1 hedef hücrelerde 72 saat sonrası enfeksiyon raportör etkinliği belirlendi. Ve 2 numaralı bağımsız deneyden 5 biyolojik çoğaltır standart sapmalar gösterilmektedir. (C) Etki mutasyonlar trVLP enfeksiyon ile ilgili olarak minigenom. Bir tetracistronic trVLP tahlil, bir vahşi tip minigenomunun (4-sis-WT) ya da bir ya minigenomunun kullanılarak gerçekleştirilmiştir 3 bitiş kodonu ifade o kaldırılması, VP24 başlangıç kodonundan hemen sonra devreye soktuğuf bu proteinin ama p0, p1 ve p2 vb uzunluğu, nükleik asit kompozisyonu, ikincil yapıların Muhabir aktivite açısından Minigenom için sadece minimal değişiklikler getiren transfeksiyon / enfeksiyondan sonra 72 saat ölçüldü. Araçlar ve 3 bağımsız deneyler 3 biyolojik çoğaltır standart sapmaları gösterilmiştir.
| Yapımcı Hücreler (p0) | Hedef Hücreler (p1 ve üstü) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1.000 | 1.000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-tim1 | - | 250 |
Tablo 1. DNA, transfeksiyonu için öngörülmektedir. Üretici ve hedef hücrelerin transfeksiyonu için gerekli olan her bir plazmid miktarı, 6-çukurlu levha başına ng gösterilmiştir. Bütün plasmidler Watt ve ark 15 tarif edilmiştir.
Discussion
Bu yazıda anlatılan tetracistronic trVLP tahlil çeşitli bulaşıcı döngü üzerinde Ebola virüsü yaşam döngüsünün modelleme sağlar. Daha da önemlisi, bu sistemde üretilen trVLPs birlikte Ebola virüsü genomunun yaklaşık% 60'ını oluşturan ve viral replikasyon için gerekli olan nükleokapsid proteinleri NP VP35, VP30 ve L için genetik bilgi içermez. Daha ziyade, bu proteinleri ifade plazmidleri trans hedef hücrelerde temin edilmesi gerekmektedir, ve bu proteinlerin her 4 ifade eden hücrelerin herhangi bir enfeksiyon başarısız olduğunu. Daha da önemlisi, filovilSüsler genetik rekombinasyon hiçbir kanıt yoktur ve tetracistronic minigenom ile nükleokapsid protein için ifade plazmidleri arasında paylaşılan herhangi bir homolog bölgeler vardır. Bu nedenle, herhangi bir pratik kanıt ne de sonra potansiyel neden olabilir üreten tam boy Ebola virüsü genomları imkanı sağlayacak herhangi bir teorik temeli ne varBSL2 koşullarda kullanım için bu sistem güvenli hale bulaşıcı Ebola virüsünün üretimi,.
Iki kritik trVLPs üretimi, yani, deneysel koşullar etkilenmektedir tetracistronic trVLP deneyinde adımları ve bu trVLPs ile hedef hücrelerin enfeksiyonu vardır. TrVLPs üretimi sırayla yüksek bir transfeksiyon etkinliği bağlıdır minigenom replikasyon ve transkripsiyon, yüksek seviyelerde bağlıdır. Transfeksiyon etkinliği kolayca L sentezleme plasmidi eGFP kodlayan bir ifade plazmidi ile değiştirilir edildiği bir L kontrol de dahil olmak üzere değerlendirilebilir. Bu koşullar altında Transfeksivon oyu bir floresan mikroskop 24 saat sonrası transfeksiyonuna muayene ile% 50 aşmalıdır. Ayrıca, hücreler önemli ölçüde Minigenom çoğaltma ve transkripsiyon (yayınlanmamış veri) bozar bizim deneyim mikoplazma kontaminasyonu beri, mikoplazma özgür olmak zorunda. Nedeniyle yüksek transfectability 293 ce içinrf trVLP deneyleri için tercih edilen bir hücre hattı; Bununla birlikte, bu hücreler, Ebola virüsü enfeksiyonuna 16 (tamamen refraktif olmasa da) göreceli olarak zayıf hassastır. Bu Tim-1 gibi bir bağlanma faktörünün ekspresyonu trVLPs 293 hücreleri, yaklaşık 100-kat arasında bir enfeksiyon geliştirir ve birkaç geçirme zarfında bu sistemin başarısı için çok önemlidir.
Tetracistronic trVLPs kendi kendini kopyalayan değildir, bunlar nükleokapsid proteinleri ifade eden hücrelerin kendi kendini kopyalayan. Bunun gibi, tedbirler (minigenom farklı mutasyon ile, örneğin,) farklı trVLPs içeren tüpler arasındaki çapraz kontaminasyonu önlemek için yapılmalıdır. Bir daha teknik açıdan nedeniyle bu deneyde (yaklaşık 4 günlükleri) pozitif ve negatif sinyaller arasındaki büyük fark, numuneler arasındaki çapraz konuşma bir sorun olabilir lusiferaz aktivitesi ölçümü yapıldığı zaman; Bununla birlikte, bu film kolaylıkla her numune arasında bir boş kuyu bırakılarak önlenebilirLusiferaz aktivitesini ölçmek için kullanılan 96-yuvalı plakası.
Tetracistronic trVLPs için olası uygulamalar çok sayıda bulunmaktadır. Bulaşıcı trVLPs bulaşıcı filovilSüsler 14 tipik iplik benzeri bir yapıya sahiptir ve filovirus parçacıklarla aynı viral bileşenleri ihtiva açıkça, onlar filovirus partiküllerin girişini eğitimi için uygundur. Olduğu gibi psödotipli viryonların veya bu gibi GP 1,2 sentezleyen rekombinant vesiküler stomatit virüsü gibi retrovirüs; GP 1,2 taşıyan parçacıklarının, veya rekombinant virüsleri gibi virüs benzeri partiküller kullanıldığında da önemlisi, diğer virüslerin bileşenler içermez . Ek faktörler için duyulan gereklilik, bu sistemde, hedef hücreler olarak 293 hücreleri kullanılarak, elenmesi için kullanılabilir ve bu tür bağlanma faktörleri rolünü araştırmak edilebilir ise Bu gibi genom replikasyon ve transkripsiyon dahil olanlar gibi diğer hücresel faktörlere roller, morfolojilerinden ve tomurcukding, RNAi teknolojisi kullanılarak incelenebilir. Bir VP40, GP 1,2 ve VP24 viral kopyalama süre sonra eksprese edilir akılda tutmak için olmasına rağmen, virüs yaşam döngüsünün viral proteinlerin mutasyonların etki, incelenebilir, diğer viral proteinlerin ekspresyonu ekspresyonundan elde edilir plazmidler, böylece nedeniyle bu proteinlerin aşırı ekspresyonuna bağlı olarak etkileri de göz önüne alınması gerekir. Ayrıca, bakım raportör faaliyeti doğrudan minigenom uzunluğu 15 etkilenir, çünkü, minigenom mutasyonlar da önemlisi, minigenom uzunluğunu değiştirmeyen dikkat edilmelidir. Tetracistronic minigenomlar viral genleri taşıyan ve viral polimeraz kompleksi tarafından çoğaltılan Virüs genomu, analogları, çünkü Son olarak, bu aynı zamanda BSL2 koşulları altında mutasyon yanıt olarak bu genlerin gelişiminin araştırılması mümkün olmalıdır. Hala daha ileri çalışmalar bu yönde gerekli olan Böylece, mümkün olmalıdır, örneğin, uygun olmayan tanıtmakMinigenom ve ardından geçit trVLPs içindeki gen mutasyonları ücretsiz mutasyonlar ortaya çıkana kadar.
Göz önünde bulundurulması gereken önemli bir tetracistronic trVLP tahlilin bir sınırlaması model virüs yaşam döngüsünün en hedef hücrelerde birincil hedef hücreler transkripsiyon trans olarak nükleokapsid proteinleri ifade etmek için yüksek olduğundan, bu sistem ile model alınmaz ise gerçeğidir trVLPs çoğaltmak için sırayla. Primer transkripsiyon değerlendirilmelidir, bu hedef hücreleri naif 10 kullanmak mümkündür; Bununla birlikte, bu durumda, hiçbir genom replikasyonu, hedef hücrelerde yer alır ve başka enfeksiyon trVLPs enfeksiyon iptal üretilir. Bu fiili enfeksiyöz rekombinant Ebola virüsünün bunları açacak Minigenom içine nükleokapsiti proteinlerin genleri dahil ederek, tamamen kendini kopyalayan trVLPs render olmadan üstesinden edilemez temel bir sorundur. Aslında, Ebolluciferase veya başka bir muhabir oluşturulan ve değerlendirme ve genom kopyelenmesi ve transkripsiyonu 17,18 incelemek için kullanılabilir ifade eden bir virüs; Bununla birlikte, bunların kullanımı BSL4 laboratuarlar ile sınırlıdır. Ayrıca, VP40, GP 1,2 ve VP24 ise, bir viral genom analogdan minigenom konumlarını ifade akılda tutulmalıdır (2., 3., ve 4. transkripsiyonel ünite) için aynı değildir birbirine göre olan mutlak ekspresyon seviyelerine, aynı zamanda bunların nispi temsil seviyelerini etkileyebilir, virüs genomu içinde konumları (3., 4., 6. ve transkripsiyonel ünite),.
Genel olarak, tetracistronic trVLP tahlil tarihi mevcut Ebola virüs için en kapsamlı yaşam döngüsü modelleme sistemini temsil ve eki ve en yanı sıra, genom replikasyonu ve transkripsiyonu, partikül morfogenezi ve tomurcuklanma modelleme sağlarbirden fazla bulaşıcı döngüleri üzerinde hedef hücrelere deneyin. Bu nedenle, bu koşullar altında BSL2 Ebola virüsünün biyolojisi araştırırken kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), anlatıcı olarak görev yanı sıra, Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) ve Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) için çok minnettarız Bu yazının eşlik film yapmak onların yardımı ile. Ayrıca, biz yazının eleştirel okuma Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma NIH, NIAID İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
