Abstract
A capacidade das células malignas para evadir o sistema imune, caracterizado por escape do tumor a partir de ambas as respostas imunes inatas e adaptativas, é agora aceite como uma característica importante do cancro. Nossa pesquisa sobre câncer de mama centra-se no papel ativo que os linfócitos tumor infiltrando desempenhar na progressão do tumor e evolução de pacientes. Com esse objetivo, foi desenvolvida uma metodologia para o rápido isolamento de células linfóides intactas de tecidos normais e anormais em um esforço para avaliá-los próximo ao seu estado natal. Homogeneizados preparados utilizando um show Dissociator mecânica tanto maior recuperação e viabilidade celular, preservando a expressão do receptor de superfície em comparação tecidos para enzima-digerida. Além disso, a digestão enzimática do material insolúvel restante não recuperou células adicionais CD45 +, indicando que as medidas quantitativas e qualitativas no homogeneizado primária provável genuinamente refletem infiltrando as subpopulações no fragm tecidoent. As células linfóides em homogenatos estes podem ser facilmente caracterizadas utilizando imunológica (fenótipo, proliferação, etc.) ou molecular (DNA, RNA e / ou proteína) se aproxima. As células CD45 + pode também ser utilizado para a purificação subpopulação, expansão in vitro ou de criopreservação. Um benefício adicional desta abordagem é que o sobrenadante de tecido primário a partir dos homogeneizados podem ser utilizados para caracterizar e comparar as citocinas, quimiocinas e imunoglobulinas, antigénios presentes em tecidos normais e malignos. Este funções de protocolo extremamente bem para tecidos mamários humanos e deve ser aplicável a uma grande variedade de tecidos normais e anormais.
Protocol
NOTA: Todos os espécimes foram adquiridos através de um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Instituto Jules Bordet com consentimento informado por escrito obtido de cada paciente.
1. Preparação do homogenato de tecido
- Dissecar tecidos ressecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para a coleta imediata. Tumor, NANT (tomado a maior distância possível do tumor) e fragmentos de tecidos normais são rotineiramente processados dentro de 1-3 horas de excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 utilizando procedimentos de biossegurança padrão para os tecidos humanos. Um diagrama de fluxo do protocolo é ilustrada na Figura 1.
- Pesar todos os fragmentos de tecido (normal, NANT e tumorais) e medir o comprimento, largura e altura (comprimento x largura x altura). Este é um passo importante para a posterior normalização de subpopulações de células, RNA extraído, etc.
NOTE: A gama de tamanho da amostra é de 100 a 10.000 mm3, sem gordura, se possível. - Imprimir o fragmento de tumor numa lâmina de vidro para H & E coloração para verificar se o tecido é realmente parte do tumor.
- Faça isso pressionando uma lâmina de microscópio de vidro sobre o fragmento de tumor e aplicar uma leve pressão com os dedos por alguns segundos.
- Corrigir o diapositivo com isopropanol durante 2 min, seguido por um passo de lavagem em água. Contracorante o tecido durante 30 segundos com hematoxilina de Mayer.
- Lave o slide em seis banhos de água. Mancha em Floxina B 2% por 15 segundos.
- Lave em um banho de água, seguido de quatro banhos de isopropanol e terminar com um banho de água.
- Incubar em isopropanol, durante 1 min e de drenagem. Limpar em dois banhos de xileno.
- Montar com meio de montagem com base xileno. Examinar para a celularidade do tumor (Figura 2).
NOTA: Principalmente, as células tumorais ficar com o slide impressa - o estroma, linfóide ou adipose células permanecem raramente, deixando espaços entre as células de tumor (Figura 2).
- Inserir o fragmento de tecido em um pequeno prato de cultura contendo 1 mL de o, meio de células hematopoiéticas isento de soro quimicamente definido (daqui em diante referido como meio) à temperatura ambiente e corte em pedaços pequenos (~ 1 - 2 mm 2), utilizando um filtro estéril bisturi.
- Transfira tudo (fragmentos de tecido + média) para um tubo de Dissociator C mecânica.
- Lavar a placa de Petri e bisturi com 2 ml de meio com uma pipeta de Pasteur e adicionar este ao tubo C (volume de meio de dissociação = 3 ml).
- Use a A.01 programa Dissociator mecânica para tubos C (o programa mais suave) para homogeneizar os fragmentos de tecido em uma suspensão de células individuais. Colocar o tubo C no aparelho e executa o programa de duas vezes em sucessão (um ciclo = 25 seg).
NOTA: Este procedimento homogeneização foi estabelecido e validado para o tecido mamário humano, outro tumou ou tecido tipos pode precisar usar um programa diferente e deve ser testado pela primeira vez. - Remover o tubo C do aparelho e decanta-se o homogeneizado directamente para um filtro de células de 40 mm assentado em um tubo de 50 ml. Usando a mesma pipeta de Pasteur, como na etapa 1.6, transferir qualquer líquido remanescente no tubo C para o coador de células.
- Transferir o líquido filtrado para um tubo de 15 ml utilizando uma ponta de micropipeta 1 ml. Temporariamente manter o filtro de células e o seu tubo de 50 ml.
- Lavar o tubo C com um adicional de 3 ml de meio e transferir este, de novo usando a mesma pipeta de Pasteur, como na etapa 1.6, para o filtro de células ainda sentado no tubo de 50 ml. Esprema um montante máximo do líquido residual preso no tecido unhomogenized para dentro do tubo de 50 ml, movendo-a suavemente ao redor do filtro com uma pipeta Pasteur limpa ou 1 ml dica que é posteriormente jogado fora para evitar a contaminação do fluido.
- Coloque o filtro de células de cabeça para baixo em tele tubo original C e enxagua-se com 3 ml de meio de modo que o tecido unhomogenized cai de volta para dentro do tubo C.
- Re-homogeneizar como no passo 1.7 para dois ciclos do programa A.01.
- Coloque esta segunda homogenato através do filtro de células sentado no tubo de 50 mL, enxaguar o tubo C de novo com 3 mL de meio (tal como no passo 1.10) e de transferência com a pipeta de Pasteur para o coador de células sentado no tubo de 50 ml novo apertando um máximo quantidade de líquido a partir do tecido conjuntivo residual preso no filtro celular.
- Neste ponto, um volume de ~ 2,5 ml é no tubo de 15 ml e ~ 9 ml no tubo de 50 ml.
2. Separação do sobrenadante de células e tecidos
- Centrifugar os homogeneizados em 15 mL e tubos de 50 ml durante 15 minutos a 600 xg à temperatura ambiente.
- Decantar o SN do tubo de 15 ml para um tubo limpo e armazenar temporariamente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primário, NANT ou ti normaisssue SN (volume final de 2,5 ml) é posteriormente clarificada e aliquotadas antes do armazenamento a -80 ° C para futuras análises (ver abaixo).
- Descartar o sobrenadante do tubo de 50 ml.
- Suavemente ressuspender ambos os peletes de células, num volume final de 1 ml de meio. Resumidamente, em primeiro lugar quebrar suavemente o sedimento de células em ambos os tubos (tocando o tubo sobre uma superfície dura). Ressuspender o sedimento de células soltas no 50 ml com 500 ul de meio e transferir esta suspensão celular para o tubo de 15 ml para ressuspender o sedimento de segundo. Repetir esta etapa uma vez com o segundo 500 ul de meio para a recuperação máxima de células.
- Transferir 10 uL da suspensão de células para um pequeno tubo, misturar com 10 ul de azul de tripano (diluição 1: 1) e contar o número de células viáveis utilizando um hemocitómetro.
NOTA: Neste ponto, uma fracção da suspensão de células podem também ser analisados por citometria de fluxo para avaliar o tamanho das células, granularidade e se desejado um número limitado de marcadores de subpopulação para mais precise avaliação da distribuição de célula relativa no homogeneizado antes da análise extensiva ou experimentação. Todas as análises por citometria de fluxo incorporar rotulagem CD45 para normalizar as subpopulações. - Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. As células do tumor, NANT, ou tecido normal são agora pronta para purificação adicional ou análise. Estes passos adicionais são melhor quando realizada no mesmo dia que a cirurgia.
NOTA: Para a análise de citometria de fluxo, mas não de separação de células dos glóbulos vermelhos residuais devem ser lisadas após marcação com anticorpos pela adição de 0,4 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos para a pelete de células, imediatamente vortex durante 1 seg e incubar um mínimo de 10 min a sala temperatura (protegido da luz), antes da análise.
3. Clarificação do sobrenadante Tissue
- Centrifugar os tubos de 1,5 ml com SN tecido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Retire com cuidado tele sobrenadante sem tocar ou perturbar o sedimento. Transferir para um tubo limpo (ou tubos), dependendo do número e volume de alíquotas desejados.
- Armazenar o sobrenadante a -80 ° C para uso futuro.
4. O sangue do paciente
- Recolher uma amostra de sangue de cada paciente como um controlo por venipunctura para dentro de tubos heparinizados o dia antes da cirurgia. Centrifuga-se o sangue a 400 xg durante 10 min a 20 ºC, com o travão para se obter o plasma e um creme leucocitário.
- Remover o plasma e esclarecer-o por centrifugação a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alíquotas e armazenamento de plasma a -80 ° C para uso futuro. Diluir o creme leucocitário em meio
- Separam-se as células mononucleares utilizando centrifugação em gradiente de padrão de Ficoll-Hypaque antes da análise imediata, isolamento subpopulação, / ARN de extracção de ADN / proteína ou de criopreservação.
5. Citometria de Fluxo
- Células etiqueta de acordo com a produçãoinstruções de r, a 4 ° C, protegidos da luz. Lisar as células vermelhas do sangue em suspensões de células a partir de fragmentos de tecido após a marcação de anticorpos por adição de 0,4 ml de tampão de lise de células para a pelete de células.
- Vortex imediatamente por 1 segundo e incubar um mínimo de 10 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Passe as células marcadas em um citômetro de fluxo para aquisição de dados, sem lavar.
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Representative Results
A digestão enzimática de fragmentos de tecido, quer com soluções comercialmente disponíveis de dissociação de tecido ou várias misturas de laboratório de colagenase, ADNase e / ou inibidores de hialuronidase, clivar uma grande variedade de receptores na superfície das células. Os nossos estudos, inicialmente centrado sobre as células T CD4 + que infiltram os tumores de mama, foram rapidamente apresentados com um grande problema técnico, devido à clivagem dos receptores de CD4 de superfície utilizando protocolos de digestão enzimática padrão de 4-8. Foi testada uma variedade de enzimas colagenase, com ou sem ADNase e inibidores de hialuronidase, encontrando que colagenase I e II completamente removidos CD4 da superfície da célula, apesar de alta viabilidade dos linfócitos (Figura 3A). Um efeito moderado em CD4 foi observada com colagenase IV em curtos intervalos de tempo de incubação (1 - 2 h) com marcação com anticorpos CD4 inferior detectados no nódulo linfático digerido e tecido de tumor em comparação com sangue não digerido e medula óssea do mesmo paciente (Figura 3B; note que, devido a limitações no tecido que recebemos não fomos capazes de comparar linfonodo digerida e não digerido e tecido tumoral). Esta perda de CD4 foi confirmado ser um subproduto técnica de digestão de colagenase IV, comparando as células T CD4 + não digeridos e digeridos isoladas a partir de sangue de dadores saudáveis (dados não apresentados). Embora estas células CD4 eis T podem ser isoladas a partir de fragmentos de tecido digerido colagenase-IV usando esferas magnéticas, as populações purificadas contêm frequentemente quantidades variáveis de contaminação por outras células do microambiente do tumor e, assim, foram sub-óptima para os nossos fins experimentais.
Em uma busca contínua para uma melhor abordagem, em 2008, testou um novo Dissociator mecânica sem o uso de enzimas. Este aparelho produzido homogeneizados de tecidos da mama de forma rápida e com integridade receptor de superfície mantida 9. Representante citometria de fluxo de gráficos de pontos do tumor homogeneizados célula follodissociação asa e marcação com anticorpos específicos contra células epiteliais (EpCAM) e leucócitos (CD45) são mostrados na Figura 3C. Estas imagens são observações de rotina típicas para homogeneizados de tumor de mama. Este protocolo não modifica significativamente a viabilidade das células CD45 + (4% de células mortas); no entanto, há uma perda considerável de células viáveis EpCAM + (38% de células mortas no tumor mostradas; varia entre tumores). Apesar desta perda, o CD45 + subconjuntos viável EpCAM + e podem ser segregadas com base no tamanho e estrutura-se em grandes células epiteliais (= células de tumor), as células epiteliais e células CD45 + de grandes e pequenas células CD45 + (maioria das células , que são principalmente linfócitos; Figura 3C).
O aumento significativo em células viáveis CD45 + obtidos utilizando esta abordagem permite a aquisição de multicolor reprodutível citometria de fluxo de dados (usandoaté dez cores) para caracterizar mais detalhadamente os subconjuntos TIL no câncer de mama. Citometria de fluxo representativas gráficos de pontos de TIL os subconjuntos principais são mostrados na Figura 4, com as nossas experiências recentes demonstra que também é possível detectar e quantificar pequenas células T e B subconjuntos infiltrantes do tumor 10-12, incluindo coloração intracelular para T e canónica Factores de transcrição de células B 12. Gating estratégias para linfócitos são baseados em células CD45 + viáveis identificados com uma mancha de viabilidade (nota:. Os tumores podem variar grandemente na quantidade de restos celulares e células epiteliais mortas, dependendo do subtipo BC, categoria, etc.). Esta abordagem tem sido usada com êxito para purificar subpopulações de linfócitos a partir do homogenato com esferas magnéticas ou classificação celular para a análise da expressão de genes utilizando microarrays ou qRT-PCR 9. Mediadores solúveis na SN, incluindo citocinas e imunoglobulinas, foram quantificados utilizando um bead- imunoensaio baseado com os dados resultantes normalizados para o tamanho do fragmento de tecido. Uma comparação da expressão das citocinas (uma piscina de Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) ou imunoglobulinas totais (IgA, IgE, IgG, IgM) em BC com SN SN a partir de tecido da mama normal, revela um aumento em ambos associados com o tecido do tumor (Figura 5). Estes SN de tecido primário foram também analisados eficazmente para os antigénios 12/10 e usadas para tratar experimentalmente linfócitos a partir de dadores saudáveis, reproduzindo assim o fenótipo TIL em células normais 9.
Figura fluxograma 1. Protocolo. Nosso procedimento para o processamento de tecidos humanos frescas e algumas abordagens analíticas que podem posteriormente ser utilizados para avaliar os linfócitos infiltram os tecidos humanos são mostrados.
Figura 2. H & E manchada imagem de uma impressão de tecido do tumor de mama. Esta impressão, feita a partir de um fragmento de tecido fresco tumor de mama, mostra a presença de células tumorais com os espaços abertos que refletem as áreas que não foram transferidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3. Optimização de dissociação de tecido mamário para análise de linfócitos por citometria de fluxo de análise: (A) expressão de CD4 na superfície de linfócitos não digerido e colagenase I / II digerido tecido de tumor; (B) a expressão CD4 em linfócitos de linfonodo e tecido digerido sagacidade tumorh colagenase IV e em comparação com sangue e da medula óssea as células não digeridas a partir do mesmo paciente; e (C) análise de leucócitos totais (CD45 +) e células epiteliais (EpCAM) + de tecido de tumor rapidamente dissociados mecanicamente utilizando o protocolo aqui descrito. A viabilidade das células epiteliais e células CD45 + usando nosso protocolo é avaliada através da incorporação de corante de viabilidade solucionáveis. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Tumor subpopulações de linfócitos infiltrando-se no homogeneizado. Multicolorido análise de citometria de fluxo foi realizada no dia da cirurgia, após a dissociação mecânica utilizando o protocolo aqui descrito. O células viáveis e as principais subpopulações de linfócitos umre mostrado: CD3 é um marcador de células T pan, CD4 e CD8 são os principais marcadores subconjunto de células T e CD19 é um marcador de células pan B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. mediadores solúveis no sobrenadante. Um painel de citocinas (Th1 / Th2 / Th7 / Th9 / Th17) e imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) foram avaliadas utilizando imunoensaios baseadas em esferas para analisar SN derivado normal e aC tecidos utilizando o protocolo aqui descrito.
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Discussion
Este estudo descreve um método otimizado para o preparo rápido de homogeneizados normais e malignas do tecido mamário, sem digestão enzimática para classificação subseqüente celular, extração, criopreservação e / ou análise fenotípica de CD45 + subpopulações. O objetivo dessa abordagem experimental é produzir imagens da TIL que refletem de perto seu estado in vivo e compará-los aos tecidos normais com mínima manipulação dos tecidos frescos da sala de cirurgia. Até o momento, o nosso laboratório tem usado este protocolo para analisar> 250 aC tecidos frescos (tumor e NANT),> 35 tecidos normais da mama, de reduções mamárias. Em princípio, este protocolo deve ser diretamente aplicável a outros tipos de tumor ou de tecido; No entanto, alguns optimização pode ser necessário (isto é, o programa de dissociação mecânica, número de ciclos, volume de suporte, etc). Para tecidos com baixa infiltração de linfócitos, utilizando um fragmento de tecido maior pode ser necessAry, que é o que fazemos para os tecidos normais, onde a contagem de linfócitos é baixa. Alternativamente, um passo de centrifugação em gradiente de densidade podem ser adicionados para enriquecer a suspensão de leucócitos. Esta análise de T e B subpopulações de células que infiltram os tumores de mama humanos inclui uma avaliação de> 100 marcadores, por citometria de fluxo (citometria de fluxo de dados 74 para os marcadores estão disponíveis nos dados complementares de Gu-Trantien, et 9 al.) E purificação de linfócitos específicos subpopulações para análises imunológicas e moleculares subsequentes. Além disso, nós avaliamos citocinas, quimiocinas, imunoglobulinas e antigénios tumorais no tumor primário SN (em comparação com NANT e SN tecido normal) 10,11 como uma reflexão destes mediadores moleculares no microambiente tumoral. Nós também testaram o efeito de tratamento de linfócitos do sangue periférico de doadores saudáveis com SN de tumor e demonstrou que muitas das alterações de expressão de genes detectados no TIL pode ser reproduzida especificamente <sup> 9.
Em seu microambiente, as células tumorais e do estroma são mais bem realizada na matriz de tecido do que as células imunes, que são caracteristicamente migratório. O método descrito aqui fornece um meio simples e rápido para isolar e analisar TIL sem digestão enzimática. Nossos inúmeras tentativas para se juntar esta abordagem homogeneização mecânica com uma digestão enzimática curto para produzir células viáveis e receptor linfóides positiva e epiteliais do mesmo fragmento de tumor têm sido infrutíferos. Homogeneização Tissue libera eficiente linfócitos mas resulta em uma perda significativa de viabilidade das células do tumor. A digestão enzimática curto do tecido liberta células tumorais viáveis totais (o número aumenta como uma função do tempo de digestão), mas tem a consequência de uma diminuição paralela na expressão de muitos receptores de superfície, particularmente aparentes em linfócitos. Assim, para a análise comparativa das células tumorais e a partir da mesma TIL tumou ainda é necessário para processar separadamente dois fragmentos tumorais seqüenciais.
Atualmente, a maioria dos estudos concebidos para caracterizar TIL empregaram digestão enzimática (horas a O / N) com freqüência, juntamente com algum tipo de dissecção mecânica 4-8. Expansão da TIL para posterior análise ou terapia envolve geralmente a subsequente ex vivo cultivo de TIL ou fragmentos de tecido do tumor com agentes estimuladores (dias a semanas) 13-15. O método rápido, não enzimática para a dissociação de tecidos aqui descrito fornece um meio simples e reprodutível para a extracção de células CD45 + intacto a partir de fragmentos de tecidos normais e anormais, antes da sua expansão ou análise. Esta aquisição rápida de células CD45 + a partir de pacientes submetidos a exérese poderia ser desenvolvido para utilização num ensaio de biomarcador prognóstico. Além disso, pode produzir TIL com maior potencial para a expansão ex vivo antes da adoptivas immunotherapy.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações fromthe Fundo Belga de Pesquisa Científica (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-operação Télévie, Câncer da Bélgica Plan, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson e Fonds Barsy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
| Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
| Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
| Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
| Bürker Chamber | Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer |
| Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0510 | or standard single use sterile scalpel |
| BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
| BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
| Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
| Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
| Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | for flow cytometry experiments |
| Fixable viability Dye eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | for flow cytometry experiments |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | for flow cytometry experiments |
References
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