말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
과 아노 펠 레스 gambiae 종 단지는 아프리카에서 모기를 전송하는 주요 말라리아가 포함되어 있습니다. 이들 종은 의료 중요하기 때문에, 여러 가지 특성은 전형적 역학 연구에 도움 분자 분석법을 이용하여 특성화된다. 이러한 특성은 종 식별, 살충제 저항, 기생충 감염 상태, 호스트 환경 설정을 포함한다. 과 아노 펠 레스 gambiae 복합체의 형태 학적 집단 구별하기 때문에, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 전통적 종을 식별하는 데 사용된다. 종이 알려지면, 여러 하위 분석은 정기적으로 추가 특성을 규명하기 위해 수행된다. 예를 들어, 파라 유전자 KDR이라고도 돌연변이는 DDT 및 피레스 로이드 계 살충제에 대해 내성을 부여. 또한, 효소 면역 분석법 (ELISA를) 또는 변형체 기생충 DNA 검출 PCR 분석법 모기 조직 기생충 존재를 검출하기 위해 사용된다. 마지막으로, combinatioPCR과 제한 효소 다이제스트의 N은 호스트 별 DNA의 모기 bloodmeal을 선별하여 호스트 환경 설정 (예를 들어, 동물의 혈액 대 인간) 규명하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 96 시간에 384 샘플에 대해 단일 멀티 플렉스 반응 유전자형 33SNPs으로 상기 분석을 모두 겸비한 다중 검출법 (MDA)을 개발 하였다. MDA 종, 말라리아 검출 및 호스트 혈액 식별을위한 여러 마커를 포함하기 때문에, 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 생성하는 가능성은 크게 특성 당 하나의 마커를 포함 이전 분석에서 감소한다. 이 강력하고 간단한 분석은 비용 효율적으로 기존 분석의 시간의 틈새에서 이러한 주요 모기의 특성을 감지 할 수 있습니다.
서론
학질 모기의 arabiensis, 학질 모기의 coluzzii 아노 펠 레스 gambiae 아프리카 1 말라리아 전송을 담당하는 주요 벡터입니다. 이 세 종은 형태 학적으로 2 구별 만 분자 분석 3-9으로 구별 할 수있다. 또한, 정기적으로 역학 및 인구 유전학 연구를 지원하기 위해 실시 많은 다운 스트림 분석이있다. 이들은 분화 섬 10-12 (1) 유전자형 분석, (2) 아미노산 코돈 파라 유전자의 위치 번째 1014 비 동의어 SNP를 인식 유전자형 분석 (녹다운 저항 또는 KDR, SNP) (13)를 포함 -18, (3) 기생충 검출 PCR 19-23, 모기 midguts 24, 25에서 호스트 별 DNA (4) 검사.
우리의 목표와 하나의 멀티 플렉스 반응으로 모든 분석을 결합한 다중 탐지 분석 (MDA)을 개발아프리카에서 말라리아 벡터의 역학적으로 중요한 특성을 alyzing. MDA 분석 여러 (1) 종을 검출하기위한 마커 (A.의 arabiensis, A.의 gambiae, A.....
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프로토콜
1. PCR 증폭
- 1.5 ㎖ 마이크로 튜브의 모든 PCR 프라이머를 (보충 테이블 S1 참조) 섞는다. 각각의 SNP는 두 개의 프라이머 (순방향 및 역방향)가 있습니다. 각 PCR 프라이머의 주식 농도를 100 μM로 유지되어 있는지 확인합니다. (보충 표 S2 참조) 벤치에서 오류와 시간을 피펫 팅 줄이기 위해 500 ~ 1,000 반응에 대한 충분한 프라이머 믹스를 확인합니다. 원하는 경우, -20 ° C에서 튜브 및 상점 당 100 ~ 200 반응의 분량을 준비합니다.
- 제조 업체의 프로토콜 (표 1)에 설명 된대로 PCR 칵테일을 준비합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다. 소용돌이 2,000 x g에서 30 초간 가볍게 PCR의 칵테일을 함유하는 원심 분리기 튜브.
- 각각의 우물에 PCR 칵테일 3 μl를 96 웰 플레이트에 분주 비 스커트. 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다.
- 각 웰에 모기의 적절한 게놈 DNA의 2 μl를 추가합니다.
주 : m으로부터 게놈 DNA를 얻는 공정 osquito 조직 (머리 / 흉부, 복부 또는 전신)는 다른 문헌 29 ~ 32에 설명되어 있습니다. (머리 / 흉부에 말라리아를)
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결과
종 식별 :
샘플이 세 종 중 하나가 아닌 경우 다음과 같은 5 개의 SNP 함께. 세 가지의 SNP (01073-213, 04679-157과 10,313 세 종 (A.의 arabiensis, A.의 coluzzii와 A.의 gambiae) (표 4)를 식별 -052)는 증폭 실패합니다.
살충제 저항을 추론하기위한 KDR 유전자형 :
파라 전압 관문 나트륨 채널의 1014 번째 코돈 KDR에 대응한다. 1014 번째 코돈의 2 차 및 3 차베이스에 두 개의 SNP는 세 가지 아미노산을 결정합니다. . 유전자형의 가능한 조합은 표 5에 나와있는.......
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토론
- 비행 (MALDI-TOF) 질량 분석 33-37 시간 PCR 증폭, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP) 반응, SNP 확장, 확장 제품 에어컨, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 : MDA는 5 개의 주요 단계로 구성되어있다. 첫 번째 PCR 증폭 단계는 충분한 주형 DNA가 SNP 확장 단계에서 사용할 수 있도록 각각의 SNP를 측면에서는 DNA를 증폭한다. SAP 반응은 다음과 SNP 확장 단계를 방해 할 수있는 사용하지 않은 dNTPs를 중화. SNP 확장은 SNP의 궤적과 대량 수정 터미네이터 뉴클레오티드 당 하나의 확장 프라이머를 포함한다. 3'- 말단이 변형 된 뉴클레오티드 프라이머 확장에 혼입되는 것을 방지 후속 뉴클레오티드. 따라서, 단일 염기의 질량은 해당 SNP의 유전자형을 나타낸다.
이 접근법의 성공을 보장하는 가장 중요한 단계는 대상 생물체의 존재 다형성 좋은 데이터 세트를 구비한다의. 우리는 종 식별 (N> 9.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 박사 감사합니다. 탄자니아에서 모기 표본을 제공 글래스고 대학의 UC 데이비스 박사 카타리나 Kreppel에서 앤서니 코르 넬과 로라 노리스. 우리는 잠비아에서 모기 샘플을 공유하기 위해 공중 보건의 존스 홉킨스 대학원에서 양 Smita 다스 박사 더글러스 노리스 감사합니다. 우리는 또한 분석 디자인 교육에 대한 동물 유전학 연구소 이씨 V. 밀론 감사합니다. 이 작품은 R01AI 078183과 R21AI062929을 부여 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MassARRAY 분석기 Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF 핵산 분석을 위한 게놈 응용 분야용 질량 분석법. |
| MassARRAY 나노 디스펜서 | Sequenom | RS1000 | 으로 완성된 iPLEX 반응 생성물을 전송합니다 |
| . |
참고문헌
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....
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재인쇄 및 허가
